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Neuroscience

Deafferentated माउस रेटिना के एक फ्लैट माउंट तैयारी में स्टारबर्स्ट amacrine कोशिकाओं के पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Published: October 13, 2016 doi: 10.3791/54608
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2,3
1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे एक फ्लैट माउंट तैयारी से रेटिना न्यूरॉन्स पर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए।

Abstract

स्तनधारी रेटिना एक बहुस्तरीय कई न्यूरोनल प्रकार से बना ऊतक है। समझने के लिए कैसे दृश्य संकेतों अपनी जटिल synaptic नेटवर्क के भीतर कार्रवाई कर रहे हैं, electrophysiological रिकॉर्डिंग अक्सर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हम माउस रेटिना के दोनों GCL (नाड़ीग्रन्थि सेल परत) और लीग में आनुवंशिक रूप से चिह्नित न्यूरॉन्स के पैच दबाना रिकॉर्डिंग (भीतर परमाणु परत) के लिए एक फ्लैट माउंट तैयारी अनुकूलित है। फ्लैट आरोह में रिकॉर्डिंग लीग न्यूरॉन्स स्लाइस पर इष्ट है क्योंकि दोनों ऊर्ध्वाधर और पार्श्व कनेक्शन पूर्व विन्यास में संरक्षित कर रहे हैं, बड़े पार्श्व घटकों के साथ रेटिना सर्किट की इजाजत देने का अध्ययन किया जा सकता है। हम इस तरह के कोलीनर्जिक बर्स्ट amacrine कोशिकाओं (थैलियों) के रूप में रेटिना में दर्पण भागीदारी न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है।

Protocol

नैतिक अनुमोदन - के रूप में संस्थागत पशु की देखभाल ने मंजूरी दे दी है और चिकित्सा के Baylor कॉलेज का प्रयोग समिति पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं, नियमों और अनुसंधान जानवरों के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के नियमों के अनुसार आयोजित की गई।

1. बाहरी और आंतरिक समाधान

  1. रेटिना विच्छेदन के दौरान और बाद में electrophysiological रिकॉर्डिंग में बाहरी समाधान के रूप में स्तनधारी घंटी समाधान का प्रयोग करें। रिकॉर्डिंग के दिन 10x शेयर समाधान (कैल्शियम के बिना) से स्तनधारी घंटी समाधान तैयार है, और carbogenation के 15 मिनट (95% 2 हे और 5% सीओ 2) के बाद 2 CaCl बूंद के लिहाज से जोड़ें। अंतिम 1x समाधान (मिमी में) शामिल हैं: 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0.8 ना 2 HPO 4, 0.1 नः 2 पीओ 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 और 10 डी ग्लूकोज।
  2. सैक दोलनों को चिह्नित करने के लिए दो आंतरिक समाधान का प्रयोग करें। परीक्षणवयस्क माउस RGCs पर लंबे समय तक पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग में तैयार समाधान की उपयोगिता और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक 500 μl aliquots में सत्यापित बैचों की दुकान।
    1. झिल्ली क्षमता दोलन की रिकॉर्डिंग के लिए, एक पोटेशियम आधारित आंतरिक समाधान है कि (मिमी) शामिल हैं का उपयोग करें: 125 कश्मीर gluconate, 8 सोडियम क्लोराइड, 4 एटीपी मिलीग्राम, 0.5 ली जीटीपी, 5 EGTA, 10 HEPES और 0.2% biocytin (डब्ल्यू / v)। KOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें।
    2. उत्तेजक और निरोधात्मक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं रिकॉर्डिंग के लिए, एक सीज़ियम आधारित आंतरिक समाधान है कि होता है (मिमी) का उपयोग करें: 100 सी-methanesulfonate, 8 सोडियम क्लोराइड, 4 एटीपी मिलीग्राम, 0.5 ली जीटीपी, 5 EGTA, 10 HEPES और 0.2% biocytin ( w / v)। CsOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें।

