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Bioengineering

भूतल गाइडेंस और प्रकोष्ठों के Bioprinting के लिए स्वचालित रोबोट वितरण तकनीक

doi: 10.3791/54604 Published: November 18, 2016

Abstract

यह पांडुलिपि सेल मार्गदर्शन सुविधाओं प्रत्यक्ष एक स्वचालित रोबोट वितरण प्रणाली का उपयोग करते हुए एक हाइड्रोजेल bioink में इन सुविधाओं के लिए कोशिकाओं की डिलीवरी के बाद की शुरूआत का वर्णन है। विशेष bioink चयनित किया गया था के रूप में यह कोशिकाओं की ओर तलछट और सुविधाओं को महसूस करने की अनुमति देता है। वितरण प्रणाली एक backpressure सहायता प्रिंट सिर का उपयोग कर हाइड्रोजेल bioinks में व्यवहार्य कोशिकाओं bioprints। हालांकि, एक तेज लेखनी या छुरी के साथ प्रिंट सिर की जगह से, वितरण प्रणाली को भी सतह नक़्क़ाशी के माध्यम से स्थलाकृतिक संकेतों बनाने के लिए नियोजित किया जा सकता है। लेखनी आंदोलन एक्स, वाई में 10 माइक्रोन के कदम और जेड दिशाओं में प्रोग्राम किया जा सकता है। नमूनों खांचे mesenchymal स्टेम सेल बोध कराता है, उन्हें प्रभावित खांचे 'दिशा के साथ संरेखण में एक लम्बी आकृति विज्ञान को अपनाने के लिए सक्षम थे। patterning सीधे लाइनों, गाढ़ा हलकों, और sinusoidal लहरों में साजिश रचने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया जा सकता है। बाद में एक प्रक्रिया है, fibro मेंविस्फोटों और mesenchymal स्टेम सेल, एक 2% जिलेटिन bioink में निलंबित कर दिया गया एक backpressure संचालित बाहर निकालना printhead में bioprinting के लिए। सेल असर bioink तो एचिंग के लिए इस्तेमाल एक ही प्रोग्राम किया निर्देशांक का उपयोग कर मुद्रित किया गया था। bioprinted कोशिकाओं के रूप में भावना और नक्काशी खांचे की दिशा के साथ उनकी लम्बी उन्मुखीकरण के द्वारा प्रदर्शन किया नक्काशी सुविधाओं के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम थे।

Introduction

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सेल प्लेसमेंट की जानबूझकर patterning संस्कृतियों है कि इन विवो सेलुलर संगठन 1 में नकल के गठन के लिए सक्षम बनाता है। दरअसल, अनेक प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत में अनुसंधान उनके स्थानिक प्लेसमेंट के 2,3 के आयोजन द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है। अधिकांश patterning सिस्टम को बढ़ावा देने या बाद में निष्क्रिय सेल बयान के साथ सेल आसंजन को रोकने के लिए सतह संशोधन प्रक्रियाओं पर भरोसा करते हैं। Bioprinting सेल वितरण पर 1 स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्रदान करता है। इन कार्यों के अलावा, bioprinting ज्यामितीय जटिल scaffolds 4 पैदा करने के लिए एक तकनीकी रूप से, सीधी तेजी से और लागत प्रभावी तरीका होने के रूप में वर्णित किया गया है। यह कंप्यूटर डिजाइन सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है और निर्माण की प्रक्रिया 4 में कोशिकाओं की शुरूआत की अनुमति देता है।

