Abstract
Questo manoscritto descrive l'introduzione di elementi di orientamento cellule seguita dalla consegna diretta delle cellule di queste caratteristiche in un bioink idrogel utilizzando un sistema di erogazione automatico robotizzato. La particolare bioink stata selezionata in quanto consente alle cellule di sedimentare verso e rilevano le caratteristiche. Il sistema di erogazione bioprints cellule vitali in bioinks idrogel usando una contropressione assistito testina di stampa. Tuttavia, sostituendo la testina di stampa con uno stilo o bisturi affilata, il sistema di erogazione può anche essere impiegato per creare segnali topografici attraverso incisione superficiale. Il movimento dello stilo può essere programmata in passi di 10 micron in X, Y e Z. Le scanalature modellate erano in grado di orientare le cellule staminali mesenchimali, influenzando ad adottare una morfologia allungata in allineamento con la direzione dei solchi. Il patterning potrebbe essere progettato utilizzando il software tracciare linee rette, cerchi concentrici, e onde sinusoidali. In una procedura successiva, fibroesplosioni e le cellule staminali mesenchimali sono stati sospesi in una gelatina bioink 2%, per bioprinting in una contropressione guidato di estrusione della testina di stampa. Il bioink cuscinetto cella è stata poi stampata utilizzando le stesse coordinate programmate utilizzate per l'incisione. Le cellule bioprinted erano in grado di rilevare e reagire alle caratteristiche incise come dimostrato dal loro orientamento allungata lungo la direzione delle scanalature incise.
Introduction
Il patterning deliberata di posizionamento cellulare consente la formazione di culture che imitano in vivo organizzazione cellulare 1. In effetti, la ricerca l'interazione tra più tipi di cellule può essere assistito da organizzare la loro collocazione spaziale 2,3. La maggior parte dei sistemi di patterning si basano su procedure di modifica della superficie per favorire o impedire l'adesione delle cellule con successiva deposizione delle cellule passiva. Bioprinting offre un controllo spaziale e temporale su distribuzioni cella 1. Oltre a queste funzioni, bioprinting è stato descritto come un metodo tecnicamente semplice, rapida ed economica per generare scaffold geometricamente complesse 4. Utilizza software di progettazione e consente l'introduzione di cellule nel processo di fabbricazione 4.
Sistemi Bioprinting sono stati classificati in base alle loro principi di funzionamento il laser a base, a getto d'inchiostro a base o di estrusione a base di 4. Estrusione bioprinting è stato descritto come il più promettente in quanto permette la realizzazione di costrutti organizzati di dimensioni clinicamente rilevanti entro un lasso di tempo realistico 4-6. E 'eseguita da una pressione meccanica o posteriore di estrusione assistito di un idrogel bioink cuscinetto cellule. Nel metodo qui presentato, è stato impiegato contropressione. Come accennato, le cellule vengono consegnati in un bioink cytocompatible. Tale bioink dovrebbe sostenere la fornitura di cellule senza produrre deleteria sollecitazione di taglio, e di essere di una viscosità sufficiente a mantenere l'integrità della traccia stampata, senza collassare o diffusione (denominato "spurgo inchiostro") 7-10.
L'interazione delle cellule con la loro superficie di adesione è noto per influenzare il comportamento cellulare. La topografia della superficie può controllare la forma delle cellule, l'orientamento 11, e anche il fenotipo. In particolare, la realizzazione di scanalature e canali sono stati dimostrati per indurreun allungato, morfologia allungata su diversi tipi di cellule. L'adozione di questa morfologia è stato trovato per influenzare il fenotipo di cellule multipotenti e pluripotenti. Ad esempio, quando allineato scanalature, cellule staminali mesenchimali (MSC) mostrano segni di differenziamento verso cardiomiociti 12,13 e cellule muscolari lisce vascolari adottare il fenotipo contrattile sul sintetico 10,14-17.
