Summary
此协议演示了如何从一台安装在准备视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。
Abstract
哺乳动物视网膜是多种神经元类型构成的分层组织。为了理解如何视觉信号的错综复杂突触网络内进行处理，电生理记录经常用于研究单个神经元之间的连接。我们已经优化了遗传标记的神经元在这两个GCL（神经节细胞层）和INL鼠标视网膜的膜片钳记录（内核层）一台安装准备。在平面支架记录INL神经元是有利的过度分片，因为纵向和横向连接在前者配置保护，这样，具有大的横向分量的视网膜电路进行研究。我们已经用这种方法来比较视网膜镜像神经元结成伙伴的反应，如胆碱能爆无长突细胞（评估中心）。
Protocol
伦理批准 - 涉及受试动物的程序是按照规则和研究动物卫生准则的国家机构的规定进行的，所批准的机构动物护理和使用贝勒医学院的委员会。
1.外部和内部解决方案
- 在视网膜剥离，并在随后电生理记录外液使用哺乳动物的林格氏液。制备哺乳动物林格氏上记录的一天从10倍原液（没有钙）溶液中，添加氯化钙2滴carbogenation的15分钟（95％O 2和5％CO 2）之后。最终1倍溶液含有（以mM计）：120氯化钠，5氯化钾，25的NaHCO 3，0.8 的 Na 2 HPO 4，0.1的NaH 2 PO 4，2的CaCl 2，1用MgSO 4和10 D-葡萄糖。
- 使用两个内部解决方案，以表征SAC振荡。测试制备的溶液在长时间全细胞膜片钳记录对成年小鼠视网膜神经节细胞的有用性，并存储于500μl等份的验证批次在-20℃直到使用。
- 用于记录膜电位振荡，使用包含（以mM计）基于钾内部溶液：125 K-葡糖酸盐，8氯化钠，4的ATP的Mg，0.5立GTP，5 EGTA，10 HEPES和0.2％生物胞素（重量/ v）中。调节pH值至7.3 KOH。
- 用于记录兴奋性和抑制性突触后电流，使用包含（以mM计）基于铯内部溶液：100铯甲磺酸盐，8氯化钠，4的ATP的Mg，0.5立GTP，5 EGTA，10 HEPES和0.2％生物胞素（重量/体积）。调节pH值至7.3用CsOH。
2.准备录制的日子
- 制备具有开放孔的硝化纤维素膜，人工与来自钝为16G注射器针头制成的定制冲床冲膜和压平两个干净的玻璃板之间的薄膜。对于whole-安装视网膜，使中央孔直径为0.2mm以及由4较大的孔是1-1.2毫米直径围绕着它。
- 使装载内部溶液到电极定制回填长丝，熔融10微升枪头在中间，直到它冷却变硬轻轻延长熔融部分。只是在使用前，用干净的刀片修剪细丝，直到它比补丁移液器稍长。
- 在从硼硅玻璃管的可编程拉出器具有内部长丝拉补丁移液器。制造上实验当天的微量，并立即使用。
注：对于录音的SAC，我们用下面的车夫设置：热量：484;拉：0;速度：25;延迟时间：1;压力：400和462的硼硅酸盐管的外径和内径的斜坡值分别为1.65和1.0mm。移液器的电阻10-14MΩ。 - 一个HR组织收获前，解冻被萨基内部解决方案的管纳克它为> 30分钟的旋涡。
3.视网膜解剖
- 麻醉4％的异氟醚的动物中氧气直到动物失去反应到脚趾捏。颈椎脱位牺牲的动物。
- 在1-2毫米从直指出虹膜剪视神经头离开切断视神经两个眼球。
- 滚上干净的纸巾眼球，以清除血液，然后在carbogenated哺乳动物的林格氏液沉浸其中。按机器上使用23政针缘的孔，并伴随着微剪刀切缘平分眼球。删除使用细镊子角膜和晶状体。
- 对于视网膜整体安装，轻轻揭下用细镊子的色素上皮细胞的整个视网膜，并从向视神经乳头边缘4 1.5-2毫米正交削减。
- 沉浸穿孔硝酸纤维素膜，放入盘中，轻轻拖动与视网膜在它保利协鑫的一面朝上。制备整个安装视网膜当视神经乳头放入中心孔。与视网膜膜内转印到另一个干净的菜。轻轻压平视网膜用细刷油漆，看起来像一个马耳他十字打下了孔四边。
- 如果该视网膜的一小部分是在一个时间进行检查，切来自步骤3.3制备成3-4件用刀片与色素上皮保持连接每个眼罩。避光未使用的部分在carbogenated外部解决方案，12小时内使用。
