Abstract
Este manuscrito descreve a introdução de características de orientação de células seguindo-se a entrega directa de células para estas funcionalidades de uma bioink hidrogel utilizando um sistema de distribuição robotizado e automatizado. O bioink particular foi selecionado como ele permite que as células para sedimentar direção e sentido os recursos. O sistema de distribuição bioprints células viáveis em bioinks hidrogel usando uma cabeça de impressão de contrapressão assistida. No entanto, através da substituição da cabeça de impressão com um estilete ou bisturi afiado, o sistema de distribuição também pode ser empregada para criar pistas topográficas através de condicionamento de superfície. O movimento caneta pode ser programada em passos de 10 um nos sentidos de X, Y e Z. Os sulcos estampados foram capazes de orientar células-tronco mesenquimais, influenciando-os a adotar uma morfologia alongada em alinhamento com a direção dos sulcos. O padrão pode ser concebido usando o software de plotagem em linhas retas, círculos concêntricos, e ondas senoidais. Em um processo subsequente, fibroe blastos de células estaminais mesenquimais foram suspensos numa bioink gelatina a 2%, para bioprinting num cabeçote de extrusão accionado contrapressão. O bioink rolamento de células foi então impressa utilizando as mesmas coordenadas programadas utilizados para a decapagem. As células bioprinted foram capazes de detectar e reagir às características gravadas como demonstrado pela sua orientação alongada ao longo da direcção das ranhuras gravadas.
Introduction
A padronização deliberada de posicionamento de célula permite a formação de culturas que imitam in vivo uma organização celular. Na verdade, a investigação sobre a interacção entre vários tipos de células pode ser assistido por organizar a sua 2,3 colocação espacial. A maioria dos sistemas de padrões dependem de procedimentos de modificação de superfície para promover ou prevenir a adesão celular com a deposição de células passiva subseqüente. Bioprinting oferece controle espacial e temporal sobre distribuições de células 1. Além destas funções, bioprinting foi descrito como sendo um método tecnicamente simples, rápido e de baixo custo para a geração de andaimes geometricamente complexas 4. Ele utiliza software de design de computador e permite a introdução de células para o processo de fabricação 4.
Sistemas bioprinting foram classificados com base em seus princípios de trabalho como laser baseados, à base de jato de tinta ou extrusão baseados em 4. Extrusão bioprinting foi descrito como o mais promissor, uma vez que permite a fabricação de construções organizados de tamanhos clinicamente relevantes dentro de um período de tempo realista 4-6. É realizada por qualquer pressão mecânica ou para trás extrusão assistida de um hidrogel bioink rolamento celular. No método aqui apresentado, foi empregue a pressão de retorno. Como mencionado, as células são entregues em um bioink cytocompatible. Tal bioink deve suportar a entrega de células sem produzir esforço de corte deletério, e ser de uma viscosidade suficiente para manter a integridade do traço impressa, sem entrar em colapso ou espalhamento (referido como "tinta de sangria") 7-10.
A interacção das células com a superfície aderente é conhecido para influenciar o comportamento celular. A topografia da superfície pode controlar a forma das células, orientação 11, e ainda o fenótipo. Em particular, a fabricação de sulcos e canais têm demonstrado induzirum esticado, morfologia alongada em vários tipos de células. A adopção desta morfologia foi encontrado para influenciar o fenótipo de células multipotentes e pluripotentes. Por exemplo, quando alinhadas em ranhuras, as células estaminais mesenquimais (MSC) mostram evidências de diferenciação em direcção cardiomiócitos 12,13 e células musculares lisas vasculares adoptar o fenótipo contráctil sobre o sintética 10,14-17.
A célula alinhando canais ou ranhuras pode ser gerado numa superfície polimérica por meio de uma série de métodos, por exemplo, gravação iónica reactivo profundo, litografia de feixe de electrões, impressão a laser directo, femtosecond laser, fotolitografia e ataque químico de plasma seco 18. Estas abordagens são frequentemente demorados, exigem aparelhos complexos e podem ser limitante na forma do padrão gerado. Além disso, eles não sincronizar padronização com bioprinting e não permitem celularização imediata. O movimento coordenado controlada de um automatizadoSistema de distribuição pode seguir padrões complexos para a deposição de soluções. Aqui demonstramos como o movimento controlado por microescala pode ser aproveitada para criar canais para orientação de células. Uma caneta ou bisturi afiada está ligado à cabeça de impressão em lugar da seringa e o equipamento de extrusão pode, em seguida, gravar a superfície de polímero sob a orientação do software trama. O método oferece uma versatilidade na concepção padrão e é aplicável a materiais poliméricos normalmente usados em bioengenharia, tais como poliestireno, de PTFE, e policaprolactona. Como um passo subsequente para a decapagem, as células podem ser bioprinted directamente aos sulcos riscados. O bioink gelatina utilizada aqui foi capaz de manter tanto o traço e permitir que as células depositadas para detectar as características gravadas. As células estaminais mesenquimais bioprinted aos sulcos gravados foram demonstrados para alongar ao longo delas em linhas distintas.
