Summary
このプロトコルは、フラットマウント調製物から網膜ニューロンの全細胞パッチクランプ記録を実行する方法を示しています。
Abstract
哺乳動物の網膜は、複数のニューロンタイプの積層組織です。その複雑なシナプスのネットワーク内でどのように処理されるかを視覚信号を理解するために、電気生理学的記録は頻繁に個々のニューロン間の接続を研究するために使用されています。私たちは、GCL（神経節細胞層）およびマウス網膜のINL（内顆粒層）の両方で、遺伝的にマークされたニューロンのパッチクランプ記録のためのフラットマウントの準備を最適化しました。縦と横の両方の接続が前者の構成に保存されているので、フラットマウントで記録INLニューロンを研究するために大きな横方向の成分と網膜回路を可能にすること、スライスよりも好まれています。私たちは、このようなコリン作動スターバーストアマクリン細胞（SACの）として網膜におけるミラー提携ニューロンの応答を比較するには、この手順を使用しています。
Protocol
倫理的承認 - ベイラー医科大学の制度的動物のケアと使用委員会によって承認されたような動物を対象とする手順は、研究用動物のための国立衛生研究所のガイドラインの規則や規制に従って行いました。
1.外部および内部ソリューション
- 網膜解剖の間およびその後の電気生理学的記録で外液として、哺乳動物のリンゲル液を使用してください。記録の日に（カルシウムなし）10×ストック溶液から哺乳類リンゲル液を調製し、そしてCaCl 2を滴下carbogenationの15分後（95％O 2および5％CO 2）を追加します。最後の1×溶液（mM単位）含まれていますのNaHCO 3、0.8のNa 2 HPO 4、0.1のNaH 2 PO 4、2のCaCl 2、1のMgSO 4および10 D-グルコース120のNaCl、5のKCl、25。
- SAC振動を特徴づけるために2つの内部のソリューションを使用してください。テスト成体マウスの網膜神経節細胞に長期の全細胞パッチクランプ記録で調製した溶液の有用性とは、使用するまで-20℃で500μlのアリコートで検証バッチを格納します。
- 膜電位振動を記録するために、（mM単位）が含まれているカリウム系の内部液を使用：125 K-グルコン酸、8のNaCl、4 ATP-Mgを、0.5のLi-GTP、5 EGTA、10 HEPESおよび0.2％ビオシチン（/ワットV）。 KOHでpHを7.3に調整します。
- （100セシウムメタン、8のNaCl、4 ATP-Mgを、0.5のLi-GTP、5 EGTA、10 HEPESおよび0.2％ビオシチン：興奮性と抑制性シナプス後電流を記録するために、（mM単位）が含まれているセシウムベースの内部液を使用w / v）です。 CsOHを用いてpHを7.3に調整します。
レコーディングの日2.準備
- オープン孔を有するニトロセルロース膜を製造するために、手動で平滑化16 G注射針から作られた、カスタマイズパンチャーを有する膜をパンチし、2清潔なガラスプレート間の膜の平坦化。 whole-のため網膜をマウントし、直径が中央穴0.2ミリメートルを行い、直径1〜1.2ミリメートルである4より大きな穴によってそれを囲みます。
- 電極への内部ソリューションをロードするためのカスタマイズされたバックフィルフィラメントを作るために、真ん中に10μlのピペットチップを溶融し、それが冷えて固まるまで穏やかに溶融部を長くします。使用直前に、それは少し長いパッチピペットよりなるまで、フィラメントをトリミングするきれいなカミソリの刃を使用します。
- 内部のフィラメントとホウケイ酸ガラス管からプログラマブルプラーにパッチピペットを引き出します。実験の日に、マイクロピペットを製造し、すぐにそれらを使用しています。
注：記録SACのために、我々は次のプーラーの設定を使用：熱：484;プル：0;速度：25;時間遅延：1;圧力：400とホウケイ酸チューブの462 ODとIDのランプ値はそれぞれ、1.65ミリメートルと1.0ミリメートルです。ピペットの抵抗は10-14MΩです。 - 1時間組織の収穫前に、シャキによる内部液のチューブを解凍> 30分間ボルテックス上でそれをngの。
3.網膜解剖