इंकजेट के आधार पर या बाहर निकालना आधारित 4 Bioprinting सिस्टम दिया आधारित लेजर के रूप में अपने काम के सिद्धांतों के आधार पर वर्गीकृत किया है। बाहर निकालना bioprinting सबसे होनहार के रूप में वर्णित किया गया है क्योंकि यह एक यथार्थवादी समय सीमा के भीतर 4-6 चिकित्सकीय प्रासंगिक आकार के संगठित निर्माणों के निर्माण की अनुमति देता है। यह एक सेल असर हाइड्रोजेल bioink के यांत्रिक या वापस दबाव सहायता प्रदान की बाहर निकालना या तो द्वारा किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत विधि में, वापस दबाव कार्यरत था। के रूप में उल्लेख किया है, कोशिकाओं को एक cytocompatible bioink में वितरित कर रहे हैं। इस तरह की एक bioink हानिकारक कतरनी तनाव के बिना उत्पादन कोशिकाओं के वितरण का समर्थन है, और गिर सकती हैं या फैल रहा है 7-10 ( "के रूप में स्याही खून" कहा जाता है) के बिना, मुद्रित ट्रेस की अखंडता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चिपचिपाहट का होना चाहिए।

उनकी पक्षपाती सतह के साथ कोशिकाओं की बातचीत सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है। सतह स्थलाकृति सेल आकार, अभिविन्यास 11, और यहां तक कि phenotype नियंत्रित कर सकते हैं। विशेष रूप से, खांचे और चैनलों के निर्माण के लिए प्रेरित करने का प्रदर्शन किया गया हैएक बढ़ाया, अनेक प्रकार की कोशिकाओं पर लम्बी आकृति विज्ञान। इस आकृति विज्ञान के गोद लेने multipotent और pluripotent कोशिकाओं के phenotype प्रभावित करने के लिए पाया गया है। उदाहरण के लिए, जब खांचे पर गठबंधन, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) cardiomyocytes 12,13 और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रति भेदभाव के सबूत दिखाने सिंथेटिक 10,14-17 खत्म सिकुड़ा phenotype अपनाने।

सेल चैनल या खांचे संरेखित तरीकों में से एक नंबर के माध्यम से एक बहुलक सतह पर उत्पन्न किया जा सकता है, उदाहरण, गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी, प्रत्यक्ष लेजर मुद्रण, लेजर femtosecond, photolithography और प्लाज्मा सूखी नक़्क़ाशी 18 के लिए। इन तरीकों, अक्सर समय लेने वाली हैं जटिल तंत्र की आवश्यकता होती है और उत्पन्न पैटर्न के आकार में सीमित किया जा सकता है। इसके अलावा, वे bioprinting साथ patterning सिंक्रनाइज़ नहीं है और तत्काल cellularization के लिए अनुमति नहीं है। एक स्वचालित के coordinately नियंत्रित आंदोलनवितरण प्रणाली समाधान के बयान के लिए जटिल पैटर्न का पालन कर सकते हैं। यहाँ हम कैसे microscale नियंत्रित आंदोलन सेल उन्मुखीकरण के लिए चैनल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। एक तेज लेखनी या छुरी बाहर निकालना सिरिंज के स्थान पर प्रिंट सिर से जुड़ा हुआ है और उपकरण तो साजिश रचने सॉफ्टवेयर के मार्गदर्शन में बहुलक सतह खोदना कर सकते हैं। विधि पैटर्न डिजाइन में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है और polymeric सामग्री आमतौर पर इस तरह polystyrene, PTFE, और पॉलिकैप्रोलैक्टोन के रूप में जैव अभियांत्रिकी में इस्तेमाल करने के लिए लागू है। नक़्क़ाशी के लिए बाद में एक कदम के रूप में, कोशिकाओं खरोंच खांचे को सीधे bioprinted जा सकता है। जिलेटिन bioink यहाँ उपयोग दोनों का पता लगाने को बनाए रखने और जमा कोशिकाओं नक्काशी सुविधाओं भावना के लिए अनुमति देने के लिए सक्षम था। Mesenchymal स्टेम सेल नक्काशी खांचे को bioprinted अलग लाइनों में उनके साथ बढ़ाना करने के लिए प्रदर्शन किया गया।