2. रिकॉर्डिंग के दिन के लिए तैयारी

  1. खुले छेद के साथ एक nitrocellulose झिल्ली तैयार करने के लिए मैन्युअल एक स्वनिर्धारित एक पा 16 जी सिरिंज सुई से बना पंचर साथ झिल्ली पंच और दो गिलास स्वच्छ प्लेटों के बीच झिल्ली समतल। एक whole- के लिएरेटिना माउंट, व्यास में एक केंद्रीय छेद 0.2 मिमी बनाने के लिए और 4 बड़ा छेद है कि व्यास में 1-1.2 मिमी हैं द्वारा यह चारों ओर।
  2. इलेक्ट्रोड में आंतरिक समाधान लोड करने के लिए एक स्वनिर्धारित बैकफ़िल रेशा बनाने के लिए, बीच में एक 10 μl विंदुक टिप पिघल और धीरे पिघल भाग को लंबा जब तक यह ठंडा और मज़बूत बनाता है। बस का उपयोग करने से पहले जब तक यह अब थोड़ा पैच pipettes से है रेशा ट्रिम करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
  3. एक आंतरिक रेशा के साथ borosilicate ग्लास ट्यूब से एक प्रोग्राम खींचने में पैच pipettes खींचो। प्रयोग के दिन पर micropipettes के निर्माण और उन्हें तुरंत उपयोग करें।
    नोट: गर्मी: रिकॉर्डिंग की थैलियों के लिए, हम निम्नलिखित खींचने सेटिंग का उपयोग 484; खींच: 0; वेग: 25; समय देरी: 1; दबाव: 400 और 462. आयुध डिपो और borosilicate ट्यूब की आईडी की एक रैंप मूल्य 1.65 मिमी और 1.0 मिमी, क्रमशः रहे हैं। pipettes के प्रतिरोध 10-14 MΩ है।
  4. ऊतक फसल से पहले एक घंटे, Shaki द्वारा आंतरिक समाधान की एक ट्यूब पिघलना> 30 मिनट के लिए एक भंवर पर यह एनजी।

3. रेटिना विच्छेदन

  1. ऑक्सीजन में 4% isoflurane द्वारा पशु anesthetize जब तक पशु एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए जवाबदेही खो देता है। ग्रीवा अव्यवस्था से पशु बलि।
  2. 1-2 मिमी सीधे इशारा किया आईरिस कैंची से ऑप्टिक तंत्रिका सिर से दूर ऑप्टिक नसों से दोनों आंखों में कटौती।
  3. एक साफ कागज तौलिया पर आंखों रोल रक्त को हटाने और फिर उन्हें carbogenated स्तनधारी घंटी समाधान में विसर्जित करने के लिए। एक 23 जी सुई के साथ किनारी पर एक छेद पंच और सूक्ष्म कैंची से किनारी के साथ काटने से आंखों दोटूक। कॉर्निया और लेंस ठीक संदंश का उपयोग निकालें।
    1. रेटिना पूरे माउंट के लिए, धीरे ठीक संदंश के साथ pigmented उपकला बंद पूरे रेटिना छील और ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर किनारे से चार 1.5-2 मिमी orthogonal कटौती कर।
  4. डिश में एक मुक्का मारा nitrocellulose झिल्ली को विसर्जित कर दिया और धीरे से यह खत्म हो रेटिना खींचेंGCL ऊपर की ओर। जब एक पूरे माउंट रेटिना तैयारी केंद्र छेद में ऑप्टिक तंत्रिका सिर रखें। एक और स्वच्छ डिश में रेटिना के साथ झिल्ली स्थानांतरण। धीरे ठीक एक पेंट ब्रश के साथ रेटिना समतल एक माल्टीज़ क्रॉस की तरह लग रही है और छेद पर सभी चार किनारों रखना।
    1. रेटिना के एक अंश के लिए एक समय में जांच की जानी है, रंजित उपकला संलग्न रहता है के साथ एक धार के साथ 3-4 टुकड़ों में 3.3 कदम से तैयार प्रत्येक eyecup काटा। carbogenated बाहरी समाधान में प्रकाश से अप्रयुक्त टुकड़े को सुरक्षित रखें और 12 घंटे के भीतर उन्हें इस्तेमाल करते हैं।
  5. सूखी फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ nitrocellulose झिल्ली ब्लाट और संदंश के साथ कांच और भीतर सीमित झिल्ली और एक पेंट ब्रश को हटा दें।
  6. सुनिश्चित करें कि सभी रेटिना किनारों पूरी तरह तल पर एक मोहरबंद गिलास को कवर पर्ची के साथ रिकार्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करने से पहले विधानसभा झिल्ली से जुड़े होते हैं बनाओ। कवर पर्ची और rehydrat करने के लिए वैक्यूम तेल के साथ झिल्ली सुरक्षितबाहरी समाधान के साथ रेटिना ई। फंसाने के लिए सावधान नहीं किसी भी हवाई बुलबुले विधानसभा नीचे जा सकता है।
  7. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के मंच पर चैम्बर सेट करें। प्रति मिनट ~ 3 मिलीलीटर की दर से गर्म (34-35 डिग्री सेल्सियस) carbogenated बाहरी समाधान के साथ चैम्बर छिड़कना।
  8. एक 10x उद्देश्य लेंस पहली तहत रेटिना जांच, और फिर एक 60x पानी विसर्जन लेंस का उपयोग अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और / या epifluorescence के तहत GCL और लीग न्यूरॉन्स देखने के लिए। tdTomato व्यक्त की थैलियों कल्पना करने के लिए, एक सफेद 554 एनएम के एक उत्तेजना फिल्टर और 581 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर के साथ एलईडी संयोजन में प्रकाश स्रोत का उपयोग करें।

