Abstract
כתב יד זה מתאר את המבוא של תכונות הדרכת תא ואחריו המסירה הישירה של תאים לתכונות הללו bioink הידרוג'ל באמצעות מערכת מחלק רובוטיות אוטומטית. Bioink בפרט נבחר כפי שהוא מאפשר לתאים משקעים כלפי ולחוש את התכונות. המערכת מהחלק bioprints תאי קיימא bioinks הידרוג'ל באמצעות ראש ההדפסה סייע backpressure. עם זאת, על ידי החלפת ראש ההדפסה עם עט או אזמל חדד, המערכת מהחלק יכולה גם להיות מועסקת על מנת ליצור רמזים טופוגרפיים דרך תחריט שטח. תנועת החרט ניתן לתכנת בצעדים של 10 מיקרומטר בכיווני X, Y ו- Z. החריצים בדוגמת הצליחו להתמצא בתאי גזע mesenchymal, תשפיע עליהם לאמץ מורפולוגיה מוארכת ובהלימה 'כיוון החריצים. הדפוסים יכולים להיות מתוכננים באמצעות תוכנת זומם בקווים ישרים, מעגלים קונצנטריים, וגלים סינוסי. בעוד הליך נוסף, פיברותקיעות ותאי גזע mesenchymal הושעו בתוך bioink ג'לטין 2%, עבור bioprinting ב ראש הדפסה שחול מונע backpressure. מסב תא bioink שהודפס מכן באמצעות אותן נקודות ציון מתוכנת המשמשות התחריט. תאי bioprinted הצליחו לחוש ולהגיב לתכונות החרוטות כפי שהוכח על ידי האורינטציה המוארכת שלהם יחד לכיוון החריצים החרוטים.
Introduction
הדפוסים המכוונים של מיקום תא מאפשרים ההיווצרות של תרבויות המחקים בארגון הסלולר vivo 1. ואכן, מחקר לתוך האינטראקציה בין סוגי תאים מרובים יכול להסתייע בארגון 2,3 המיקום המרחבי שלהם. רוב מערכות הדפוסים להסתמך על נהלי שינוי פני שטח לקידום או במניעת הידבקות תא עם בתצהיר תא פסיבי שלאחר מכן. Bioprinting מציע שליטה במרחב ובזמן על הפצות תא 1. בנוסף לפונקציות אלה, bioprinting תואר להיות שיטה פשוטה, מהירה טכנית וחסכונית להפקה 4 פיגומים גיאומטריים מורכבים. הוא מנצל תוכנות עיצוב במחשב ומאפשר כניסתה של תאים לתוך תהליך הייצור 4.
מערכות Bioprinting סווגו מבוססות על עקרונות העבודה שלהם כמו ליזר המבוסס, דיו מבוסס או שחול מבוסס 4. Bioprinting שחול תוארה המבטיח ביותר שכן היא מאפשרת הייצור של בונה מאורגנת בגדלים רלוונטיים קליני בתוך מסגרת זמן מציאותית 4-6. הדבר מתבצע באמצעות שחול סייע לחץ מכאני או אחורי של bioink הידרוג'ל תא נושא. בשיטה המוצגת כאן, חזרה לחץ הועסק. כאמור, התאים מועברים בתוך bioink cytocompatible. כזה bioink צריך לתמוך המשלוח של תאים מבלי לייצר מאמץ גזירה מזיק, ולהיות של צמיגות מספיק כדי לשמור על השלמות של הקורט המודפס, בלי להתמוטט או להפיץ (המכונה "לדמם דיו") 7-10.
האינטראקציה של תאים עם המשטח החסיד שלהם ידועה להשפיע על התנהגות הסלולר. טופוגרפית המשטח יכולה לשלוט על צורת התא, נטיית 11, ואפילו את הפנוטיפ. בפרט, הייצור של חריצים וערוצים הוכח לגרוםמורפולוגיה נמתחה, מוארכת על סוגי תאים מרובים. אימוץ מורפולוגיה זה כבר נמצא להשפיע על הפנוטיפ של תאי מולטיפוטנטיים ו פלוריפוטנטיים. לדוגמא, כאשר מיושרים על חריצים, בתאי גזע mesenchymal (MSC) מעיד בידול כלפי cardiomyocytes 12,13 ותאי שריר חלק בכלי דם לאמץ את הפנוטיפ ההתכווצות מעל הסינתטי 10,14-17.