- 吸干用干燥的滤纸的硝酸纤维素膜，并删除与镊子玻璃体和内界膜和漆刷。
- 确保所有的视网膜边缘装配转印到记录室在底部密封的玻璃盖片之前完全附着到膜上。用真空脂膜固定到盖玻片和rehydratË与外部溶液视网膜。要小心，不要捕获任何气泡的组件下方。
- 该室设置到一个直立式显微镜的阶段。以每分钟〜3毫升灌注速度用温水（34-35℃）carbogenated外液室。
- 检查10倍物镜先下视网膜，然后用60倍的水浸泡镜头下看到微分干涉对比（DIC）和/或落射荧光GCL和INL神经元。为了形象化tdTomato表达的SAC，使用白光LED组合光源的波长554激发过滤器和581 nm的发射滤光片。
4.全细胞膜片钳记录从平面贴装视网膜
- 过滤通过针筒式滤器插入定制回填灯丝的内部溶液。
- 插入灯丝成新鲜的拉微量和直到溶液覆盖银电极线为>分配尖端附近的内部溶液为5mm。紧固微量到与抽吸杆的电极保持器，通过该电极内部的压力可以通过推动或拉动管10连接毫升的塑料注射器的柱塞进行调整。
- 找到目标下的吸管，并把它归结为视网膜以上〜100微米。根据目前的跟随模式（I = 0），使用DC偏移为零立起的直流电压信号。通过吸移管注入固定振幅的方波电流测量电流钳（Ⅰ 钳 ）模式下的移液管电阻，而它是在浴中和通过转动r存取旋钮中和的差。使用对r存取旋钮读取由欧姆定律来计算吸液管电阻。
- 慢慢把10微米视网膜上方的电极〜。施加正压到电极。观看枪头附近的反射变化，因为它接近视网膜。很快，但轻轻用力吸液管进入保利协鑫，降低了积极pressu立即重新。
- 移动吸管向神经元标记。避免接触其他神经元，血管和Muller细胞endfeet。如果需要防止电极堵塞施加更大的正压力。
- 直到一个凹坑是可见的标记的神经元的中线附近枪头定位。释放正压和允许质膜反弹到枪头。
- 应用20〜120 pA的负电流，以移液管，以帮助一个千兆欧姆密封的形成。施加轻柔抽吸如果必要质膜拉入吸管。等待后密封形成5分钟以破裂细胞膜。这使得泻内部解决方案，通过灌流清除。用温和的吸力破裂膜。
- 膜破裂后，而在电流钳模式，开启桥平衡，并使用r存取旋钮进行调整。
注：对于像国资委一小格，只需要稍作调整，如果有的话。 Alternatively，记录兴奋性和通过保持在氯化物的逆转电位的细胞（约-75毫伏）和谷氨酸（约0毫伏）分别在电压钳模式（V 钳位 ）抑制性突触后电流。检查并在必要时以适应偶尔的视网膜和/或显微漂移调整吸管的位置。 - 到之前记录膜电位或电流变化，期间和药物治疗后，制备突触阻滞剂（ 如，CNQX，AP5，印防己毒素，筒箭毒碱等 ）和信道调制器（ 例如，氟吡汀，多巴胺，甲氯芬那酸等）新鲜上实验从冻结的股票一天。用稀释carbogenated林格氏液的药物。通过灌注以间歇方式应用它们。
- 录制完成后，轻柔地从索玛吸管。从该室转移装配到一个干净的菜。分离和视网膜重新连接到另一个扁平硝酸纤维素膜上打孔不HOLES以固定期间保证视网膜平整度。
- 通过在4％低聚甲醛浸渍在RT 30分钟固定的视网膜。取下硝酸纤维素膜在视网膜和用1×PBS广泛冲洗。由O / N染色用染料缀合的链霉在1×PBS稀释用0.4％的Triton X-100在4℃下14显示记录细胞的形态。在安装中防褪色视网膜和观察使用扫描共聚焦显微镜记录细胞。
注：涉及多聚甲醛，这是易挥发和有毒程序，应该在安全室草案进行。
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Representative Results
ON-和从deafferentated小鼠视网膜关型的SAC的代表性记录示于图1。在这两个GCL和INL胆碱能细胞可通过tdTomato荧光可靠地识别和DIC下针对全细胞膜片钳记录（ 图1A）以揭示其膜电位（顶部的痕迹），并推动它（底部的痕迹， 图1B）突触电流的振荡。抑制和兴奋性突触电流通过保持在分别为0毫伏和-75毫伏，单元，电压钳的条件（ 图1B，底部痕迹）根据显露。在IPL（ 图1C）的典型SAC树突分支和分层水平可以通过事后链亲和素染色内部透析生物胞素可视化。节律和膜电位波动和突触后电流的变化的频率可以通过计算功率谱密度来定量。药理阻断，或缺乏，可用于辨别底层膜电位振荡7不同的突触的机制。