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Protocol

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नोट: इस प्रोटोकॉल एक के पीछे से दबाव सहायता प्रदान की रोबोटिक वितरण प्रणाली (चित्रा 1 ए) एक सतह नक़्क़ाशी (चित्रा 1 बी) और बाहर निकालना आधारित bioprinter (चित्रा 1 सी) के रूप में 10 के उपयोग का वर्णन।

1. एक polystyrene सतह का संशोधन

  1. 1 मिमी polystyrene शीट का उपयोग करें, क्योंकि polystyrene टिशू कल्चर प्लेटों केंद्र में ऊपर की तरफ धनुष, दोनों नक़्क़ाशी और मुद्रण की ऊंचाई स्थिरता को बर्बाद कर देते हैं।
    नोट: के रूप में polystyrene शीट कोशिका आसंजन के लिए संशोधित नहीं कर रहे हैं, प्लाज्मा उपचार किया जाता है।
  2. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार।
    1. सबसे पहले, ऑक्सीजन प्लाज्मा मशीन से जुड़ा सिलेंडर के रेगुलेटर पर 2 बार के दबाव का चयन करें। तो फिर और इनपुट मशीन के नियंत्रण कक्ष में निम्न शर्तों प्लाज्मा मशीन स्विच: 150 W, ऑक्सीजन के 30 SSCM, 10 मिनट (बिजली, गैस प्रवाह और समय के लिए क्रमशः)।
    2. polystyrene substrat रखेंप्लाज्मा चैम्बर में ई, दरवाजे सील और नियंत्रण कक्ष पर प्रारंभ बटन दबाएँ। भ्रूण गोजातीय सीरम में ऑक्सीजन प्लाज्मा इलाज polystyrene सब्सट्रेट लेना और तीन बार 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) धोने से पहले 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

