Abstract
Ce manuscrit décrit l'introduction d'éléments de guidage de la cellule, suivie par l'administration directe de cellules à ces caractéristiques dans un bioink d'hydrogel à l'aide d'un système de distribution robotique automatisé. Le bioink particulier a été choisi car il permet aux cellules de sédiments vers et détectent les caractéristiques. Le système de distribution bioprints cellules viables dans bioinks hydrogel en utilisant une contre-pression assistée tête d'impression. Toutefois, le remplacement de la tête d'impression avec un stylet ou d'un scalpel aiguisé, le système de distribution peut également être utilisé pour créer des repères topographiques par gravure de la surface. Le mouvement du stylet peut être programmé par incréments de 10 um dans les directions X, Y et Z. Les rainures modelées ont été capables d'orienter les cellules souches mésenchymateuses, les inciter à adopter une morphologie allongée en alignement avec la direction des rainures. Le motif pourrait être conçu en utilisant un logiciel de traçage dans les lignes droites, des cercles concentriques, et des ondes sinusoïdales. Dans une procédure ultérieure, fibroblastes et les cellules souches mésenchymateuses ont été mises en suspension dans une gélatine bioink 2%, pour bioprinting dans une contre-pression entraînée par extrusion tête d'impression. Le bioink de support de cellule est ensuite imprimée en utilisant les mêmes coordonnées programmées utilisées pour la gravure. Les cellules bioprinted étaient capables de détecter et réagir aux caractéristiques gravées comme démontré par leur orientation allongée selon la direction des rainures gravées.
Introduction
La structuration délibérée de placement cellulaire permet la formation de cultures qui imitent in vivo organisation cellulaire 1. En effet, la recherche sur l'interaction entre plusieurs types de cellules peut être assisté par l' organisation de leur placement 2,3 spatiale. La plupart des systèmes de mise en forme reposent sur des procédures de modification de surface pour favoriser ou empêcher l'adhérence cellulaire par dépôt de cellules passif subséquente. Bioprinting offre un contrôle spatial et temporel sur les distributions de cellules 1. En plus de ces fonctions, bioprinting a été décrit comme étant un procédé techniquement simple, rapide et rentable pour générer des échafauds géométriquement complexes 4. Il utilise un logiciel de conception assistée par ordinateur et permet l'introduction de cellules dans le procédé de fabrication 4.
Systèmes de Bioprinting ont été classés en fonction de leurs principes de fonctionnement comme laser à base, sur la base d' extrusion-4 sur la base jet d' encre ou. Extrusion bioprinting a été décrit comme la plus prometteuse car elle permet la fabrication de constructions organisées de tailles cliniquement pertinentes dans un laps de temps réaliste 4-6. Elle est réalisée soit par une pression mécanique ou à l'arrière d'extrusion assistée d'un hydrogel bioink de support cellulaire. Dans la méthode présentée ici, la contre-pression a été employée. Comme mentionné précédemment, les cellules sont livrées dans un bioink cytocompatible. Un tel bioink devrait soutenir la fourniture de cellules sans produire de contrainte de cisaillement délétère, et être d'une viscosité suffisante pour maintenir l'intégrité de la trace imprimée, sans effondrement ou de propagation (dénommé «purge d'encre") 7-10.
L'interaction des cellules avec leur surface adhérente est connue pour influencer le comportement cellulaire. La topographie de la surface peut contrôler la forme de la cellule, l' orientation 11, et même le phénotype. En particulier, la fabrication des rainures et des canaux ont été démontrées pour induireune étirée, la morphologie allongée sur plusieurs types de cellules. L'adoption de cette morphologie a été trouvé pour influencer le phénotype des cellules multipotentes et pluripotentes. Par exemple, lorsqu'elles sont alignées sur les rainures, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent la différenciation vers cardiomyocytes 12,13 et les cellules musculaires lisses vasculaires adopter le phénotype contractile sur synthétique 10,14-17.