התא יישור ערוצים או חריצים יכול להיווצר על משטח פולימרי באמצעות מספר שיטות, למשל, תחריט יון תגובתי עמוק, ליתוגרפיה אלומת אלקטרונים, הדפסת לייזר ישירה, לייזר femtosecond, photolithography ופלזמה יבש תחריט 18. גישות אלה הן בדרך כלל זמן רב, דורשות מנגנון מורכב ויכולות להיות הגבלה בצורת התבנית שנוצרה. בנוסף, הם לא לסנכרן דפוסים עם bioprinting ואינם מאפשרים עבור cellularization מיידית. התנועה נשלט בצורה מתואמת של אוטומטיותמערכת מחלק לעקוב אחרי תבניות מורכבות להפקדה של פתרונות. כאן אנו מדגימים כיצד תנועת microscale שבשליטת ניתן לנצל כדי ליצור ערוצים להתמצאות תא. עט או אזמל חדד מצורף ראש ההדפסה במקום של מזרק שהחול והציוד אז יכול לחרוט את פני שטח הפולימר תחת הדרכתו של התוכנה והתוויית. השיטה מציעה צדדית דפוס עיצוב שלכם והיא חלה על חומרים פולימריים נפוצים Bioengineering כגון פוליסטירן, PTFE, ו polycaprolactone. כצעד לאחר התחריט, תאים ניתן bioprinted ישירות החריצים השרוטים. Bioink ג'לטין מנוצל כאן הצליח הוא לשמור על השמץ ולאפשר לתאים שהופקדו לחוש את התכונות החרוטות. תאי גזע mesenchymal bioprinted לחריצי חרוט הודגמו להאריך לאורך אותם קווים ברורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש של מערכת מחלק רובוטית בסיוע גב לחץ (איור 1 א) כמו תחריט שטח (איור 1 ב) ו bioprinter מבוסס שחול (תרשים 1C) 10.
שינוי 1. משטח קלקר
- השתמש 1 גליונות מ"מ קלקר מאז צלחות תרבות קלקר רקמות נוטים להרכין כלפי מעלה במרכז, הורס את העקביות בגובה שני תחריט ודפוס.
הערה: ככל גליונות קלקר אינם משתנים עבור הידבקות התא, טיפול פלזמה מתבצע. - חמצן טיפול פלזמה.
- ראשית, בחר בלחץ של בר 2 על הרגולטור של גליל החמצן המחובר למכונת הפלזמה. ואז לעבור את המכונה פלזמה על קלט התנאים הבאים אל לוח הבקרה של המכשיר: 150 W, 30 sscm של חמצן, 10 דק '(כוח, זרימת הגז וזמן בהתאמה).
- מניחים את substrat קלקרדואר לתוך תא פלזמה, לאטום את הדלת ולחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה. משרים את המצע קלקר שטופלו פלזמה חמצן בסרום שור העובר לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני הכביסה בופר פוספט 1x שלוש פעמים (PBS).
2. דפוסי הדפס תכנות
- להשתמש בתכנית כדי ראשית לחתוך את השטח עם Stylus או אזמל.
- כאשר באמצעות עט, להכניס מחט טקסטיל 1.5 מ"מ קוטר (מבפנים בזהירות רבה) לתוך הנחיר של מזרק מחלק (או 5 או 10 מ"ל) עד שזה הופך תקוע ומאובטחת. אם באמצעות אזמל, לבחור אזמל עגול טפל כך שהוא עשוי להיות מהודק לתוך מנגנון המהדק של זרוע ההדפסה.
הערה: חרט משרטטת דפוסי מעוקל טוב יותר מאשר להב סכין המנתחים. - כאשר מנסים ראשון ליצור הסדר bioprinted, לשרטט את התבנית הרצויה על נייר מילימטרים עם גרזנים ממוספרים כדי ליצור את קואורדינטות XY. ואז אניNput את הקואורדינטות של דוגמה חרוטה / bioprinted לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני (איור 2).