在诺布小鼠视网膜导通和截止爆无长突细胞图1.形态及膜电位。（A）上都-评估中心在GCL和OFF-评估中心在INL利用Cre驱动tdTomato表达，易于识别和有针对性的记录下DIC。比例尺等于20微米的所指示的。 （B）的顶部迹线是由导通和截止的SAC记录所指示的膜电位的变化。底部的痕迹代表的节奏兴奋性突触后电流（EPSC）驱动膜的振荡势和心律失常抑制性突触后电流（IPSC）。 （C） 事后记录的细胞组织学特征表明在IPL典型的SAC树突形态和分层水平。比例尺等于指示50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
许多实验室已经从保利协鑫神经元记录台安装准备15-18，但我们的程序允许从INL神经元的记录。在此，我们强调的几个步骤是成功的日常记录的关键。
视网膜的新鲜度和平整度是有记录吸管穿透力很重要。在这方面，在视网膜的冲裁硝酸纤维素膜的牢固附着是非常重要的，并通过的溶液中，随后及时补液（步骤3.4-3.6）瞬态吸收实现的。在此短时间内，通常小于30秒，玻璃体行为类似于松散果冻，并且可以剥离。相比几个公开的程序，其中所述玻璃体是手动在溶液17,19或通过酶动作18,20除去时，我们的方法是更有效的。另一种常用的方法是撕内界膜断使用空膜片吸管对每个小区要被记录21,22。我们没有追求，怕拆卸视网膜撕裂方法。然而，剥离的几分透明胶状玻璃体断可能有时逐出膜上的视网膜。因此，这是需要实践为视网膜上的硝酸纤维素膜上的保留是用于记录INL神经元必不可少的步骤。一个好的做法是用好平坦，充分水合硝酸纤维素膜。这里值得注意的一点是可记录区之间的明显折衷（ 即，一个冲孔的大小），视网膜的平整度，并附着到膜的牢固性。优选较大的记录窗口，但较大的冲孔装置，有对视网膜附加到少的膜面积。类似地，安装在较小的孔视网膜确保牢固附着而平坦度可能会降低，所以是可记录区。
要通过玻璃进入插入电极的GCL和INL（步骤4.4），我们施加正压力，以防止电极堵塞。在渗入视网膜这种压力的直接减少也是用于减少染色背景和用于保存振荡的关键。一个重要的检查点是缩短渗透并获得密封，GCL神经元和60秒为INL神经元内优选小于30秒之间的时间。另外重要的一点是千兆欧姆密封后形成和膜破裂前的5分钟的等待期。这个等待期间确保了电极的路径泄漏的内部溶液的清算和当基于钾内部溶液使用，因为钾含量高可能暂时去极化相邻的神经元和扰乱振荡是特别相关的。最后，我们的方法（步骤4.7）的稍微非常规特征是我们接近的细胞，形成千兆欧姆密封，然后将该电流钳莫下获得全细胞访问德，人员建议由弗吉尼亚联邦大学的罗里McQuiston博士，谁与我们最初的电生理记录帮助我们。此方法允许在磨合快速电阻变化由电压变化（通过示波器可见）被捕获并保护膜电位的突然摆动所记录的细胞在全细胞水平。我们的方法的另一个有用的特性是施加到电极尖端，这有助于吸引带正电荷的膜磷脂和促进密封的形成负电流。
关于保留横向视网膜电路，视网膜20的水平切片制备已建议。虽然这种方法有效地暴露水平扩大树突和用于记录及成像在IPL突触连接中，垂直通路不幸打乱，因此只能用于有限的目的此方法。最后，我们的改进实施组织编写和录制过程允许INL神经元，如OFF-7的SAC常规针对性的录音。通过将双光子成像和对比度增强显微术，定位膜片钳各种照明条件下拍摄的外丛状层邻近双极细胞和水平细胞现在是在一个平面贴装制备认为是可行的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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