La cellule alignement des canaux ou des rainures peut être générée sur une surface polymère par un certain nombre de méthodes, par exemple, profonde gravure ionique réactive, lithographie électronique, l' impression directe au laser, laser femtoseconde, photolithographie et gravure plasma sec 18. Ces approches sont souvent longues, nécessitent un appareillage complexe et peut limiter dans la forme du motif généré. En outre, ils ne sont pas synchronisées avec les motifs bioprinting et ne permettent pas de cellularisation immédiat. Le mouvement coordonnée contrôlée d'un automatisésystème de distribution peut suivre des schémas complexes pour le dépôt de solutions. Ici, nous montrons comment le mouvement micrométrique contrôlée peut être exploitée pour créer des canaux pour l'orientation des cellules. Un stylet ou d'un scalpel aiguisé est attaché à la tête d'impression à la place de la seringue d'extrusion et l'équipement peuvent alors graver la surface de polymère sous la direction du logiciel de traçage. La méthode offre une polyvalence dans la conception de modèle et est applicable aux matériaux polymères couramment utilisés en bioingénierie tels que le polystyrène, le PTFE et polycaprolactone. Comme une étape ultérieure à la gravure, les cellules peuvent être directement bioprinted aux rainures rayées. La bioink de gélatine utilisée ici a été en mesure à la fois de maintenir la trace et permettre aux cellules déposées pour détecter les caractéristiques gravées. Les cellules souches mésenchymateuses bioprinted aux rainures gravées ont été démontrées pour allonger le long de ces lignes dans distincts.
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Protocol
Remarque: Ce protocole décrit l'utilisation d'une contre-pression du système de distribution robotique assistée (Figure 1A) une gravure superficielle (figure 1B) et à base bioprinter extrusion (figure 1C) 10.
1. La modification d'une surface de polystyrène
- Utilisez 1 feuilles mm de polystyrène depuis des plaques de culture de tissus de polystyrène ont tendance à incliner vers le haut dans le centre, ruinant la cohérence de la hauteur à la fois la gravure et l'impression.
Remarque: Comme les feuilles de polystyrène ne sont pas modifiées pour l'adhérence cellulaire, le traitement au plasma est effectué. - traitement au plasma d'oxygène.
- Tout d'abord, sélectionner une pression de 2 bars sur le régulateur de la bouteille d'oxygène relié à la machine à plasma. Mettez ensuite la machine à plasma et à saisir les conditions suivantes dans le panneau de commande de l'appareil: 150 W, 30 sscm d'oxygène, 10 min (pour l'alimentation, le débit de gaz et le temps respectivement).
- Placer le polystyrène substratee dans la chambre à plasma, sceller la porte et appuyez sur le bouton de démarrage sur le panneau de commande. Faire tremper le plasma d'oxygène du polystyrène traité substrat dans du sérum bovin foetal et laisser incuber à 37 ° C pendant 2 heures avant de laver trois fois le phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS).
2. Programmation Imprimer Patterns
- Utilisez le programme First Etch la surface avec un stylet ou Scalpel.
- Lors de l'utilisation d'un stylet, d'insérer une aiguille textile diamètre de 1,5 mm (à partir de l'intérieur avec le plus grand soin) dans la buse d'une seringue de distribution (5 ou 10 ml) jusqu'à ce qu'elle soit calée et fixée. Si l'on utilise un scalpel, pour choisir un scalpel rond manipulé de sorte qu'il peut être fixé dans le mécanisme de serrage du bras d'impression.
NOTE: Le stylet décape motifs incurvés mieux que la lame de scalpel. - Lors de la première tentative de création d'un arrangement bioprinted, esquisser le motif désiré sur du papier millimétré avec axes numérotés pour générer les coordonnées XY. Alors jenput les coordonnées du motif gravé / bioprinted dans le logiciel de feuille de calcul (figure 2).
NOTE: Le «motif désiré» peut être dans de nombreuses formes telles que linéaire, en forme de S, ou circulaire. Le choix dépend du modèle expérimental nécessaire, telles que les lignes linéaires parallèles pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses à cardiomyocytes comme démontré ici. La fonction graphique de dispersion permet la visualisation du motif de tracé proposé. - Ouvrez l'impression / logiciel de distribution. Sélectionnez "Programme> Ajouter un programme" suivi par "Edition> Ajouter un point" de mettre en place le programme. Export de la coordonnées x et y des valeurs obtenues à partir de la feuille de calcul dans l'impression / distribution de logiciels en utilisant le "copier et coller" fonction.
- Calibrer le "z" hauteur du robot avant chaque course afin de placer la buse stylet / d'impression sur la surface.
- Dans l'impression / logiciel de distribution, sélectionnez l'option "Robot", cliquez sur "Changer de mode &# 34; et activez l'option "mode d'enseignement». Une fois sélectionné, le logiciel permet la fonction "Jog" du robot.
- Pour Jog, d'abord initialiser le robot à sa position par défaut en sélectionnant les commandes suivantes dans la barre de menu; "Robot> Meca Initialize", puis sélectionnez "Robot> Jog". Entrez les valeurs numériques (en mm) dans les "X et Y fentes" nécessaires pour placer le stylet exactement sur l'origine du motif.