La cella allineando canali o scanalature può essere generato su una superficie polimerica tramite un certo numero di metodi, per esempio, profonda attacco con ioni reattivi, litografia a fascio elettronico, stampa laser diretta, laser a femtosecondi, fotolitografia e attacco a secco plasma 18. Questi approcci sono spesso lunghi, richiedono apparecchiatura complessa e può essere limitante nella forma del modello generato. Inoltre, essi non si sincronizzano con patterning bioprinting e non consentono cellularization immediato. Il movimento coordinato controllato di un sistema automatizzatosistema di erogazione può seguire schemi complessi per la deposizione di soluzioni. Qui mostriamo come il movimento microscala controllata può essere sfruttata per creare canali per l'orientamento delle cellule. Uno stilo o bisturi affilato è collegata alla testina di stampa al posto della siringa estrusione e le attrezzature possono incidere la superficie del polimero sotto la guida del software di tracciatura. Il metodo offre versatilità nella progettazione del modello ed è applicabile ai materiali polimerici comunemente utilizzati in bioingegneria come polistirolo, PTFE, e policaprolattone. Come fase successiva alla incisione, le cellule possono essere bioprinted direttamente alle scanalature graffiati. Il bioink gelatina utilizzato qui è stato in grado sia di mantenere la traccia e consentire alle cellule depositate per rilevare la funzionalità incise. Le cellule staminali mesenchimali bioprinted alle scanalature incise sono state dimostrate per allungare lungo loro in linee distinte.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo descrive l'uso di una contropressione assistita sistema di erogazione robotico (Figura 1A) come incisione della superficie (Figura 1B) e bioprinter estrusione-based (Figura 1C) 10.
1. Modifica di una superficie polistirolo
- Utilizzare 1 fogli mm di polistirene da piastre di coltura dei tessuti in polistirene tendono a piegarsi verso l'alto al centro, rovinando la consistenza altezza sia incisione e la stampa.
NOTA: i fogli di polistirolo non sono modificati per l'adesione cellulare, viene eseguito il trattamento al plasma. - trattamento al plasma di ossigeno.
- Innanzitutto, selezionare una pressione di 2 bar sul regolatore del cilindro di ossigeno collegato alla macchina plasma. Poi accendere la macchina del plasma e l'ingresso alle seguenti condizioni nel pannello di controllo della macchina: 150 W, 30 SSCM di ossigeno, 10 min (per il potere, il flusso del gas e del tempo, rispettivamente).
- Posizionare il Substrat polistirolovia e nella camera di plasma, sigillare la porta e premere il pulsante di avvio sul pannello di controllo. Bagnare il plasma di ossigeno polistirene trattata substrato in siero bovino fetale e incubare a 37 ° C per 2 ore prima del lavaggio tre volte 1x tampone fosfato salino (PBS).
2. I modelli di programmazione di stampa
- Utilizzare il programma per primo Etch la superficie con uno stilo o bisturi.
- Quando si utilizza uno stilo, inserire un ago tessili 1,5 millimetri di diametro (dall'interno con grande cura) nell'ugello di una siringa di erogazione (5 o 10 ml) fino a quando non viene incastrato e fissato. Se si utilizza un bisturi, scegliere un bisturi rotondo maneggiati in modo che possa essere fissato nel meccanismo di fissaggio del braccio di stampa.
NOTA: Lo stilo incide modelli curvi meglio del bisturi. - Quando si tenta prima di creare una disposizione bioprinted, disegnare il modello desiderato su carta millimetrata con assi numerati per generare le coordinate XY. Quindi ionput le coordinate del modello inciso / bioprinted nel software foglio di calcolo (Figura 2).
NOTA: Il "modello desiderato" può essere in molte forme come lineari, a forma di S, o circolare. La scelta dipende dal modello sperimentale richiesta, come ad esempio le linee lineari parallele per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per cardiomiociti come dimostrato qui. La funzione di grafico a dispersione permette la visualizzazione del pattern grafico proposto. - Aprire la stampa / software di erogazione. Selezionare "Programma> Aggiungi programma", seguito da "Modifica> Aggiungi punto" per impostare il programma. Esportare il xey coordinate valori ottenuti dal foglio di calcolo nella stampa / erogazione software utilizzando il "copia e incolla" la funzione.