הערה: "התבנית הרצויה" יכול להיות בצורות רבות כגון ליניארי, בצורת האות S, או עגול. הבחירה תלויה בדגם הניסוי הנדרש, כגון קווי קו מקבילים עבור הבידול של MSCs כדי cardiomyocytes כפי שהודגם כאן. פונקצית גרף הפיזור מאפשרת ההדמיה של תבנית החלקה המוצעת. - פתח את תוכנת ההדפסה / מחלק. בחר "התוכנית> הוספת תוכנית" ואחריו "ערוך> הוסף נקודה" כדי להגדיר את התוכנית. יצא את x ו- y לתאם הערכים שהתקבלו מגיליון הנתונים לתוך ההדפסה / מחלק התוכנה באמצעות "העתק הדבק" פונקציה.
- כייל את הגובה "z" של הרובוט לפני כל סיבוב על מנת למקם את זרבובית חרט / להדפיס על גבי המשטח.
- בתוכנת ההדפסה / מהחלק, בחר באפשרות "הרובוט", לחץ על "מצב שינוי &# 34; ו להפעיל את האפשרות "מצב הוראה". לאחר שנבחר, התוכנה מאפשרת את הפונקציה "רוץ" של הרובוט.
- לרוץ, ראשון לאתחל את הרובוט למצב ברירת המחדל שלו על ידי בחירת הפקודות הבאות משורת התפריטים; "רובוט> מקה אתחול", ולאחר מכן בחר "רובוט> רוץ". קלט את הערכים המספריים (במ"מ) ב "חריצי X ו- Y" נדרש להציב את העט בדיוק על מוצאם של הדפוס.
- לאחר מכן, קלט ערך מספרים (במ"מ) ב "חריץ Z" כדי למקם את הזרבובית העטה או הדפסה במגע עם פני השטח, אך לא כופף או להגביה את פני השטח. נקודה זו היא יועדה ערך התחלה "Z".
הערה: העומק של כל חריץ יכולה להיות מגוונים בקלות באמצעות Z-הגובה של המערכת. חריצים של 40, 80, ו 170 מיקרומטר מודגמים לחתוך לתוך השטח של 1 מ"מ יריעות קלקר עבה (איור 4 ולוח 1).
- בחר pהוראה דפס עבור כל אחת מן הנקודות לתאם, כלומר, "התחלה של קו לוותר" על מנת להגדיר את הנקודה הראשונה וייזום ההדפסה, "הקו עובר" לייעד את נקודות ביניים "סוףשורה לוותר" לאותת הרובוט לסיים את מהדורה.
- תקשר את התכנית אל הרובוט על ידי בחירת פקודות מעקב משורת התפריטים העליונה: "Robot> שלח נתוני C & T".
- ליזום בטווח תחריט / הדפסה, על ידי שינוי הרובוט למצב "הפעל". עושה זאת על ידי הבחירה "רובוט> שינוי מצב> Switch הפעלת מצב" משורת התפריטים העליונה.
- הפעל את הליך ההדפסה על ידי לחיצה על ירוק "כפתור התחל" על הקונסולה מנפק רובוט.
- כאשר באמצעות עט, להכניס מחט טקסטיל 1.5 מ"מ קוטר (מבפנים בזהירות רבה) לתוך הנחיר של מזרק מחלק (או 5 או 10 מ"ל) עד שזה הופך תקוע ומאובטחת. אם באמצעות אזמל, לבחור אזמל עגול טפל כך שהוא עשוי להיות מהודק לתוך מנגנון המהדק של זרוע ההדפסה.
3. הכנה והדפסה של תא המכיל ג'לטין Bioink
- ממיסים ג'לטין 2% מינימום בינוני Essential אלפא בינוני (αMEM) (בתוספת 10% FBS ו 2% אנטיביוטי / antimycotic) ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להכין את פתרונות bioink.