2. प्रोग्रामिंग प्रिंट पैटर्न

  1. एक स्टाइलस या स्केलपेल के साथ सतह पहली खोदना करने के लिए कार्यक्रम का उपयोग करें।
    1. एक स्टाइलस का उपयोग कर, एक वितरण सिरिंज (5 या 10 मिलीलीटर) की नोक में (बड़ी सावधानी के साथ अंदर से) एक 1.5 मिमी व्यास कपड़ा सुई डालने जब तक यह अंकित और सुरक्षित हो जाता है। एक छुरी का उपयोग करते हैं, एक दौर संभाला छुरी का चयन इतना है कि यह मुद्रण बांह की दबाना तंत्र में बांधा जा सकता है।
      ध्यान दें: लेखनी घुमावदार पैटर्न स्केलपेल ब्लेड की तुलना में बेहतर etches।
    2. पहली बार एक bioprinted व्यवस्था बनाने के प्रयास में है, गिने कुल्हाड़ियों के साथ ग्राफ पेपर पर वांछित पैटर्न स्केच उत्पन्न करने के लिए XY निर्देशांक। तब मैंस्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (चित्रा 2) में etched / bioprinted पैटर्न के निर्देशांक Nput।
      नोट: "वांछित पैटर्न" इस तरह के रेखीय, एस के आकार का, या परिपत्र के रूप में कई आकार में हो सकता है। विकल्प के रूप में यहाँ का प्रदर्शन प्रयोगात्मक मॉडल ऐसे cardiomyocytes को MSCs के भेदभाव के लिए समानांतर रैखिक लाइनों के रूप में आवश्यक है, पर निर्भर करता है। बिखराव ग्राफ समारोह प्रस्तावित भूखंड पैटर्न के दृश्य के लिए अनुमति देता है।
    3. छापें / वितरण सॉफ्टवेयर खोलें। "कार्यक्रम> प्रोग्राम जोड़ें" का चयन करें द्वारा पीछा कार्यक्रम स्थापित करने के लिए "संपादित करें> प्वाइंट जोड़ें"। निर्यात एक्स और वाई प्रिंट में स्प्रेडशीट से प्राप्त मूल्यों का समन्वय / सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वितरण "कॉपी और पेस्ट" समारोह।
    4. आदेश की सतह पर लेखनी / प्रिंट नोक करने के लिए जगह में प्रत्येक रन से पहले रोबोट की "जेड" ऊंचाई जांचना।
      1. छापें / वितरण सॉफ्टवेयर में, "रोबोट" विकल्प का चयन करें, "पर बदलते मोड और क्लिक करें# 34; और "शिक्षण मोड" विकल्प को सक्षम। एक बार चयनित, सॉफ्टवेयर रोबोट की "जोग" समारोह में सक्षम बनाता है।
      2. सैर करने के लिए, पहली बार मेनू से निम्न आदेश का चयन करके उसके डिफ़ॉल्ट स्थिति के लिए रोबोट को प्रारंभ; "रोबोट> Meca प्रारंभ", फिर चुनें "रोबोट> जोग"। इनपुट "एक्स और वाई स्लॉट" पैटर्न के मूल पर बिल्कुल लेखनी जगह की आवश्यकता में संख्यात्मक मूल्य (मिमी में)।
      3. अगला, "जेड स्लॉट" में इनपुट एक संख्यात्मक मूल्य (मिमी में) सतह के साथ संपर्क में लेखनी या मुद्रण नोक जगह, लेकिन फ्लेक्स नहीं या सतह इंडेंट करने के लिए। इस बिंदु "जेड" शुरुआती मूल्य के रूप में नामित किया गया है।
        नोट: प्रत्येक नाली की गहराई प्रणाली के जेड ऊंचाई का उपयोग कर आसानी से अलग किया जा सकता है। 40, 80, और 170 माइक्रोन के खांचे 1 मिमी मोटी polystyrene शीट (चित्रा 4 और 1 टेबल) की सतह में कटौती करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं।
    5. पी का चयन करेंसमन्वय के बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए प्रिंट करें अनुदेश, यानी, "रेखा बग़ैर का प्रारंभ" पहला बिंदु और प्रिंट दीक्षा "रेखा गुजर" रोबोट के लिए संकेत करने के लिए समाप्त करने के लिए मध्यवर्ती अंक "रेखा बग़ैर का अंत" नामित करने के लिए और परिभाषित करने के लिए, प्रिंट रन।
    6. शीर्ष मेनू पट्टी से अनुवर्ती आदेशों का चयन करके रोबोट के लिए कार्यक्रम संवाद: "रोबोट> भेजें सी एंड टी डाटा"।
    7. नक़्क़ाशी / प्रिंट रन आरंभ, "भागो" मोड में रोबोट को बदलने की। चयन करके यह करो "रोबोट> मोड बदलते> चलाएँ मोड स्विच" शीर्ष मेनू पट्टी से।
    8. रोबोट की मशीन कंसोल पर हरे रंग की "प्रारंभ" बटन दबाकर मुद्रण प्रक्रिया शुरू करें।

3. तैयारी और मुद्रण के सेल युक्त जिलेटिन Bioink

  1. न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा मध्यम (αMEM) में 2% जिलेटिन भंग (10% FBS और 2% एंटीबायोटिक / antimycot के साथ पूरक2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर आईसी) bioink समाधान तैयार करने के लिए।
  2. प्री-संस्कृति लाल फ्लोरोसेंट 10 सेमी टिशू कल्चर αMEM / 10% FBS का उपयोग कर बर्तन में 70% संगम प्रोटीन mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को व्यक्त (आरएफपी MSCs)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मध्यम और 1x trypsin EDTA के समाधान के साथ कोटिंग को हटाने के द्वारा निलंबन में संलग्न कोशिकाओं रिलीज।
  3. 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 1x पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व गिनती।
  4. Bioink कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति के बाद, धीरे bioink में आरएफपी MSCs के निलंबन के लिए पर्याप्त मात्रा में मिश्रण 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं मिलीलीटर -1 के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
  5. नोजल सील के साथ एक प्रिंटिंग सिरिंज में सेल असर bioink डालो। आदेश में एक मुद्रण योग्य चिपचिपाहट को प्राप्त करने में 4 डिग्री सेल्सियस तक भरी हुई सिरिंज टेंशन मत लो।
  6. स्वचालित पर लोड सिरिंज रखेंरोबोटिक वितरण प्रणाली और हवा के दबाव लाइनों देते हैं। सिरिंज Luer मुहर निकालें और प्रिंट नोक देते हैं।
  7. पतली लाइनों 0.05 एमपीए वापस दबाव का उपयोग करने में cellularized bioinks बाहर निकालना, 5 मिमी में / एक 27 जी सुई / नोक के माध्यम से एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से सेकंड लिखने की गति एक polystyrene फिल्म सतह पर (बेलनाकार से अधिक की सिफारिश पतला), पूर्व क्रमादेशित बयान के बाद 2.1 चरण में वर्णित पैटर्न पूर्व नक्काशी खांचे पर cellularized bioink जगह है।
  8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखने से पहले 24 घंटा (कोशिकाओं भावना और नक्काशी सुविधाओं के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देने के लिए) के लिए 10 मिलीलीटर विकास मीडिया (10% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) जोड़ सकते हैं और सेते कोशिकाओं 10X बढ़ाई।