- 動物はつま先のピンチに応答性を失うまで、酸素の4％イソフルランにより動物を麻酔。頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。
- 離れてストレート指摘アイリスハサミで視神経ヘッド1〜2ミリメートルで視神経オフ両方の眼球をカット。
- 血液を除去した後、carbogenated哺乳類リンゲル液でそれらを浸漬する清潔なペーパータオル上で眼球をロールバックします。 23 G針で角膜輪部に穴をパンチし、マイクロはさみで角膜縁に沿って切断することにより、眼球を二等分します。細かい鉗子を使用して角膜とレンズを取り外してください。
- 網膜全体のマウントのために、優しく細かい鉗子で色素上皮オフ網膜全体を剥離し、視神経乳頭に向かってエッジから4 1.5〜2ミリメートルの直交カットを行います。
- 皿に打ち抜いニトロセルロース膜を浸し、軽くてその上に網膜をドラッグしますGCLサイドアップ。ホールマウント網膜を調製する際に、中心穴に視神経頭を置きます。別のきれいな皿に網膜を有する膜を転送します。静かにマルタ十字のように見えると穴の上のすべての4辺を築くために細かいペイントブラシで網膜を平らに。
- 網膜の一部が一度に検討する場合には、色素上皮が付着したままでかみそりの刃で3-4個にステップ3.3から調製された各アイカップをカット。 carbogenated外液中に光から未使用の部分を保護し、12時間以内にそれらを使用しています。
- 乾燥ろ紙でニトロセルロース膜をブロットし、鉗子やペイントブラシで硝子体と内境界膜を除去します。
- すべての網膜のエッジが完全に底部に密封されたガラスカバースリップで記録室にアセンブリを転送する前に膜に結合していることを確認します。カバースリップとrehydratに真空グリースを有する膜を固定します外部溶液で網膜を電子。アセンブリの下に気泡をトラップに注意しないこと。
- 正立顕微鏡のステージにチャンバーを設定します。毎分〜3ミリリットルの割合で暖かい（34-35°C）carbogenated外液とチャンバーを灌流。
- 最初の10倍の対物レンズの下で網膜を調べ、その後、微分干渉コントラスト（DIC）および/またはエピ蛍光下GCLとINLニューロンを見るために60倍の水浸レンズを使用しています。 tdTomato発現のSACを視覚化するために、白色を使用する554 nmでの励起フィルターと581 nmでの発光フィルターと組み合わせたLED光源。
フラットマウント網膜から4ホールセルパッチクランプ記録
- カスタムバックフィルフィラメントにシリンジフィルターを通して内部液をフィルタリングします。
- ソリューションは>のための銀電極線を覆うまで新鮮に引っ張らマイクロピペットにフィラメントを挿入し、先端付近の内部液を分配5ミリメートル。チューブに接続された10ミリリットルのプラスチックシリンジのプランジャーを押したり引っ張ることによって調整することができ、電極内部が圧力を介して吸入ポール、と電極ホルダーにマイクロピペットを固定します。
- 目的の下でピペットを見つけ、網膜上記〜100μmとそれをダウンさせます。現在フォロアモード（I = 0）の下で、DCが立って直流電圧信号をゼロにオフセットを使用します。それはお風呂にある間に、ピペットを介して固定振幅方形波電流を注入することにより、電流クランプ（I クランプ ）モードでピペット抵抗を測定し、Raccessノブを回して違いを中和します。オームの法則によりピペット抵抗を計算するためにRaccessノブに読書を使用してください。
- ゆっくりと網膜上記〜10ミクロンに電極をもたらします。電極に正の圧力を適用します。それは網膜に近づくにつれてピペットチップの近くに反射変化を見ます。素早くしかし穏やかGCLにピペットを強制し、正pressuを減らしますすぐに再。
- ラベルされたニューロンに向かってピペットを移動します。他のニューロン、血管やミュラー細胞のエンドフィートを触れないようにしてください。電極の目詰まりを防止するために必要な場合は、より正の圧力を適用します。
- ディンプルが表示されるまでの標識ニューロンの正中線近くにピペットチップを置きます。正圧を解放し、原形質膜は、ピペットチップ上に立ち直ることができます。