- Ensuite, l'entrée d'une valeur numérique (en mm) dans la "fente Z" pour placer le stylet ou l'impression de buse en contact avec la surface, mais pas fléchir ou en retrait de la surface. Ce point est désigné comme "Z" valeur de départ.
REMARQUE: La profondeur de chaque rainure peut varier facilement grâce à la hauteur Z du système. Gorges 40, 80 et 170 um sont mises en évidence à couper dans la surface de 1 mm d' épaisseur des feuilles de polystyrène (figure 4 et tableau 1).
- Sélectionnez le pinstruction rint pour chacun des points de coordonnées, à savoir, "Début de ligne Dispense" pour définir le premier point et imprimer initiation, "Line Passing" pour désigner les points intermédiaires et "End of Line Dispense" pour signaler au robot de mettre fin à la tirage.
- Communiquer le programme du robot en sélectionnant les commandes de suivi de la barre de menu en haut: "Robot> Envoyer C & T Data".
- Initier la gravure / tirage, en changeant le robot en mode "Run". Ne en sélectionnant «Robot> Modification du mode> Switch Mode Run" dans la barre de menu du haut.
- Commencez la procédure d'impression en appuyant sur le bouton "start" vert sur la console robot distributeur.
- Lors de l'utilisation d'un stylet, d'insérer une aiguille textile diamètre de 1,5 mm (à partir de l'intérieur avec le plus grand soin) dans la buse d'une seringue de distribution (5 ou 10 ml) jusqu'à ce qu'elle soit calée et fixée. Si l'on utilise un scalpel, pour choisir un scalpel rond manipulé de sorte qu'il peut être fixé dans le mécanisme de serrage du bras d'impression.
3. Préparation et impression de Gelatin Bioink contenant Cell-
- Dissoudre 2% de gélatine dans un milieu essentiel minimum alpha Moyen (aMEM) (complété avec 10% de FBS et 2% d'antibiotique / antimycotic) à 60 ° C pendant 2 heures pour préparer les solutions de bioink.
- Pré-culture de la protéine fluorescente rouge exprimant Cellules souches mésenchymateuses (DP-MSCs) à 70% de confluence dans 10 cm des boîtes de culture tissulaire en utilisant aMEM / 10% de FBS. Relâchez les cellules attachées en suspension en retirant le milieu et le revêtement avec 1x solution de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
- Pellet les cellules par centrifugation à 1000 xg pendant 5 minutes et retirer le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml de 1 x PBS et compter la densité des cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Après avoir laissé le bioink refroidir à la température ambiante, mélanger doucement dans un volume suffisant pour la suspension de la DP-MSC dans le bioink pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 6 cellules ml - 1.
- Verser le bioink de support de cellule dans une seringue d'impression avec la buse étanche. Refroidir la seringue chargée à 4 ° C afin d'obtenir une viscosité d'impression.
- Placez la seringue chargée sur le automatisésystème de distribution robotique et fixer les lignes de pression d'air. Retirer le joint Luer de la seringue et fixer la buse d'impression.
- Extruder les bioinks cellularisées en lignes minces en utilisant 0,05 MPa-pression, à 5 mm / s vitesse d'écriture à partir d'une seringue de 10 ml par une 27 aiguille G / buse (conique recommandé plus cylindrique) sur une surface de film de polystyrène, après le dépôt pré-programmé schéma décrit à l'étape 2.1 pour placer le bioink cellularisée sur les rainures pré-gravées.
- Après 1 heure d'incubation à température ambiante, on ajoute 10 ml de milieu de croissance (supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques) et on incube les cellules pendant 24 heures (pour permettre aux cellules pour détecter et réagir aux caractéristiques gravées) avant la visualisation à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence au grossissement 10X.
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Representative Results
Les résultats représentatifs montrent que le système de distribution robotique de contre - pression assistée peut être utilisé comme la base bioprinter par extrusion pour réaliser une gravure à la fois de la surface et l' impression bioink (figure 1 A). Il peut être utilisé pour la génération de rainures gravées dans la couche superficielle de polymère, et à imprimer ensuite une bioink de support de cellule directement aux caractéristiques (figure 1 B et C).
Tant la gravure et l' impression sont déterminés par les coordonnées programmées (Figure 2) entrée dans le / logiciel d'impression de distribution qui permet une impression linéaire, courbe et modèles radiaux selon les besoins de l'application (Figure 3 AC). Les paramètres d' axe Z pour permettre le contrôle de la profondeur de la rainure gravée (figure 4 et tableau 1).