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Representative Results

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प्रतिनिधि परिणाम है कि backpressure सहायता प्रदान की रोबोटिक वितरण प्रणाली दोनों सतह नक़्क़ाशी और bioink मुद्रण (चित्रा 1 ए) के प्रदर्शन के लिए एक बाहर निकालना आधारित bioprinter के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शित करता है। यह बहुलक सतहों में etched खांचे की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बाद में सुविधाओं (चित्रा 1 बी और सी) के लिए सीधे एक सेल असर bioink मुद्रित करने के लिए।

दोनों नक़्क़ाशी और मुद्रण प्रोग्राम किया निर्देशांक द्वारा निर्धारित कर रहे हैं (चित्रा 2) प्रिंट / वितरण सॉफ्टवेयर है जो रेखीय के मुद्रण के लिए सक्षम बनाता में निवेश, घुमावदार और रेडियल पैटर्न के रूप में आवेदन (चित्रा 3 एसी) के लिए जरूरी है। जेड अक्ष सेटिंग्स नक्काशी नाली गहराई का नियंत्रण (चित्रा 4 और 1 टेबल) के लिए अनुमति देते हैं।

जगह के बादएक हाइड्रोजेल प्रिंट सिर के साथ लेखनी, प्रोग्रामिंग है कि नक़्क़ाशी समन्वित एक ही डिजाइन (चित्रा 3 डी और ई) के बाद नक्काशी खांचे को सीधे सेल असर bioink वितरित करने के लिए रोबोट वितरण प्रणाली को सक्षम करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 5 ए और बी में मनाया जा सकता है, स्टेम कोशिकाओं के भीतर bioink अंततः सतह के लिए तलछट bioprinting द्वारा वरीयता प्राप्त और भावना और असतत लाइनों के भीतर नक़्क़ाशी की दिशा के साथ बढ़ाना। कोशिकाओं सुविधाओं की दिशा में गठबंधन bioprinting बिना संस्कृति के माध्यम में वरीयता प्राप्त, तथापि, वे पूरी सतह (चित्रा 5 सी) को कवर किया, साबित करना है कि bioink मुद्रित पता लगाने के लिए कोशिकाओं constrains। नक्काशी सुविधाओं के बिना, संस्कृति मीडिया में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं कोई अभिविन्यास या संरेखण (चित्रा 5 डी) दिखा।

आकृति 1
figuफिर 1:। स्वचालित रोबोट वितरण प्रणाली (ए) तंत्र एक तेज लेखनी (एक सिरिंज में सुरक्षित) प्रिंट सिर कि एक polystyrene स्लाइड (बी) पर गाढ़ा छल्ले etches के लिए केंद्रीय के शामिल किए जाने के साथ अनुकूलित किया गया था। प्रिंट सिर तो साथ वापस दबाव पहले से etched पैटर्न (सी) पर बाहर निकालना, और जमा सहायता प्रदान की, सेल असर जिलेटिन bioink बाहर निकालना के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। यह आंकड़ा Bhuthalingam एट अल से संशोधित किया गया है। 2015 10।