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Protocol
NOTA: Este protocolo descreve a utilização de uma contra-pressão assistida sistema de distribuição robótico (Figura 1A) como uma superfície de gravação (Figura 1B) e bioprinter à base de extrusão (Figura 1C) 10.
1. Alteração de uma superfície de poliestireno
- Use 1 folhas mm de poliestireno desde placas de cultura de tecidos de poliestireno tendem a se curvar para cima no centro, arruinando a consistência altura de ambos gravura e impressão.
NOTA: Como as folhas de poliestireno não são modificados para a adesão celular, o tratamento de plasma é realizado. - Oxigénio tratamento com plasma.
- Primeiro, selecione uma pressão de 2 bar no regulador do cilindro de oxigênio acoplado à máquina de plasma. Em seguida, desligar a máquina de plasma e a entrada das seguintes condições para o painel de controlo do equipamento: 150 W, 30 sscm de oxigênio, 10 min (para o poder, o fluxo de gás e tempo respectivamente).
- Coloque o substrat poliestirenode e para a câmara de plasma, selar a porta e pressione o botão Iniciar no painel de controle. Embeber o plasma de oxigénio substrato de poliestireno tratado em soro fetal bovino e incubar a 37 ° C durante 2 h antes de lavar três vezes com fosfato 1x solução salina tamponada (PBS).
2. Padrões de programação de impressão
- Usar o Programa para a Primeira Etch a superfície com um estilete ou bisturi.
- Quando se utiliza um estilete, inserir uma agulha têxtil diâmetro de 1,5 mm (a partir do interior com grande cuidado) para dentro do bocal de uma seringa de distribuição (5 ou 10 ml) até que se torne em cunha e protegidas. Se usando um bisturi, escolher um bisturi rodada manipulados de modo que pode ser fixado no mecanismo de fixação do braço de impressão.
NOTA: A caneta grava padrões curvos melhor do que a lâmina de bisturi. - Quando a primeira tentativa de criar um arranjo bioprinted, esboçar o padrão desejado no papel de gráfico com eixos numerados para gerar as coordenadas XY. Então eunput as coordenadas gravado padrão / bioprinted para o software de planilhas (Figura 2).
NOTA: O "padrão desejado" pode ser em muitas formas, tais como linear, em forma de S, ou circular. A escolha depende do modelo experimental necessária, como linear linhas paralelas para a diferenciação das MSCs para cardiomiócitos, como demonstrado aqui. A função de gráfico de dispersão permite a visualização do padrão enredo proposto. - Abra o / software de distribuição de impressão. Selecione "Programa> Adicionar programa" seguido de "Editar> Adicionar ponto" para configurar o programa. Exportar o x e y valores de coordenadas obtidas a partir da folha de cálculo para a impressão / distribuição de software usando o "Copiar e colar" a função.
- Calibrar a altura de "z" do robô antes de cada execução, a fim de colocar o bico stylus / impressão sobre a superfície.
- Na cópia do software / distribuição, selecione a opção "Robot", clique em "Alterar Modo &# 34; e habilitar a opção "Modo de Ensino". Uma vez selecionado, o software permite a função "Jog" do robô.
- Para correr, primeiro inicializar o robô para sua posição padrão, selecionando os seguintes comandos a partir da barra de menu; "Robot> Meca Inicializar" e selecione "Robot> Jog". Introduzir os valores numéricos (em mm) no "slots de X e Y" necessários para colocar a caneta exactamente sobre a origem do padrão.
- Em seguida, a entrada de um valor numérico (em mm) no "slot de Z" para colocar o bico de caneta ou impressão em contato com a superfície, mas não flexível ou recuar a superfície. Este ponto é designado como "Z" valor de partida.
NOTA: A profundidade de cada ranhura podem ser variadas facilmente utilizando o Z-altura do sistema. As ranhuras de 40, 80, e 170 ^ M são demonstrados para cortar a superfície de 1 mm de espessura folhas de poliestireno (Figura 4 e Tabela 1).