Après avoir remplacéle stylet avec une tête d' hydrogel d'impression, la programmation qui coordonne la gravure peut être réutilisée pour permettre au système robotique de distribution pour délivrer le bioink de support de cellule directement aux sillons gravés en suivant le même dessin (figure 3 D et E). Comme on peut l' observer sur la figure 5 A et B, les cellules souches ensemencées par bioprinting au sein du sédiment bioink finalement à la surface, et le sens et allongé suivant la direction de la gravure à l'intérieur des lignes discrètes. Les cellules mises en culture dans un milieu de culture sans bioprinting alignées dans la direction des traits, cependant, ils ont couvert toute la surface (figure 5 C), ce qui prouve que le bioink contraint les cellules à la trace imprimée. Sans caractéristiques gravées, les cellules ensemencées dans les milieux de culture montrent aucune orientation ou l' alignement (Figure 5 D).
Figure 1. Système de distribution robotique automatisé (A) Le dispositif a été adapté par l'inclusion d'un stylet affûté (fixé dans une seringue) au centre de la tête d'impression qui décape anneaux concentriques sur une lamelle de polystyrène (B). La tête d'impression peut ensuite être converti en extruder roulement cellulaire gélatine bioink, avec pression assistée par extrusion, et le dépôt sur le motif précédemment gravé (C). Ce chiffre a été modifié depuis Bhuthalingam et al. 2015 10.
Coordonnées Traçage xy dans un logiciel tableur La capture d'écran montré ici démontre que le xy tracé coordonnées créé une forme d'onde sinusoïdale comme le montre le tracé du graphe: Figure 2.. Ces coordonnées ont été saisies dans le logiciel de traçage en utilisant le copier / collerfonction.
Figure 3:. Gravé motif polyvalence Les coordonnées programmées dans le logiciel de traçage ont été en mesure de graver linéaire (A), sinusoïdal (B) et des cercles concentriques (C). Les rainures gravées dans un polystyrène peuvent être imprimées directement sur le bioink d'hydrogel au cours de l'étape suivante (D) et (E). Ce chiffre a été modifié depuis Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figure 4:. Gravé profondeur de rainure La profondeur de la rainure gravée peuvent être régulés par le contrôle de l' axe z du système de distribution. Images (A) à (C) montrent la vue de dessus et(D) (E) correspond à la section transversale. Le robot a été programmé de manière à graver la surface jusqu'à une profondeur de 40 ((A) et (D)), 90 ((B) et (E)) et 180 um ((C) et (F)). La proximité de la profondeur programmée et réelle profondeur gravée est affichée dans le tableau 1. Ce chiffre a été modifié depuis Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figure 5: Bioink livré des cellules souches mésenchymateuses La DP-MSCs imprimés dans la bioink sur les motifs gravés peuvent détecter les caractéristiques comme démontré par leur morphologie allongée et alignée avec les rainures (A) et (B) par rapport aux cellules mises en culture sur le. caractéristiques sans bioink (ie, dans un milieu de culture) (C </ strong>) et sur une surface sans motif (D). Ce chiffre a été modifié depuis Bhuthalingam et al. 2015 10.
| Profondeur programmée (um) | Profondeur de rainure Gravé (pm) |
| 40 | 35 ± 7 |
| 90 | 81 ± 6 |
| 180 | 175 ± 3 |
Tableau 1:. Comparaison des programmée et réelle profondeur de gravure sur polystyrène Ce chiffre a été modifié depuis Bhuthalingam et al 2015 10..
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Discussion
L'étape critique de cette procédure est la livraison de bioprinting réelle des cellules souches comme le processus doit permettre la sédimentation des cellules aux caractéristiques, imprimer sans bioink propagation / saignements, livrer des cellules sans cisaillement mort cellulaire du stress et ne pas déclencher la différenciation vers la lignée non désirée.
Si l'alignement cellulaire attendu ne se produit pas, alors la viscosité de bioink doit être évalué pour son aptitude à l'impression. Il est important que le bioink permet aux cellules de sédimenter sur la surface du polymère à motifs. La concentration du polymère bioink peut être réduite ou augmentée de sa température (jusqu'à un maximum de 37 ° C), pour réduire la viscosité et favoriser la sédimentation des cellules. Cependant, ces réductions peuvent provoquer le bioink à répandre l'impression de poste / de purge. Ici, nous vous suggérons d'utiliser 2% de gélatine (p / v) dissous dans PBS 1x. Si la post-impression de concentration cellulaire apparaît réduite, alors la contrainte de cisaillement induite par l'impression peut avoir compromis lala viabilité des cellules imprimé 7. Vérifier les cellules de la bioink avant et après l' impression en utilisant un dosage de viabilité tel que l'activation de la résazurine 7 fluorescence. En outre, si les cellules souches bioprinted contact avec la surface, mais ne sont pas alignées, il est possible que la contrainte de cisaillement lors de l'impression a diminué leur pluripotence en déclenchant une voie de différenciation indésirable. Poste d' impression stemness peut être évaluée avec des cellules activées par fluorescence (FACS) l' analyse utilisant des marqueurs de cellules souches tel que CD 29 10,19,20. Si l'on constate que la contrainte de cisaillement est d'avoir des effets délétères sur les cellules, alors la viscosité à l'impression bioink peut être réduite en ajoutant ou en remplaçant le polymère bioink avec un rhéofluidifiant une, tel que l'alginate, le Pluronic F127, l'acide hyaluronique, la gomme gellane, le méthacrylate de gélatine ou de l' oxyde 19, 21-25 polyéthylène.