चित्र 2
चित्रा 2: साजिश रचने XY एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में निर्देशांक स्क्रीन यहाँ दिखाया हड़पने यह दर्शाता है कि साजिश रची XY एक sinusoidal लहर पैटर्न के रूप में ग्राफ साजिश के द्वारा दिखाया बनाया निर्देशांक।। ये निर्देशांक कॉपी / पेस्ट का उपयोग कर साजिश रचने सॉफ्टवेयर में इनपुट थेसमारोह।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Etched पैटर्न बहुमुखी प्रतिभा निर्देशांक की साजिश रचने सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में रेखीय (ए), sinusoidal (बी) और गाढ़ा हलकों (सी) खोदना करने में सक्षम थे। खांचे polystyrene में etched सीधे बाद के चरण (डी) और (ई) के दौरान हाइड्रोजेल bioink के साथ पर मुद्रित किया जा सकता है। यह आंकड़ा से Bhuthalingam एट अल। 2015 10 संशोधित किया गया है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Etched नाली गहराई नक्काशी नाली की गहराई वितरण प्रणाली के Z अक्ष कंट्रोल से नियंत्रित किया जा सकता है। छवियाँ (क) से (ग) उपरि दृश्य दिखाने के और(डी) से (ई) क्रॉस सेक्शन दिखा। रोबोट () (बी और (ई)), 40 की गहराई ((ए) और (डी)), 90 और 180 माइक्रोन ((सी) और (एफ)) के लिए सतह खोदना करने के लिए प्रोग्राम किया गया था। प्रोग्राम किया गहराई और वास्तविक नक्काशी गहराई की निकटता तालिका 1 में प्रदर्शित किया जाता है। यह आंकड़ा से Bhuthalingam एट अल। 2015 10 संशोधित किया गया है।

चित्रा 5
चित्रा 5: Bioink Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को जन्म दिया के रूप में उनकी लम्बी आकृति विज्ञान और खांचे (ए) और (बी) के साथ संरेखण द्वारा प्रदर्शन आरएफपी MSCs नक्काशी पैटर्न पर bioink में मुद्रित सुविधाओं समझ सकता है पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की तुलना में। bioink बिना सुविधाओं (यानी, संस्कृति माध्यम में) (सी </ strong>) और (डी एक गैर नमूनों सतह पर)। यह आंकड़ा से Bhuthalingam एट अल। 2015 10 संशोधित किया गया है।

क्रमादेशित की गहराई (माइक्रोन) Etched नाली की गहराई (माइक्रोन)
40 35 ± 7
90 81 ± 6
180 175 ± 3

तालिका 1:।। बनाम polystyrene पर वास्तविक नक़्क़ाशी गहराई क्रमादेशित की तुलना इस आंकड़े से Bhuthalingam एट अल 2015 10 संशोधित किया गया है।

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Discussion

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इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम स्टेम कोशिकाओं के रूप में प्रक्रिया, सुविधाओं के लिए सेल अवसादन अनुमति / bioink प्रसार के बिना मुद्रित खून बह रहा कतरनी तनाव कोशिका मृत्यु बिना कोशिकाओं देने और अवांछित वंश के प्रति भेदभाव को गति प्रदान नहीं करना चाहिए की वास्तविक bioprinting प्रसव है।