4. पूरे सेल पैच दबाना फ्लैट माउंट रेटिना से रिकॉर्डिंग

  1. कस्टम बैकफ़िल रेशा में एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से आंतरिक समाधान फ़िल्टर।
  2. एक हौसले से खींच लिया micropipette में रेशा डालें और टिप के पास आंतरिक समाधान बांटना जब तक समाधान> के लिए चांदी इलेक्ट्रोड तार को शामिल किया5 मिमी। एक सक्शन ध्रुव के साथ एक इलेक्ट्रोड धारक है, जो दबाव इलेक्ट्रोड के अंदर के माध्यम से धक्का या एक ट्यूब से जुड़े 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज के सवार खींच कर समायोजित किया जा सकता है पर micropipette जकड़ना।
  3. उद्देश्य के तहत पिपेट का पता लगाएं और रेटिना ऊपर ~ 100 माइक्रोन के लिए इसे नीचे लाने के लिए। वर्तमान अनुयायी मोड (i = 0) के तहत डीसी खड़े डीसी वोल्टेज संकेत शून्य करने के लिए ऑफसेट का उपयोग करें। वर्तमान दबाना (मैं दबाना) मोड के तहत पिपेट प्रतिरोध उपाय पिपेट के माध्यम से तय आयाम वर्ग तरंग धाराओं इंजेक्शन लगाने के द्वारा, जबकि यह स्नान में है और Raccess घुंडी बदल कर अंतर बेअसर। ओम कानून द्वारा पिपेट प्रतिरोध की गणना करने के Raccess घुंडी पर पढ़ने का प्रयोग करें।
  4. धीरे-धीरे रेटिना के ऊपर 10 माइक्रोन इलेक्ट्रोड के लिए ~ लाने के लिए। इलेक्ट्रोड के लिए सकारात्मक दबाव लागू करें। पिपेट टिप के पास प्रतिबिंब परिवर्तन घड़ी के रूप में यह रेटिना दृष्टिकोण। जल्दी लेकिन धीरे GCL में पिपेट बल और सकारात्मक pressu को कमतुरंत रहे हैं।
  5. एक लेबल न्यूरॉन की ओर पिपेट ले जाएँ। अन्य न्यूरॉन्स, रक्त वाहिकाओं और मुलर कोशिकाओं के endfeet संपर्क करने से बचें। अधिक सकारात्मक दबाव लागू होते हैं इलेक्ट्रोड clogging रोकने के लिए की जरूरत है।
  6. एक लेबल न्यूरॉन के midline के पास विंदुक टिप स्थिति तक एक डिंपल दिख रहा है। सकारात्मक दबाव जारी है और प्लाज्मा झिल्ली विंदुक टिप पर वापस उछाल की अनुमति देते हैं।
  7. पिपेट करने के लिए 20 से 120 पीए नकारात्मक धाराओं लागू करें एक giga ओम मुहर के गठन में मदद करने के लिए। एक कोमल चूषण लागू करें यदि आवश्यक हो तो पिपेट में प्लाज्मा झिल्ली खींचने के लिए। कोशिका झिल्ली टूटना करने के लिए सील गठन के बाद 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इस गिरा आंतरिक समाधान superfusion से साफ किया जा सकता है। एक सज्जन सक्शन द्वारा झिल्ली टूटना।
  8. झिल्ली फटने के बाद और वर्तमान दबाना मोड में है, जबकि पुल संतुलन पर स्विच और Raccess घुंडी का उपयोग कर इसे समायोजित।
    ध्यान दें: सैक की तरह एक छोटे सेल के लिए, केवल मामूली समायोजन की जरूरत है, यदि कोई हो। aLTERNatively, रिकॉर्ड और उत्तेजक, क्लोराइड के उलट क्षमता पर सेल (करीब -75 एम वी) और ग्लूटामेट (लगभग 0 एम वी) पकड़े क्रमश वोल्टेज दबाना मोड (वी दबाना) में निरोधात्मक धाराओं पोस्टअन्तर्ग्रथनी। जाँच करें और यदि कभी रेटिना और / या micromanipulator बहाव समायोजित करने की जरूरत पिपेट स्थिति को समायोजित।
  9. पहले झिल्ली क्षमता या वर्तमान परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए, के दौरान और औषधीय उपचार के बाद, synaptic ब्लॉकर्स तैयार (जैसे, CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarine, आदि) और चैनल modulators (जैसे, flupirtine, डोपामाइन, meclofenamic एसिड, आदि) के ताजा पर जमी शेयरों से प्रयोग के दिन। carbogenated घंटी समाधान के साथ दवाओं पतला। छिड़काव के माध्यम से एक बैच तरीके से उन्हें लागू करें।
  10. रिकॉर्डिंग के बाद, धीरे सोमा से पिपेट हटा दें। एक साफ डिश के लिए कक्ष से विधानसभा स्थानांतरण। अलग करें और मुक्का मारा Hol के बिना एक और चपटा nitrocellulose झिल्ली पर रेटिना फिर से देते हैंतों निर्धारण के दौरान रेटिना उदासी सुनिश्चित करने के लिए।
  11. आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में डुबो कर रेटिना को ठीक करें। nitrocellulose झिल्ली से रेटिना निकालें और इसे बड़े पैमाने पर कुल्ला 1x पीबीएस के साथ। 4 डिग्री सेल्सियस 14 में डाई संयुग्मित streptavidin के साथ हे / एन धुंधला 0.4% ट्राइटन X-100 के साथ 1x पीबीएस में पतला द्वारा दर्ज की गई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान पता चलता है। antifade माध्यम में रेटिना माउंट और एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर दर्ज कोशिकाओं निरीक्षण करते हैं।
    नोट: paraformaldehyde, जो अस्थिर और विषैला होता है को शामिल प्रक्रियाओं, सुरक्षा के लिए एक मसौदा कक्ष में आयोजित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