Enfin, d'autres aspects qui peuvent être optimisés incluent la contre-pression d'impression, la densité cellulaire bioink,et le diamètre de la buse. La contre-pression nécessite une optimisation de la viscosité de la bioink et peut être modifié de manière à obtenir un tracé continu discret. Une concentration cellulaire élevée peut augmenter la viscosité de bioink et obstruer la tête d'impression. Cependant, ce procédé d'extrusion , ne permet pour l' impression des densités de cellules relativement plus élevés que d' autres méthodes de bioprinting 26,27. La sélection de la jauge de buse d'impression doit être considéré depuis des buses de faible diamètre peuvent produire une trace plus fine, mais seront sujettes à l'encrassement. Buses coniques ont été trouvés à mieux fonctionner depuis le même débit peut être réalisé sous forme de buse cylindrique mais à une contrainte de cisaillement inférieure donc amélioré la viabilité des cellules 28.
Le procédé de dépôt assisté par contre-pression, également appelée extrusion bioprinting, présente une résolution inférieure à d'autres méthodes d'impression telles que des cellules à jet d'encre et la méthode assistée par laser en raison de la longueur minimale de pas programmable et l'étalement de la Emerging bioink. Toutefois, l'équipement contrepression d'extrusion est le plus facilement modifié pour l'inclusion d'un stylet de gravure. D' autres méthodes de rainures produisant comme les micro-motifs en utilisant la photolithographie suivie par PDMS moulage ont beaucoup plus d' étapes que la gravure robotique et la méthode est moins polyvalent à modifier les modèles existants ou de produire de nouveaux 12,15,29-31.
Cette méthode fournit un outil pour l' étude in vitro des interactions cellulaires dans lequel la position, l' orientation et la disposition d'un ou plusieurs types de cellules sont importantes. Plusieurs types de cellules , y compris des cellules souches mésenchymateuses, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses sont connus pour s'aligner sur les gorges de la surface 1,10,14,18. Les motifs gravés, présentés ici, peuvent être modifiés et réimprimés très rapidement et avec facilité. Ceci est intéressant en tant que motif de surface avec des rainures a été utilisée dans l'étude de l'adhésion cellulaire, la morphologie, la migration et la différenciation des cellules souches. En outre, it a également été appliquée aux neurones et de l' ingénierie de tissus musculo - squelettiques 18, 32,33. Étant donné que les rainures jouent un rôle dans la différenciation cellulaire ou la régulation du phénotype pour plusieurs types de cellules, cette méthode peut être utilisée pour créer des rainures, pour faciliter la différenciation et à déposer des cellules en rangées discrètes de sorte que les écrans peuvent être effectuées. Actuellement, nous sommes en train d' évaluer cette méthode pour favoriser anisotrope agencement de cellules des cellules pour la production de feuilles de cellules cardiomyocytes, comme l'orientation cellulaire est importante pour la fonction du tissu cardiaque 12-14,34.
L'approche démontrée ici utilise un bioink soluble qui finira par se dissiper. Toutefois, si une couverture d'hydrogel plus permanente est nécessaire, l'inclusion de la transglutaminase microbienne peut réticuler et stabiliser hydrogels de protéines tels que ceux à base de gélatine sans effets nocifs sur les cellules 9, 35. Bioinks peut également utiliser des polymères méthacrylatée pour UV lancé crosslinking d'hydrogels portant des cellules de manière cytocompatible 36. Cependant, dans notre expérience, il a été constaté que la réticulation de transglutaminase confère une meilleure interaction entre l'hydrogel et la surface du polymère (moins aisément délaminées), et un environnement plus cytocompatibles par rapport au poly (éthylène glycol) , le diacrylate (PEGDA) d' hydrogel 37.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
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