- Calibrare il "z" altezza del robot prima di ogni corsa in modo da mettere l'ugello stilo / stampa sulla superficie.
- Nella stampa / software di erogazione, selezionare l'opzione "Robot", cliccare su "Modifica della modalità &# 34; e attivare l'opzione "modalità di insegnamento". Una volta selezionato, il software consente la funzione "Jog" del robot.
- Fare jogging, prima inizializzare il robot nella posizione predefinita selezionando i seguenti comandi dalla barra dei menu; "Robot> Meca inizializzazione", quindi selezionare "Robot> Jog". Input i valori numerici (in mm) nelle "slot X e Y" necessari per posizionare lo stilo esattamente sulla origine del pattern.
- Quindi, immettere un valore numerico (in mm) nella "fessura Z" per posizionare l'ugello stilo o la stampa a contatto con la superficie, ma non flex o rientro della superficie. Questo punto è designato come valore di partenza "Z".
NOTA: La profondità di ogni scanalatura può essere variata facilmente usando la Z-altezza del sistema. Scanalature di 40, 80 e 170 micron sono dimostrati per tagliare nella superficie di 1 mm di spessore fogli di polistirene (Figura 4 e Tabella 1).
- Selezionare il pistruzioni Rint per ciascuno dei punti di coordinate, vale a dire, "Avvio della linea di erogazione" per definire il primo punto e l'iniziazione di stampa, "linea che passa" per designare i punti intermedi e "End of Line Dispense" per segnalare al robot di risolvere il tiratura.
- Comunicare il programma per il robot selezionando i comandi successivi dalla barra dei menu in alto: "Robot> Invia C & T dati".
- Avviare l'incisione corsa / stampa, modificando il robot in modalità "Run". A tale scopo, selezionando "Robot> Modifica della modalità> Switch Mode Run" dalla barra dei menu in alto.
- Avviare la procedura di stampa, premendo il tasto "Start" verde sulla console dispenser robot.
- Quando si utilizza uno stilo, inserire un ago tessili 1,5 millimetri di diametro (dall'interno con grande cura) nell'ugello di una siringa di erogazione (5 o 10 ml) fino a quando non viene incastrato e fissato. Se si utilizza un bisturi, scegliere un bisturi rotondo maneggiati in modo che possa essere fissato nel meccanismo di fissaggio del braccio di stampa.
3. Preparazione e stampa di Cell contenenti gelatina Bioink
- Sciogliere 2% di gelatina in Minimum Essential Media Alpha Media (αMEM) (supplementato con 10% FBS e 2% antibiotico / antimycotic) a 60 ° C per 2 ore per preparare le soluzioni bioink.
- Pre-cultura della Proteina Fluorescente Rosso esprimendo cellule staminali mesenchimali (MSC-RFP) al 70% di confluenza in 10 cm piatti di coltura utilizzando αMEM / 10% FBS. Rilasciare le cellule attaccate in sospensione rimuovendo il mezzo e rivestimento con una soluzione di tripsina-EDTA 1x per 5 min a 37 ° C.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 1.000 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule in 0,5 ml di PBS 1x e contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro.
- Dopo aver lasciato la bioink raffreddare a temperatura ambiente, mescolare delicatamente in un volume sufficiente per la sospensione di RFP-MSC nel bioink per ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule ml -1.
- Versare il bioink cuscinetto cella in una siringa di stampa con l'ugello sigillato. Raffreddare la siringa caricata a 4 ° C per raggiungere una viscosità stampabile.
- Posizionare la siringa caricata sul automatizzatosistema di distribuzione robotizzato e fissare le linee di pressione dell'aria. Rimuovere la siringa tenuta Luer e attaccare l'ugello di stampa.