उम्मीद सेल संरेखण घटित करने में विफल रहता है, तो bioink चिपचिपापन मुद्रण के लिए अपनी उपयुक्तता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि bioink कोशिकाओं के नमूनों बहुलक सतह के लिए तलछट के लिए अनुमति देता है। bioink बहुलक की एकाग्रता कम किया जा सकता है या उसके तापमान में वृद्धि हुई (37 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम करने के लिए), चिपचिपाहट कम करने और सेल अवसादन बढ़ावा देने के लिए। हालांकि, इन कटौती bioink / खून पद छपाई का प्रसार करने के कारण हो सकता है। यहाँ हम 2% जिलेटिन (w / v) 1x पीबीएस में भंग का उपयोग कर सुझाव देते हैं। सेल एकाग्रता बाद मुद्रण के लिए कम दिखाई देता है, तो कतरनी तनाव मुद्रण से प्रेरित हो सकता है समझौतामुद्रित कोशिकाओं 7 की व्यवहार्यता। पहले और ऐसे resazurin fluoresence 7 के सक्रियण के रूप में एक व्यवहार्यता परख का उपयोग मुद्रण के बाद bioink में कोशिकाओं की जाँच करें। इसके अलावा, यदि bioprinted स्टेम कोशिकाओं की सतह से संपर्क करें लेकिन संरेखित नहीं करते हैं, तो यह संभव है की कमी आई मुद्रण के दौरान कतरनी तनाव किसी अवांछित भेदभाव मार्ग ट्रिगर द्वारा उनकी multipotency। पोस्ट मुद्रण stemness ऐसी सीडी 29 10,19,20 के रूप में स्टेम सेल मार्कर का उपयोग प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यह पाया जाता है कि कतरनी तनाव कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव हो रही है, तो bioink मुद्रण चिपचिपाहट जोड़ने या इस तरह के alginate के रूप में एक कतरनी एक thinning, साथ bioink बहुलक की जगह से कम किया जा सकता है, Pluronic F127, hyaluronic एसिड, Gellan गम, जिलेटिन methacrylate या पॉलीथीन ऑक्साइड 19, 21-25।

अंत में, अन्य पहलुओं है कि अनुकूलित किया जा सकता प्रिंट backpressure, bioink सेल घनत्व में शामिल हैं,और नोजल व्यास। backpressure bioink की चिपचिपाहट के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है और एक असतत अटूट ट्रेस प्राप्त करने के लिए बदला जा सकता है। एक उच्च सेल एकाग्रता bioink चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए और प्रिंट सिर रोकना सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया को बाहर निकालना अन्य तरीकों bioprinting 26,27 की तुलना में अपेक्षाकृत उच्च सेल घनत्व की छपाई के लिए अनुमति नहीं है। प्रिंट नोक गेज के चयन के बाद से छोटे व्यास नलिका एक महीन ट्रेस उत्पादन हो सकता है, लेकिन clogging से ग्रस्त हो जाएगा पर विचार किया जाना चाहिए। पतला नलिका बेहतर ढंग से काम करने के बाद से ही प्रवाह की दर एक बेलनाकार नोक रूप में, लेकिन इसलिए सेल व्यवहार्यता 28 में सुधार के लिए एक कम कतरनी तनाव में प्राप्त किया जा सकता पाया गया है।

backpressure सहायता बयान विधि, भी न्यूनतम प्रोग्राम कदम लंबाई के कारण बाहर निकालना bioprinting के रूप में, इस तरह की स्याही जेट और लेजर सहायता प्रदान की पद्धति के रूप में अन्य सेल मुद्रण दृष्टिकोण से भी कम संकल्प किया है करने के लिए भेजा और Emerg के प्रसारbioink हैैं। हालांकि, backpressure बाहर निकालना उपकरण सबसे आसानी से एक नक़्क़ाशी लेखनी के शामिल किए जाने के लिए संशोधित किया गया है। PDMS ढलाई के द्वारा पीछा photolithography का उपयोग करते हुए इस तरह के सूक्ष्म patterning के रूप में उत्पादन खांचे के अन्य तरीकों रोबोट नक़्क़ाशी की तुलना में काफी अधिक कदम है और विधि मौजूदा पैटर्न को संशोधित करने या नए लोगों 12,15,29-31 उत्पादन में कम बहुमुखी है।