- ギガオームシールの形成を助けるために、ピペットに20〜120 pAの負の電流を適用します。ピペットに血漿膜を引っ張るために、必要に応じて穏やかな吸引を適用します。細胞膜を破裂させるためにシール形成した後、5分待ってください。これは、こぼれた内部液を灌流によってクリアすることができます。穏やかな吸引によって、膜を破裂。
- 破水した後、現在のクランプモードにある間、ブリッジバランスに切り替えてRaccessノブを使って調整します。
注：いずれの場合SACのような小細胞については、わずかな調整が必要とされています。 Alternそれぞれ、（-75 mVの周り）塩化物の逆転電位で細胞を保持し、（0 mVの周り）グルタミン酸によってatively、レコード興奮と電圧クランプモード（V クランプ ）における抑制性シナプス後電流。時折、網膜および/またはマイクロマニピュレータードリフトに対応するために、必要に応じてピペットの位置を確認し、調整します。 - 薬理学的治療中と後に、前の膜電位または電流の変化を記録するには、新鮮な上にシナプスブロッカー（ 例えば、CNQX、AP5、ピクロトキシン、ツボクラリン等 ）およびチャネルモジュレーター（ 例えば、フルピルチン、ドーパミン、メクロフェナム酸など）を準備します凍結ストックからの実験の日。 carbogenatedリンゲル液と薬剤を希釈します。灌流を介してバッチ方法でそれらを適用します。
- 記録した後、静かにソーマからピペットを削除します。きれいな皿にチャンバーからアセンブリを転送します。他に網膜をデタッチし、再アタッチパンチホルずにニトロセルロース膜を平坦化定着時網膜平坦性を確保するために、ES。
- RTで30分間、4％パラホルムアルデヒド中に浸漬することにより、網膜を修正しました。ニトロセルロース膜から網膜を削除し、1×PBSでそれをすすいでください。 4℃で14で、0.4％トリトンX-100を1×PBSで希釈した色素結合ストレプトアビジンでO / N染色によって記録された細胞の形態を明らかにする。退色防止媒体に網膜をマウントし、走査型共焦点顕微鏡を用いて記録された細胞を観察します。
注：揮発性および毒性であるパラホルムアルデヒドを伴う手順は、安全のためのドラフトチャンバー内で行われるべきです。
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Representative Results
deafferentatedマウス網膜からのオンとオフ型のSACの代表的な録音は、図1に示されている。GCLとINLの両方におけるコリン作動性細胞が確実にtdTomato蛍光により同定し、DIC（ 図1A）の下で全細胞パッチクランプ記録のために標的とすることができますそれらの膜電位（上部トレース）および（下部のトレース、 図1B）を駆動するシナプス電流の振動を明らかにする。抑制性および興奮性シナプス電流は、電圧クランプ状態（ 図1B、下のトレース）の下で、それぞれ、0 mVの及び-75 mVので細胞を保持することによって明らかにされます。 IPL（ 図1C）における典型的なSAC樹状樹枝状分岐と成層のレベルは、内部透析ビオサイチンための事後ストレプトアビジン染色により可視化することができます。リズムと膜電位変動やシナプス後電流の変化の頻度缶パワースペクトル密度を計算することによって定量化すること。薬理学的遮断、またはその欠如は、膜電位振動7の根底にある別のシナプスメカニズムを識別するために使用することができます。
図1.形態とノブのマウス網膜におけるオンとオフスターバーストアマクリン細胞の膜電位。INLでGCLで（A）ON-SACの両方とOFF-SACのは容易に表現tdTomatoのCre-駆動し、記録の対象とすることにより同定しましたDICの下。示されるように、スケールバーは20μmで等しくなります。 （B）上部トレースは示されているようにオンとオフのSACから記録膜電位変化です。下のトレースは、膜電位と不整脈抑制性シナプス後電流（IPSC）の振動を駆動代表リズミカルな興奮性シナプス後電流（EPSC）です。 （Cは）記録された細胞の事後組織学的特徴付けは、IPLでの典型的なSAC樹状形態と層化のレベルを示しています。スケールバーは、示されるように、50ミクロンに等しい。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