- Estrudere la bioinks cellularized in linee sottili utilizzando 0,05 MPa contropressione, a 5 mm / sec velocità di scrittura da una siringa da 10 ml con una 27 ago G / ugello (stretti consigliato sopra cilindrica) su una superficie del film di polistirene, a seguito della deposizione di pre-programmati modello descritto al punto 2.1 per posizionare il bioink cellularized sulle scanalature pre-incise.
- Dopo 1 ora di incubazione a temperatura ambiente, si aggiungono 10 ml mezzi di crescita (supplementato con 10% FBS e antibiotici) e incubare le cellule per 24 ore (per permettere alle cellule di senso e reagiscono alle caratteristiche incise) prima di visualizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito a 10X di ingrandimento.
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Representative Results
I risultati rappresentativi dimostrano che il sistema di applicazione robotizzata contropressione assistita può essere utilizzato come bioprinter estrusione-based per effettuare sia l'incisione superficiale e la stampa bioink (Figura 1 A). Può essere usato per la generazione di scanalature incise in superfici polimeriche, e per stampare successivamente un bioink cuscinetto cellule direttamente alle caratteristiche (Figura 1 B e C).
Sia l'incisione e la stampa sono determinati dalle coordinate programmate (Figura 2) immissione nel / software di stampa erogazione che permette di stampare lineare, curva e modelli radiali come richiesto per l'applicazione (Figura 3 AC). Le impostazioni asse Z consentono il controllo della profondità della scanalatura acidato (figura 4 e Tabella 1).
dopo la sostituzionelo stilo con una testina di stampa idrogel, la programmazione che coordina l'attacco potrebbe essere riutilizzato per consentire al sistema di erogazione robotico per consegnare il bioink cuscinetto cellule direttamente alle scanalature incise seguenti lo stesso disegno (Figura 3 D ed E). Come si può osservare in figura 5 A e B, le cellule staminali seminate dal bioprinting ai bioink eventualmente sedimenti in superficie, e il senso e allungare lungo la direzione dell'incisione entro linee discrete. Le cellule seminate in terreno di coltura senza bioprinting allineate nella direzione delle caratteristiche, tuttavia, hanno coperto l'intera superficie (Figura 5 C), dimostrando che il bioink vincola cellule alla traccia stampata. Senza caratteristiche incise, cellule seminate in terreni di coltura non mostrano l'orientamento o di allineamento (Figura 5 D).
Figure 1:. Il sistema di erogazione automatico robotizzato (A) L'apparecchio è stato personalizzato con l'inserimento di uno stilo affilato (fissato in una siringa) centrale per la testina di stampa che incide anelli concentrici su un vetrino polistirene (B). La testina di stampa potrebbe essere convertita per estrudere cuscinetto cellule gelatina bioink, con contropressione assistita estrusione e deposito sul modello precedentemente inciso (C). Questa cifra è stata modificata da Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 2: Rappresentazione grafica coordinate XY in un foglio elettronico La presa schermata mostrata qui dimostra che il tracciato xy coordinate creato un modello d'onda sinusoidale, come mostrato dalla trama del grafico.. Queste coordinate sono state inserite nel software tracciato utilizzando il copia / incollafunzione.
Figura 3:. Inciso Reticolo versatilità Le coordinate programmate nel software di tracciatura stati in grado di incidere lineare (A), sinusoidale (B) e cerchi concentrici (C). Le scanalature incise in polistirene possono essere stampate direttamente sul con il bioink idrogel durante la successiva fase (D) e (E). Questa cifra è stata modificata da Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 4:. Inciso profondità di scanalatura La profondità del solco inciso può essere regolata dal controllo asse z del sistema di erogazione. Immagini (A) (C) visualizza il vista dall'alto e(D) (E) mostra la sezione trasversale. Il robot è stato programmato per etch la superficie ad una profondità di 40 ((A) e (D)), 90 ((B) e (E)) e 180 micron ((C) e (F)). La vicinanza della profondità programmata ed effettiva profondità inciso viene visualizzato nella tabella 1. Questa cifra è stata modificata da Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 5: Bioink consegnato cellule staminali mesenchimali RFP-MSC stampate nel bioink sui modelli incisi potrebbero rilevare le caratteristiche come dimostrato dalla loro morfologia allungata e l'allineamento con le scanalature (A) e (B) rispetto alle cellule seminate su. caratteristiche senza bioink (vale a dire, in un terreno di coltura) (C </ strong>) e su una superficie non modellata (D). Questa cifra è stata modificata da Bhuthalingam et al. 2015 10.