पर और एक deafferentated माउस रेटिना से रवाना प्रकार की थैलियों के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग चित्र 1 में दिखाया गया है। दोनों GCL और लीग में Cholinergic कोशिकाओं मज़बूती और tdTomato प्रतिदीप्ति द्वारा की पहचान की जा सकती है, डीआईसी के तहत पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित (चित्रा 1 ए) उनकी झिल्ली क्षमता (शीर्ष निशान) और synaptic धाराओं कि यह ड्राइव (नीचे निशान, चित्रा 1 बी) के दोलन प्रकट करते हैं। निरोधात्मक और उत्तेजक synaptic धाराओं 0 एम वी और -75 एम वी क्रमश कोशिकाओं पकड़े, वोल्टेज क्लैंप की स्थिति (चित्रा 1 बी, नीचे निशान) के तहत पता चला रहे हैं। आईपीएल (चित्रा 1 सी) में ठेठ सैक वृक्ष के समान द्रुमायण और स्तरीकरण के स्तर को आंतरिक रूप से dialyzed biocytin के लिए पोस्ट अस्थायी streptavidin धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं। rhythmicity और झिल्ली क्षमता में उतार-चढ़ाव और पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान परिवर्तन की आवृत्ति कर सकते हैंबिजली वर्णक्रमीय घनत्व की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया। औषधीय नाकाबंदी, या उसके अभाव, विभिन्न synaptic अंतर्निहित झिल्ली क्षमता दोलन 7 तंत्र विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. आकृति विज्ञान और झिल्ली मस्तक माउस रेटिना में पर और बंद बर्स्ट amacrine सेल की क्षमता। (ए) दोनों GCL में आन-थैलियों और ऑफ थैलियों लीग में आसानी से और रचनात्मक चालित tdTomato अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई रिकॉर्डिंग के लिए लक्षित डीआईसी के तहत। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन बराबर के रूप में संकेत दिया। (बी) के शीर्ष निशान झिल्ली क्षमता पर और बंद थैलियों से दर्ज संकेत के रूप में परिवर्तन कर रहे हैं। नीचे निशान प्रतिनिधि लयबद्ध उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी चालू कर रहे हैं (EPSC) कि झिल्ली के दोलन ड्राइव क्षमता और arrhythmic निरोधात्मक पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान (IPSC)। (सी) पोस्ट अस्थायी दर्ज की गई कोशिकाओं के histological लक्षण वर्णन आईपीएल में ठेठ सैक वृक्ष के समान आकृति विज्ञान और स्तरीकरण के स्तर को इंगित करता है। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन के रूप में संकेत के बराबर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कई प्रयोगशालाओं में GCL न्यूरॉन्स से दर्ज की गई है फ्लैट माउंट तैयारी 15-18, लेकिन हमारी प्रक्रियाओं लीग न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग अनुमति देते हैं। हम इसके द्वारा कई कदम है कि सफल दिनचर्या रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं पर जोर।