多くのラボでは、フラットマウントの準備15-18でGCLニューロンから記録しているが、私たちの手順は、INLニューロンから記録を可能にします。我々はここ成功したルーチンの録音のために重要であるいくつかのステップを強調する。
網膜の新鮮さと平坦度は、記録ピペットを用いて、それを貫通するために重要です。この点において、パンチニトロセルロース膜への網膜のしっかり取り付けが最も重要であり、タイムリーな再水和（ステップ3.4から3.6）、続いて溶液の過渡吸収することによって達成されます。この短い期間中、通常30秒未満、硝子体が緩んでゼリーのように動作し、剥離することができます。硝子体は、手動で溶液17,19または酵素アクション18,20により除去され、いくつかの公表された方法と比較したときに我々の技術は、より効率的です。別の頻繁に使用される方法は、セルごとに空のパッチピペットを使用してオフに内境界膜を引き裂くことです21,22を記録します。私たちは、網膜のマウント解除を恐れて引き裂き方法を追求しませんでした。しかし、時間に膜から網膜を取り除くことがやや透明でゼリー状の硝子体オフを剥離します。従って、これは、ニトロセルロース膜上の網膜の保持がINLニューロンを記録するために不可欠であるとして、練習を必要とするステップです。良い習慣はよく平坦化し、完全に水和し、ニトロセルロース膜を使用することです。ここで注目すべき点は、記録可能領域との間の見かけ上のトレードオフである（ すなわち、パンチ穴の大きさ）、網膜の平坦性、および膜への付着の堅さ。より大きな記録ウィンドウが好ましいが、より大きなパンチ穴にアタッチする網膜のための少ない膜面積があることを意味します。同様に、小さな穴上に網膜を取り付けることしっかり付着を確実にするが、平坦性が低下することがある、など記録可能な領域です。
硝子体に介して電極を挿入するにはGCLとINL（ステップ4.4）は、我々は電極の詰まりを防止するために正の圧力を加えます。網膜への浸透時にこの圧力の即時の減少はまた、染色のバックグラウンドを減少させるため、発振を維持するために重要です。重要なチェックポイントは、GCLニューロンのためとINLニューロンのための60秒以内、好ましくは30秒未満、浸透とシールを取得するまでの時間を短縮することです。もう一つの重要な点は、ギガオームシールを形成した後、膜破裂する前に5分間の待機期間です。この待機期間は、電極の経路に流出内部液のクリアを確実にし、高カリウム含有量が一時的に隣接するニューロンを脱分極し、振動を乱す可能性があるため、カリウムベースの内部液を用いた場合に特に重要です。最後に、我々のアプローチ（ステップ4.7）の多少型破りな特徴は、細胞に近づく我々、ギガオームシールを形成し、その後、現在のクランプカ月の下で全細胞のアクセスを得ることですデ、私たちの最初の電気生理学的記録で私たちを助けたバージニア・コモンウェルス大学の博士ロリーMcQuiston、から助言を受けました。この方法は、ブレークインの際、迅速な抵抗変化は（オシロスコープを通して見える）電圧変化によって捕捉され、全細胞レベルでの膜電位の急激なスイングから記録されたセルを保護することができます。我々の方法の別の有用な特徴は、正に荷電した膜リン脂質を誘致するのに役立ちますし、シール形成を容易に電極先端に印加される負の電流です。
横網膜回路を保持に関しては、網膜20の水平方向にスライスした準備が示唆されています。この方法は効率的に水平方向に拡大デンドライト記録及び画像化のためにIPLでシナプス結合を公開しつつ、垂直経路が、残念ながら破壊され、したがって、この方法は、限られた目的のために使用することができます。最後に、改良が我々で実装します組織の準備と記録手順は、このようなOFF-SACの7のようなINLニューロンのルーチン目標と録音を可能にします。顕微鏡を増強二光子イメージングとコントラストを組み込むことにより、様々な照明条件下でパッチクランプ記録のために外網状層付近の双極細胞および水平細胞を標的とする現在のフラットマウント調製物で可能と考えられています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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