- Selecione o pinstruções rint para cada um dos pontos coordenados, ou seja, "o início da linha Dispensar" para definir o primeiro ponto eo início de impressão, "Linha de Passe" para designar os pontos intermédios e "Fim da Linha Dispensar" para sinalizar para o robô para terminar a Tiragem.
- Comunique-se o programa para o robô, selecionando os comandos acompanhamento a partir da barra de menu superior: "Robot> Enviar C & T de dados".
- Iniciado o condicionamento run / impressão, alterando o robô para o modo "Run". Faça isso selecionando "Robot> Modo Mudando> Transferir o modo Run" na barra de menu superior.
- Iniciar o procedimento de impressão, premindo o botão "start" verde na consola dispensador robô.
- Quando se utiliza um estilete, inserir uma agulha têxtil diâmetro de 1,5 mm (a partir do interior com grande cuidado) para dentro do bocal de uma seringa de distribuição (5 ou 10 ml) até que se torne em cunha e protegidas. Se usando um bisturi, escolher um bisturi rodada manipulados de modo que pode ser fixado no mecanismo de fixação do braço de impressão.
3. Preparação e Impressão de Gelatina Bioink contendo celular
- Dissolve-se 2% de gelatina em Meio Mínimo Essencial alfa Médio (aMEM) (suplementado com 10% de FBS e 2% de antibiótico / antimycotIC) a 60 ° C durante 2 horas para preparar as soluções bioink.
- Pré-cultura da proteína vermelha fluorescente expressando células-tronco mesenquimais (RFP-MSCs) a 70% de confluência em 10 cm placas de cultura de tecido, utilizando aMEM / 10% FBS. Libertar as células ligadas em suspensão por remoção do meio de revestimento e com uma solução de tripsina-EDTA 1x durante 5 min a 37 ° C.
- Agregar as células por centrifugação a 1000 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 0,5 mL de PBS 1x e contar a densidade de células utilizando um hemocitómetro.
- Depois de deixar a bioink arrefecer até à temperatura ambiente, misturar suavemente num volume suficiente para a suspensão de RFP-MSCs no bioink para atingir uma concentração final de 5 x 10 6 mL -1 células.
- Verter a bioink rolamento de células dentro de uma seringa de impressão com o bocal fechado. Arrefecer a seringa carregada a 4 ° C a fim de atingir uma viscosidade de impressão.
- Colocar a seringa carregada no automatizadosistema de distribuição de robótica e anexar as linhas de pressão de ar. Retire a seringa Luer selo e anexar o bocal de impressão.
- Faça a extrusão do bioinks celularizados em linhas finas usando 0,05 MPa pressão de retorno, a 5 mm / seg velocidade de escrita a partir de uma seringa de 10 ml através de um 27 G agulha / bico (afuniladas recomendado sobre cilíndrica) sobre uma superfície de película de poliestireno, após a deposição pré-programado padrão descrito no passo 2.1 a colocar o bioink celularizado para as ranhuras pré-gravadas.
- Após incubação de 1 h à temperatura ambiente, adicionam-se 10 ml de meio de crescimento (suplementado com 10% FBS e antibióticos) e incuba-se as células durante 24 h (para permitir que as células para detectar e reagir às características gravadas) antes da visualização usando um microscópio de fluorescência invertido a 10X de ampliação.
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Representative Results
Os resultados representativos demonstram que o sistema de dispensa robótico contrapressão assistida pode ser usado como um bioprinter à base de extrusão para a realização de ambos gravura e impressão bioink superfície (Figura 1 A). Ele pode ser usado para a geração de ranhuras gravadas em superfícies de polímeros, e, subsequentemente, para imprimir uma bioink rolamento célula directamente para as características (Figura 1 B e C).
Tanto a gravura e impressão são determinadas pelas coordenadas programadas (Figura 2) entrada na impressão do software / distribuição que permite a impressão de linear, curvas e padrões radiais como necessários para a aplicação (Figura 3 AC). As configurações do eixo Z para permitir que o controlo da profundidade do sulco gravado (Figura 4 e Tabela 1).
Depois de substituira caneta com uma cabeça de impressão de hidrogel, a programação que coordenada a decapagem podia ser reutilizada para permitir que o sistema de dispensa robótico para entregar o bioink rolamento célula directamente para as ranhuras gravadas seguindo o mesmo modelo (Figura 3 D e E). Como pode ser observado na Figura 5 A e B, as células estaminais semeadas por bioprinting dentro do sedimento bioink, eventualmente para a superfície, e detectar e alongada ao longo da direcção do processo de ataque no prazo de linhas discretas. As células semeadas em meio de cultura sem bioprinting alinhado na direcção das características, no entanto, que coberto toda a superfície (Figura 5 C), provando que o bioink restringe as células para o rastreio da impresso. Sem características gravadas, as células semeadas em meios de cultura não mostram nenhuma orientação ou o alinhamento (Figura 5 D).