ताजगी और रेटिना की उदासी एक रिकॉर्डिंग विंदुक के साथ यह मर्मज्ञ के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस संबंध में मुक्का मारा nitrocellulose झिल्ली को रेटिना की फर्म लगाव सर्वोपरि है और समय पर पुनर्जलीकरण (चरण 3.4-3.6) के बाद समाधान के क्षणिक अवशोषण द्वारा हासिल की है। इस छोटी सी अवधि के दौरान आम तौर पर कम से कम 30 सेकंड, कांच का एक ढीला जेली की तरह बर्ताव करती है और खुली दूर किया जा सकता है। जब कई प्रकाशित प्रक्रियाओं, जहां कांच का मैन्युअल समाधान 17,19 में या एंजाइमी कार्यों 18,20 से निकाल दिया जाता है की तुलना में हमारी तकनीक को और अधिक कुशल है। एक और अक्सर इस्तेमाल किया विधि प्रत्येक कक्ष के लिए एक खाली पैच पिपेट का उपयोग बंद भीतरी सीमित झिल्ली फाड़ करने की है21,22 दर्ज किया है। हम रेटिना dismounting के डर से फाड़ विधि का पीछा नहीं किया। हालांकि, कुछ हद तक पारदर्शी और जेली की तरह शीशे बंद छीलने समय पर झिल्ली से रेटिना को बेदखल कर सकता है। यह इसलिए एक कदम है जो अभ्यास की आवश्यकता के रूप में nitrocellulose झिल्ली पर रेटिना की अवधारण लीग न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है। एक अच्छा अभ्यास अच्छी तरह से चपटा और पूरी तरह से हाइड्रेटेड nitrocellulose झिल्ली का उपयोग करने के लिए है। यहां ध्यान देने योग्य एक बिंदु रिकॉर्ड क्षेत्र के बीच स्पष्ट व्यापार बंद है (यानी, एक मुक्का मारा छेद का आकार), रेटिना की उदासी, और झिल्ली के लिए कुर्की की दृढ़ता। एक बड़ा रिकॉर्डिंग खिड़की पसंद किया जाता है लेकिन एक बड़ा मुक्का मारा छेद का मतलब यह है कि वहाँ रेटिना को संलग्न करने के लिए कम झिल्ली क्षेत्र। इसी तरह, एक छोटे छेद पर रेटिना बढ़ते फर्म लगाव सुनिश्चित करता है लेकिन उदासी को कम किया जा सकता है, और इतने रिकॉर्ड क्षेत्र है।