| Profondità programmata (micron) | Profondità della scanalatura acidato (micron) |
| 40 | 35 ± 7 |
| 90 | 81 ± 6 |
| 180 | 175 ± 3 |
Tabella 1:. Confronto tra programmata contro la profondità di incisione effettiva su polistirolo Questa cifra è stata modificata da Bhuthalingam et al 2015 10..
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Discussion
La fase critica di questa procedura è la consegna bioprinting reale delle cellule staminali come il processo deve consentire di sedimentazione delle cellule alle caratteristiche, di stampa senza la diffusione bioink / sanguinamento, fornire cellule senza morte cellulare sforzo di taglio e non innescare la differenziazione verso lignaggio indesiderati.
Se l'allineamento delle cellule previsto non si verifica, quindi la viscosità bioink dovrebbe essere valutato per la sua idoneità per la stampa. È importante che il bioink permette alle cellule di sedimentare alla superficie del polimero modellata. La concentrazione del polimero bioink può essere ridotto o la sua temperatura aumentata (fino ad un massimo di 37 ° C), per ridurre la viscosità e promuovere la sedimentazione delle cellule. Tuttavia, queste riduzioni possono causare il bioink a diffondersi dopo stampa / spurgo. Qui si consiglia di utilizzare il 2% di gelatina (w / v) disciolto in PBS 1x. Se il post-stampa concentrazione cellulare appare ridotto, quindi la sollecitazione di taglio indotto da stampa potrebbe aver compromesso lavitalità delle cellule stampati 7. Controllare le cellule nel bioink prima e dopo la stampa utilizzando un test di vitalità, come l'attivazione di resazurina fluoresence 7. Inoltre, se le cellule staminali bioprinted contatto con la superficie, ma non si allineano, allora è possibile la sollecitazione di taglio durante la stampa è diminuita la loro multipotenza innescando un percorso di differenziazione indesiderato. Messaggio stemness stampa può essere valutata da cellule fluorescenza-attivato l'analisi di smistamento (FACS) utilizzando marcatori di cellule staminali, come CD 29 10,19,20. Se è trovato che la sollecitazione di taglio sta avendo effetti deleteri sulle cellule, allora la viscosità di stampa bioink può essere ridotta aggiungendo o sostituendo il polimero bioink con una cesoia diradamento uno, ad esempio alginato, Pluronic F127, acido ialuronico, gellano, gelatina metacrilato o polietilene ossido 19, 21-25.
Infine, altri aspetti che possono essere ottimizzate includono la contropressione di stampa, bioink densità cellulare,e diametro dell'ugello. La contropressione richiede l'ottimizzazione della viscosità del bioink e può essere modificata per ottenere una traccia ininterrotta discreta. Una concentrazione elevata di cellule può aumentare la viscosità bioink e ostruire la testina di stampa. Tuttavia, questo processo di estrusione non consentire la stampa di densità relativamente più elevati rispetto ad altri metodi di cellule bioprinting 26,27. La selezione del misuratore ugelli di stampa deve essere considerato dal ugelli di piccolo diametro può produrre una traccia più fine, ma saranno soggetti a intasamento. Ugelli conici sono stati trovati per funzionare meglio poiché la stessa portata può essere realizzato come un boccaglio cilindrico ma ad un minore sforzo di taglio quindi migliorata vitalità cellulare 28.