- טרום תרבות חלבון פלואורסצנטי אדום לבטא בתאי גזע mesenchymal (RFP-MSCs) כדי מפגש 70% במנות בתרבית רקמה 10 ס"מ באמצעות αMEM / 10% FBS. שחרר את התאים המצורפים לתוך השעיה על ידי הסרה הבינונית וציפוי עם פתרון טריפסין-EDTA 1x במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. Resuspend התא גלולה ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ולספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer.
- לאחר המאפשר bioink כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, מערבבים בעדינות נפח מספיק כדי השעיית RFP-MSCs ב bioink כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 מ"ל 6 תאים -1.
- יוצק את תא הנושאת bioink לתוך מזרק הדפסה עם הזרבובית האטומה. צ'יל המזרק הטעון עד 4 ° C כדי להשיג צמיגות להדפסה.
- יש להכניס את המזרק הטעון על אוטומטיותמערכת מחלק רובוטית ולצרף קווים בלחץ האוויר. הסר את חותם מזרק Luer ולצרף נחיר ההדפסה.
- Extrude את bioinks cellularized לתוך קווים דקים באמצעות לחץ 0.05 מגפ"ס בחזרה, ב 5 מ"מ / מהירות כתיבת שניות מתוך מזרק 10 מיליליטר דרך נחיר 27 G מחט / (קונים מומלצים יותר גלילי) על גבי משטח סרט קלקר, בעקבות בתצהיר המתוכנת מראש הדפוס שתואר בשלב 2.1 למקם את bioink cellularized על גבי המסילות מראש חרוט.
- לאחר 1 דגירת שעה בטמפרטורת חדר, להוסיף 10 מיליליטר צמיחת תקשורת (בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה) ו דגירת התאים למשך 24 שעות (כדי לאפשר לתאים לחוש ולהגיב לתכונות החרוטות) לפני הצפייה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות הנציג להוכיח כי המערכת מהחלק רובוטית סייע backpressure יכולה לשמש bioprinter שחול מבוסס לביצוע הוא תחריט שטח והדפסת bioink (איור 1 א). ניתן להשתמש בו עבור הדור של חריצים חרוטים לתוך משטחים פולימריים, ולאחר מכן להדפיס bioink תא נושא ישירות לתכונות (B איור 1 ו- C).
הן התחריט וההדפסה נקבעים על ידי הקואורדינטות המתוכנות (איור 2) קלט לתוך תוכנת ההדפסה / מחלק המאפשרת הדפסה של ליניארי, מעוקל ודפוסים רדיאלי כנדרש עבור היישום (איור 3 AC). הגדרות ציר Z לאפשר בקרה של עומק החריץ החרוט (איור 4 ולוח 1).
לאחר ההחלפההעט עם ראש הדפסה הידרוג'ל, תכנות כי תאם את התחריט, אפשר לחזור כדי לאפשר למערכת מחלק הרובוטית כדי לספק את bioink תא נושא ישירות החריצים החרוטים בעקבות אותו העיצוב (D איור 3 ו- E). כפי שנראה באיור 5 A ו- B, תאי הגזע שנזרעו על ידי bioprinting בתוך bioink בסופו של דבר משקע על פני השטח, ואת לחוש להאריך לאורך הכיוון של התחריט בתוך קווי נבדל. התאים זורעים במדיום תרבות ללא bioprinting מיושר לכיוון של תכונות, לעומת זאת, הם כיסו את כל פני השטח (איור 5 ג), המוכיח כי bioink מגביל את התאים עד הקו מודפס. ללא תכונות חרוטות, תאים שנזרעו בתקשורת התרבות מראים נטייה או יישור (איור 5 ד ').
figuבתשובה לשאלה 1:. המערכת מהחלק רובוטיות האוטומטית (א) את המכשור אישית עם הצטרפותם של חרט חדד (מאובטח מזרק) מרכזי ראש ההדפסה משרטט טבעות קונצנטריות לשקופית פוליסטירן (B). ראש ההדפסה ניתן יהיה להמיר extrude bioink ג'לטין תא נושא, עם לחץ בחזרה סייע שחול, ופיקדונות על הדפוס החקוק בעבר (C). נתון זה יש הבדל בין ואח Bhuthalingam. 2015 10.