FiguRe 1:. O sistema de distribuição robotizado e automatizado (a) O aparelho foi personalizado com a inclusão de um estilete aguçada (fixada numa seringa) central para a cabeça de impressão que grava anéis concêntricos sobre uma lâmina de poliestireno (B). A cabeça de impressão pode ser então convertido para extrudir bioink gelatina rolamento célula, com a pressão de extrusão volta assistida, e depósito sobre o padrão previamente gravado (C). Este valor foi modificado a partir Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 2: Traçado de coordenadas XY em um software de planilha A captura de tela mostrado aqui demonstra que a xy plotados coordenadas criado um padrão de onda sinusoidal como mostra o gráfico de pontos.. Estas coordenadas foram inseridos no software de plotagem usando o copy / pastefunção.
Figura 3:. Gravado padrão versatilidade As coordenadas programadas no software trama foram capazes de gravar linear (A), sinusoidal (B) e os círculos concêntricos (C). As ranhuras gravadas em poliestireno pode ser directamente impressa sobre a bioink hidrogel durante o subsequente passo (D) e (E). Este valor foi modificado a partir Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 4:. Gravado profundidade do sulco A profundidade do sulco gravado pode ser regulada pelo controle do eixo Z do sistema de distribuição. Imagens de (A) a (C) mostra a vista de cima e(D) para (E) mostra a secção transversal. O robot foi programado para gravar a superfície até uma profundidade de 40 ((A) e (D)), 90 ((B) e (E)) e 180 uM ((C) e (F)). A proximidade da profundidade programada e profundidade gravado atual é mostrada na Tabela 1. Este valor foi modificado a partir Bhuthalingam et al. 2015 10.
Figura 5: Bioink entregue células estaminais mesenquimais a RFP-MSCs impressos no bioink para os padrões gravados pode sentir as características tal como demonstrado pela sua morfologia alongada e alinhada com as ranhuras (A) e (B) em comparação com células inoculadas na. características sem bioink (isto é, em meio de cultura) (C </ forte>) e sobre uma superfície não-modelado (D). Este valor foi modificado a partir Bhuthalingam et al. 2015 10.
| Profundidade programada (mm) | Profundidade do sulco gravado (mm) |
| 40 | 35 ± 7 |
| 90 | 81 ± 6 |
| 180 | 175 ± 3 |
Tabela 1:. Comparação de programada em função da profundidade de gravação concreto no poliestireno Esta figura foi modificado a partir do Bhuthalingam et ai 2015 10..
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Discussion
O passo crítico deste procedimento é a entrega bioprinting efectiva das células estaminais enquanto o processo deve permitir a sedimentação de células para as características, de impressão sem bioink espalhando / hemorragia, proporcionam células sem morte celular tensão de cisalhamento e não desencadeiam a diferenciação no sentido linhagem indesejado.
Se o alinhamento de células esperado não ocorrer, então a viscosidade bioink deve ser avaliado quanto à sua aptidão para a impressão. É importante que o bioink permite que as células sedimentar para a superfície do polímero modelado. A concentração do polímero bioink pode ser reduzido ou a sua temperatura aumentada (até um máximo de 37 ° C), para reduzir a viscosidade e promover a sedimentação de células. No entanto, estas reduções podem fazer com que o bioink para espalhar / sangramento impressão post. Aqui sugerimos o uso de 2% de gelatina (w / v) dissolvido em 1x PBS. Se a concentração de células pós-impressão parecer reduzida, então a tensão de cisalhamento induzida pela impressão pode ter comprometido aviabilidade das células impressos 7. Verificar as células na bioink antes e após a impressão utilizando um ensaio de viabilidade, tal como a activação de resazurina fluorescência 7. Além disso, se as células-tronco bioprinted contacto com a superfície, mas não se alinham, então é possível que a tensão de corte durante a impressão diminuíram a multipotência por desencadear uma via de diferenciação indesejada. Adicione stemness impressão pode ser avaliada por meio de análise de células activadas por fluorescência (FACS) utilizando marcadores de células estaminais tal como CD 29, 10,19,20. Se se verificar que a tensão de cisalhamento é ter efeitos deletérios sobre as células, em seguida, a viscosidade de impressão bioink pode ser reduzida através da adição ou substituição do polímero bioink com uma tesoura de desbaste um, tal como alginato, Pluronic F127, ácido hialurónico, goma de gelano, metacrilato de gelatina ou de óxido 19, 21-25 polietileno.