Il metodo di deposizione assistita contropressione, noto anche come estrusione bioprinting, ha meno risoluzione rispetto ad altri approcci stampa cellule come a getto di inchiostro e la metodologia laser assistita dovuto alla minima lunghezza del passo programmabile e la diffusione del emerging bioink. Tuttavia, l'apparecchiatura contropressione estrusione viene più facilmente modificato per l'inserimento di uno stilo incisione. Altri metodi di scanalature producono come micro-patterning con fotolitografia seguito da stampaggio PDMS hanno significativamente più passaggi rispetto alla incisione robotica e il metodo è meno versatile a modificare i modelli esistenti o la produzione di nuovi 12,15,29-31.
Questo metodo offre uno strumento per lo studio in vitro delle interazioni cellula dove la posizione, l'orientamento e la disposizione di uno o più tipi di cellule sono importanti. Diversi tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali, fibroblasti e cellule muscolari lisce sono noti per allineare su solchi superficiali 1,10,14,18. I modelli incisi, qui presentati, possono essere modificati e ristampato molto rapidamente e con facilità. Ciò è di interesse patterning superficie con scanalature è stato utilizzato nello studio di adesione cellulare, la morfologia, migrazione e differenziazione delle cellule staminali. Inoltre, it è stata applicata anche a neurale e l'ingegneria dei tessuti muscolo-scheletrico 18, 32,33. Poiché le scanalature svolgono un ruolo nella differenziazione cellulare o regolamento fenotipo per diversi tipi di cellule, questo metodo può essere utilizzato per creare scanalature, per aiutare differenziazione e di depositare celle di righe discrete in modo che gli schermi possono essere eseguite. Attualmente, stiamo valutando questo metodo per promuovere la disposizione delle cellule anisotropo di cellule per la produzione di fogli di cellule cardiomiociti, come l'orientamento cellulare è importante per la funzione del tessuto cardiaco 12-14,34.
L'approccio dimostrato qui impiega un bioink solubile che alla fine dissipare. Tuttavia, se è richiesta una copertura idrogel più permanente, poi l'inserimento di transglutaminasi microbica può attraversare-link e stabilizzare idrogel di proteine come quelli a base di gelatina senza effetti negativi sulle cellule 9, 35. Bioinks possono anche utilizzare polimeri metacrilato per UV avviato crosslinking di cellule cuscinetto idrogel in maniera cytocompatible 36. Tuttavia, nella nostra esperienza, è stato trovato che la reticolazione transglutaminasi conferito per una migliore interazione tra l'idrogel e superficie polimerica (meno facilmente delaminated), e un ambiente più cytocompatible rispetto ai poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) idrogel 37.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
- Ma, Z., et al. Cell and Organ Printing. Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P. , Springer. Netherlands. 137-159 (2010).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 123-152 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Skardal, A. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 1-17 (2015).
- Irvine, S. A., et al. Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking. Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).
- Bhuthalingam, R., et al. A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation. International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
- Tay, C. Y., et al. Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage. Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).
- Tay, C. Y., et al. Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation. Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).
- Li, H., et al. Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells. Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).
- Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces. Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).
- Agrawal, A., et al. Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels. International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).
- Chang, S., et al. Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate. PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).
- Li, Y., et al. Engineering cell alignment in vitro. Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).
- Blaeser, A., et al. Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity. Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).
- Nery, A. A., et al. Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications. Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).
- Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).
- Markstedt, K., et al. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Merceron, T. K., Murphy, S. V. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 249-270 (2015).
- Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. Yoo, J. J. , Academic Press. 229-248 (2015).
- Lee, K. V., et al. Bioprinting in Regenerative Medicine. Turksen, K. , Springer International Publishing. 33-66 (2015).
- Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
- Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process. Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).
- Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface. Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids. Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
- Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Béduer, A., et al. Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning. Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).
- Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues. Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).
- Chen, P. Y., et al. Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase. Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).
- Zhao, X., et al. 3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface. Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).