איור 2: שרטוט קואורדינטות XY בתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני תפוס המסך המוצג כאן מוכיח כי xy לחשב את נקודות הציון יצר תבנית גל סינוסי כפי שמוצג על ידי העלילה הגרף.. נקודות ציון אלה היו קלט לתוך התוכנה זומם באמצעות העתק / הדבקפוּנקצִיָה.
איור 3:. חרוט דפוס צדדי הקואורדינטות שתוכנת התוכנה והתוויית הצליחו לחרוט ליניארי (א), סינוסי (ב ') מעגלי קונצנטריים (C). החריצים הצרובים פוליסטירן יכולים להיות מודפסים ישירות על גבי עם bioink הידרוג'ל במהלך השלב הבא (ד) ו- (ה). נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10.
איור 4:. עומק חריץ חרוט עומק החריץ החרוט ניתן לווסת באמצעות שלט Z- ציר של המערכת מהחלק. תמונות (א) עד (ג) להציג את התצוגה התקורה(ד) עד (ה) להראות את החתך. הרובוט היה מתוכנת כדי לחרוט את השטח עד לעומק של 40 ((א) ו- (ד)), 90 ((ב) ו- (ה)) ו -180 מיקרומטר ((ג) ו- (ו)). הקרבה של עומק מתוכנת ועומק חרוט בפועל מוצגת בטבלה 1. נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10.
איור 5: Bioink נמסר בתאי גזע mesenchymal המכרז-MSCs מודפס bioink על דפוסי חרוט יכול לחוש את התכונות כפי שהוכח על ידי המורפולוגיה ויישור מוארך שלהם עם חריצים (א) ו- (ב) לעומת תאים שנזרעו על. תכונות מבלי bioink (כלומר, במדיום תרבות) (C </ strong>) ועל משטח שאינו בדוגמת (ד '). נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10.
| עומק מתוכן (מיקרומטר) | עומק חריץ חרוט (מיקרומטר) |
| 40 | 35 ± 7 |
| 90 | 81 ± 6 |
| 180 | 175 ± 3 |
טבלה 1:. השוואת מתוכנת לעומת עומק תחריט בפועל על קלקר נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam ואח 2015 10..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי של הליך זה הוא משלוח bioprinting בפועל של תאי הגזע כתהליך חייב לאפשר שקיעת תא לתכונות, להדפיס ללא bioink מתפשטת / דימום, לספק תאים בלי מוות של תאי מאמץ גזירה ולא לעורר בידול כלפי שושלת רצויה.
אם יישור התא הצפוי נכשל אמורה להתרחש, צמיגות bioink יש לבחון עבור התאמתה להדפסה. חשוב כי bioink מאפשר לתאים משקעים על פני שטח פולימר בדוגמת. ריכוז פולימר bioink ניתן להקטין או הטמפרטורה שלו גדלה (עד למקסימום של 37 מעלות צלזיוס), כדי להפחית את הצמיגות ולקדם שקיעת תא. עם זאת, הפחתות אלה עלולות לגרום bioink להפיץ / לדמם ופוסט הדפסה. כאן אנו ממליצים להשתמש 2% ג'לטין (w / v) מומס 1x PBS. אם את ריכוז תאי הדפסת הפוסט מופיעה מופחתת, אז מאמץ הגזירה מושרה על ידי הדפסה ייתכן שהזיקכדאיות של התאים המודפסים 7. בדקו את תאי bioink לפני ואחרי ההדפסה באמצעות assay כדאית כגון הפעלת resazurin fluoresence 7. בנוסף, אם תאי גזע bioprinted קשר פני השטח, אך לא ליישר, אז זה אפשרי מאמץ הגזירה במהלך הדפסת ירד multipotency שלהם באמצעות הסתת מסלול בידול רצוי. Stemness ופוסט הדפסה ניתן להעריך על ידי מיון תא מופעל קרינה (FACS) ניתוח באמצעות סמני תא גזע כגון CD 29 10,19,20. אם יתברר כי מאמץ הגזירה הוא שיש השפעות מזיקות על התאים, אז צמיגות הדפסת bioink יכולה להיות מופחתת על ידי הוספה או ההחלפה של פולימר bioink עם גזירה הדלילה אחד, כגון אלגינט, Pluronic F127, חומצה היאלורונית, מסטיק gellan, methacrylate או פוליאתילן ג'לטין תחמוצת 19, 21-25.