इस विधि सेल बातचीत जहां स्थिति, अभिविन्यास, और एक या एक से अधिक प्रकार की कोशिकाओं की व्यवस्था महत्वपूर्ण हैं की इन विट्रो अध्ययन के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। कई प्रकार की कोशिकाओं सहित mesenchymal स्टेम कोशिकाओं, fibroblasts, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की सतह के खांचे 1,10,14,18 पर तालमेल करने के लिए जाना जाता है। नक्काशी पैटर्न, यहाँ प्रस्तुत किया, संशोधित और बहुत जल्दी और आसानी के साथ reprinted जा सकता है। यह ब्याज के रूप में खांचे के साथ सतह patterning कोशिका आसंजन, आकृति विज्ञान, प्रवास के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है और सेल भेदभाव स्टेम है। इसके अलावा, मैंटी भी तंत्रिका और musculoskeletal ऊतक इंजीनियरिंग में 18, 32,33 के लिए लागू किया गया है। चूंकि खांचे सेल भेदभाव या कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए फेनोटाइप नियमन में एक भूमिका अदा करते हैं, इस विधि खांचे बनाने के लिए, भेदभाव सहायता करने के लिए और असतत पंक्तियों में कोशिकाओं को जमा करने के लिए इतना है कि स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान में, हम, cardiomyocyte सेल शीट के उत्पादन के लिए कक्षों की anisotropic सेल व्यवस्था को बढ़ावा देने के रूप में सेलुलर उन्मुखीकरण हृदय के ऊतकों 12-14,34 के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है इस विधि का आकलन कर रहे हैं।

दृष्टिकोण का प्रदर्शन यहां एक घुलनशील bioink कि अंततः नष्ट करना होगा कार्यरत हैं। हालांकि, अगर एक और अधिक स्थायी हाइड्रोजेल कवरेज की आवश्यकता है, तो माइक्रोबियल transglutaminase शामिल किए जाने के पार से लिंक कर सकते हैं और इस तरह की कोशिकाओं को 9, 35। Bioinks भी methacrylated पॉलिमर का उपयोग कर सकते यूवी crosslinkin शुरू की पर प्रतिकूल प्रभाव के बिना जिलेटिन आधारित लोगों के रूप में प्रोटीन हाइड्रोजेल स्थिरcytocompatible ढंग से 36 में सेल असर हाइड्रोजेल जी। हालांकि, हमारे अनुभव में, यह पाया गया कि transglutaminase crosslinking जब पाली की तुलना में हाइड्रोजेल और बहुलक सतह (कम आसानी से delaminated), और एक अधिक cytocompatible वातावरण के बीच एक बेहतर बातचीत के लिए प्रदत्त (एथिलीन ग्लाइकोल) diacrylate (PEGDA) हाइड्रोजेल 37।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Robotic Dispensing System Janome 2300N
Plasma Machine Femto Science Covance
USB Microscope
Optical Microscope Olympus IX71
Name Company Catalog Number Comments
Software
Spreadsheet Excel Excel
Printing Co-ordinate Software Janome JR C-Points
Imaging Software National Institutes of Health (NIH) ImageJ
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Stylus (Blade) OLFA AK-5
5 ml printing syringe San-ei Tech SH10LL-B
30 G printing needle San-ei Tech SH30-0.25-B
1 mm polystyrene sheets Purchased locally
Fetal bovine serum Invitrogen  10270-098
Phosphate buffered saline Invitrogen
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A Sigma Aldrich 9000-70-8
αMEM Invitrogen 41061-029
Antibiotc antimycotic Sigma Aldrich A5955-100ML
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) Cyagen Biosciences Incorporation RASMX-01201

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References

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Bhuthalingam, R., Lim, P. Q., Irvine, S. A., Venkatraman, S. S. Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells. J. Vis. Exp. (117), e54604, doi:10.3791/54604 (2016).More

Bhuthalingam, R., Lim, P. Q., Irvine, S. A., Venkatraman, S. S. Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells. J. Vis. Exp. (117), e54604, doi:10.3791/54604 (2016).

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