में कांच के माध्यम से एक इलेक्ट्रोड सम्मिलित करने के लिएGCL और लीग (चरण 4.4), हम इलेक्ट्रोड ठेला को रोकने के लिए एक सकारात्मक दबाव लागू होते हैं। रेटिना में प्रवेश पर इस दबाव की तत्काल कमी भी धुंधला पृष्ठभूमि को कम करने के लिए और दोलन के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है। एक महत्वपूर्ण बात की जांच पैठ और सील, GCL न्यूरॉन्स के लिए और लीग न्यूरॉन्स के लिए 60 सेकंड के भीतर अधिमानतः कम से कम 30 सेकंड प्राप्त करने के बीच के समय को कम करने के लिए है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु giga ओम मुहर के गठन के बाद और झिल्ली ruptures से पहले 5 मिनट इंतजार की अवधि है। इस प्रतीक्षा अवधि इलेक्ट्रोड की राह में गिरा आंतरिक समाधान के समाशोधन सुनिश्चित करता है और जब एक पोटेशियम आधारित आंतरिक समाधान क्योंकि उच्च पोटेशियम सामग्री अस्थायी रूप से पड़ोसी न्यूरॉन्स बिगाड़ना और दोलन को परेशान कर सकते हैं प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से प्रासंगिक है। अंत में, हमारे दृष्टिकोण (चरण 4.7) के एक कुछ असामान्य विशेषता यह है कि हम एक सेल दृष्टिकोण, एक गीगा ओम सील फार्म, और तब वर्तमान दबाना मो तहत पूरे सेल पहुँच प्राप्तडी, के रूप में वर्जीनिया कॉमनवेल्थ यूनिवर्सिटी के डॉ रोरी MCQUISTON, जो हमें हमारी प्रारंभिक electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ मदद की सलाह दी। इस विधि को तोड़ने पर त्वरित प्रतिरोध परिवर्तन वोल्टेज परिवर्तन (एक आस्टसीलस्कप के माध्यम से दिखाई) द्वारा कब्जा किया जा करने के लिए और पूरे सेल स्तर पर झिल्ली क्षमता के अचानक जोरों से दर्ज सेल की रक्षा की अनुमति देता है। हमारे विधि का एक अन्य उपयोगी सुविधा नकारात्मक वर्तमान इलेक्ट्रोड टिप है, जो सकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली फॉस्फोलिपिड को आकर्षित करने में मदद करता है और मुहर के गठन की सुविधा के लिए आवेदन किया है।

पार्श्व रेटिना सर्किट संरक्षण के संबंध में, रेटिना 20 के एक क्षैतिज कटा हुआ तैयारी सुझाव दिया गया है। इस विधि कुशलतापूर्वक क्षैतिज विस्तार हो dendrites और रिकॉर्डिंग और इमेजिंग के लिए आईपीएल में synaptic कनेक्शन को उजागर करता है, वहीं खड़ी मार्ग दुर्भाग्य से बाधित है और इसलिए इस विधि केवल सीमित उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, हम शोधन में लागूऊतक तैयार करने और रिकॉर्डिंग प्रक्रियाओं ऐसी बंद का थैलियों 7 के रूप में लीग न्यूरॉन्स की दिनचर्या को निशाना बनाया रिकॉर्डिंग की अनुमति है। दो photon इमेजिंग शामिल करने और विपरीत माइक्रोस्कोपी बढ़ाने, पैच दबाना विभिन्न प्रकाश परिस्थितियों में रिकॉर्डिंग के लिए बाहरी परत उलझन पास द्विध्रुवी कोशिकाओं और क्षैतिज कोशिकाओं को लक्षित करके अब एक फ्लैट माउंट तैयारी में संभव माना जाता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fixed-stage fluorescent microscope with DIC Olympus BX51-WI
Micromanipulators Sutter MP-225
Patch clamp amplifier A-M System AM2400
AD converter National Instrument NI-USB-6221
Heater controller Warner Instrument TC-324B
Inline heater Warner Instrument SC-20
Peristaltic pump Rainin Dynamax
pipette puller Sutter Instrument P-1000
Glass tube with filament King Precision Glass Customized
Stimulator A.M.P.I. Master-8
Biocytin Sigma B4261
NaCl Sigma S6191
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Fisher BP328-1
Na2HPO4 Sigma S0876
Na2HPO4 Sigma S5011
CaCl2 Sigma C5670
MgSO4 Sigma M1880
D-glucose Sigma G6152
K-gluconate Sigma G4500
ATP-Mg Sigma A9187
Li-GTP Sigma G5884
EGTA Sigma E0396
HEPES Sigma H4034
KOH Sigma P5958
Cs-methanesulfonate Sigma C1426
CsOH Sigma 232041
Syringer filter Nalgene 171
1 ml syring Rainin 17013002
10 μl pipette tip Genesee Scientific 24-130RL
Streptavidin-488 ThermoFisher S-11223
10x PBS Lonza 17-517Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 116 स्तनधारी रेटिना पूरे सेल पैच दबाना फोटोरिसेप्टर अध: पतन भीतर रेटिना सक्रियता फ्लैट माउंट तैयारी भीतर परमाणु परत बर्स्ट amacrine सेल
Deafferentated माउस रेटिना के एक फ्लैट माउंट तैयारी में स्टारबर्स्ट amacrine कोशिकाओं के पैच दबाना रिकॉर्डिंग
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Tu, H. Y., Hsu, C. C., Chen, Y. J.,… More

Tu, H. Y., Hsu, C. C., Chen, Y. J., Chen, C. K. Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina. J. Vis. Exp. (116), e54608, doi:10.3791/54608 (2016).

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