לבסוף, היבטים אחרים שיכולים להיות מותאם כוללים את backpressure הדפסה, צפיפות התאים bioink,בקוטר זרבובית. Backpressure דורש אופטימיזציה על הצמיגות של bioink וניתן לשנות כדי להשיג שמץ רצוף בדיד. ריכוז תא גבוה עלול להגדיל את צמיגות bioink ולסתום את ראש ההדפסה. עם זאת, תהליך שחול זה לאפשר הדפסה של צפיפות תא גבוהה יחסית שיטות bioprinting אחרות 26,27. הבחירה של מד זרבובית ההדפסה צריכה להיחשב מאז חרירים בקוטר קטנים יכולים לייצר עקבות עדינות אבל יהיה נוטה וסותם. חרירי קונים נמצאו לתפקד טוב יותר מאז אותו קצב הזרימה יכול להיות מושג כמו זרבובית גלילית אבל בכל מאמץ גזירה נמוך ומכאן כדאיויות תא השתפר 28.
השיטה בתצהיר סייע backpressure, המכונה גם שחול bioprinting, יש פחות מאשר החלטת גישות הדפסת תאים אחרות כגון הזרקת דיו ומתודולוגיה בסיוע הליזר בשל אורך צעד לתכנות מינימום ההתפשטות של emerging bioink. עם זאת, ציוד שחול backpressure הוא שונה ביותר בקלות עבור הכללת חרט תחריט. שיטות אחרות של חריצי ייצור כגון דפוסי מייקרו באמצעות photolithography ואחריו דפוס PDMS יש משמעותי יותר צעדים מאשר תחריט רובוטיות השיטה היא פחות צדדית ב שינוי דפוסים קיימים או ייצור חדש 12,15,29-31.
שיטה זו מציעה כלי מחקר במבחנה של אינטראקציות התא שבו המיקום, האורינטציה, והסידור של סוגי תאים אחד או יותר חשובים. סוגי תאים מספר כולל בתאי גזע mesenchymal, פיברובלסטים, ותאי שריר חלק ידועים ליישר על חריצים משטח 1,10,14,18. דפוסי החרוט, המוצגים כאן, יכולים להיות משונים נדפסו מהר מאוד בקלות. זהו עניין כמו דפוסי משטח עם חריצים כבר השתמשו במחקר של הידבקות תא, מורפולוגיה, הגירת גזע התמיינות תאים. יתר על כן, אניt גם יושם עצביים והנדסת רקמות שרירים ושלד 18, 32,33. מאז החריצים לעשות לשחק תפקיד התמיינות תאים או תקנה פנוטיפ עבור מספר סוגים של תאי, שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור חריצים, כדי לסייע בידול להפקיד תאים בשורות בדידות כך מסך יכול להתבצע. נכון לעכשיו, אנו בוחנים בשיטה זו כדי לקדם הסדר תא איזוטרופי של תאים לייצור יריעות תא cardiomyocyte, כמו הנטייה הסלולר היא חשובה לתפקוד של רקמת לב 12-14,34.
הגישה הפגינה כאן מעסיקה bioink מסיס כי בסופו של דבר יתפוגג. עם זאת, אם כיסוי הידרוג'ל קבוע יותר נדרש, אז הכללת transglutaminase חיידקים יכולים קשר צולב ולייצב הידרוג חלבון כגון אלו המבוססים ג'לטין ללא השפעות שליליות על תאים 9, 35. Bioinks יכול גם לנצל פולימרים methacrylated עבור UV יזם crosslinkinגרם של הידרוג נושאות התא באופן cytocompatible 36. עם זאת, הניסיון שלנו, נמצא כי crosslinking transglutaminase הנתונות עבור אינטראקציה משופרת בין הידרוג'ל משטח פולימר (פחות בקלות delaminated), וסביבת cytocompatible יותר בהשוואה פולי (אתילן גליקול) diacrylate (PEGDA) הידרוג'ל 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
- Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 229-248 (2015).
- Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. , Springer International Publishing. 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