Finalmente, outros aspectos que podem ser optimizadas incluem a contrapressão de impressão, a densidade celular bioink,e diâmetro do bico. A contrapressão requer optimização para a viscosidade da bioink e pode ser alterado para se obter um rastreio ininterrupta discreta. A concentração de células de alta pode aumentar a viscosidade bioink e entupir a cabeça de impressão. No entanto, este processo de extrusão não permitir a impressão de densidades celulares relativamente mais elevados do que outros métodos bioprinting 26,27. A selecção do bocal medidor de impressão deve ser considerada uma vez que os bicos de pequeno diâmetro pode produzir um traço fino, mas irá ter tendência a obstruir-se. Bicos cónicos têm sido encontrados a funcionar melhor uma vez que a mesma taxa de fluxo pode ser obtida como um bocal cilíndrico, mas com uma tensão mais baixa de corte, portanto, melhora a viabilidade das células 28.
O método de deposição de contrapressão assistida, também referida como bioprinting extrusão, tem menos resolução do que outras abordagens de impressão celular, como jato de tinta e laser de assistida metodologia devido ao comprimento mínimo etapa programável e a propagação da emerging bioink. No entanto, o equipamento de extrusão de contrapressão é mais facilmente modificado para a inclusão de uma caneta de gravação. Outros métodos de ranhuras produtores, como micro-modelação, utilizando fotolitografia seguido por moldagem por PDMS têm significativamente mais etapas do que o condicionamento robótica e o método é menos versátil de modificar padrões existentes ou produzir novos 12,15,29-31.
Este método oferece uma ferramenta para o estudo in vitro de interacções de células, onde a posição, orientação, e o arranjo de um ou mais tipos de células são importantes. Vários tipos de células, incluindo células estaminais mesenquimais, f ibroblastos, células de músculo liso e são conhecidos para alinhar em ranhuras de superfície 1,10,14,18. Os padrões gravados, aqui apresentadas, pode ser modificado e reimpresso muito rapidamente e com facilidade. Isto é de interesse como padrões de superfície com ranhuras tem sido utilizada no estudo da adesão celular, a morfologia, a migração e a diferenciação das células estaminais. Além disso, it também foi aplicado para a engenharia de tecidos neurais e músculo-esquelética 18, 32,33. Uma vez que as ranhuras desempenham um papel na diferenciação celular ou regulação fenótipo para vários tipos de células, este método pode ser usado para criar ranhuras, para auxiliar a diferenciação e para depositar as células em filas separadas de modo que as telas podem ser executadas. Actualmente, estamos a avaliar este método para promover o arranjo de células anisotrópica de células para a produção de folhas de células de cardiomiócito, como a orientação celular é importante para a função do tecido cardíaco 12-14,34.
A abordagem aqui demonstrado emprega um bioink solúvel que acabará por se dissipar. No entanto, se uma cobertura de hidrogel mais permanente é necessário, em seguida, a inclusão de transglutaminase microbiana pode ligação transversal e estabilizar hidrogéis de proteína, tais como os baseados em gelatina sem efeitos adversos sobre as células 9, 35. Bioinks também podem utilizar polímeros metacrilado de UV iniciada crosslinking de hidrogeles tendo células na forma cytocompatible 36. No entanto, na nossa experiência, verificou-se que a reticulação de transglutaminase conferida por um melhor interacção entre o hidrogel e a superfície do polímero (menos facilmente deslaminado), e um ambiente mais cytocompatible quando comparado com o poli (etileno-glicol) diacrilato (PEGDA) hidrogel 37.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Robotic Dispensing System | Janome | 2300N | |
| Plasma Machine | Femto Science | Covance | |
| USB Microscope | |||
| Optical Microscope | Olympus | IX71 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Spreadsheet | Excel | Excel | |
| Printing Co-ordinate Software | Janome | JR C-Points | |
| Imaging Software | National Institutes of Health (NIH) | ImageJ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Stylus (Blade) | OLFA | AK-5 | |
| 5 ml printing syringe | San-ei Tech | SH10LL-B | |
| 30 G printing needle | San-ei Tech | SH30-0.25-B | |
| 1 mm polystyrene sheets | Purchased locally | ||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | ||
| Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A | Sigma Aldrich | 9000-70-8 | |
| αMEM | Invitrogen | 41061-029 | |
| Antibiotc antimycotic | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs) | Cyagen Biosciences Incorporation | RASMX-01201 |
References
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