Summary
Denne protokollen viser hvordan du utfører hel-celle patch clamp opptak på netthinnens nerveceller fra en flat-mount forberedelse.
Abstract
Pattedyrnetthinnen er en lagdelt vev består av flere neuronale typer. For å forstå hvordan visuelle signaler behandles innen sine intrikate synaptiske nettverk, er elektrofysiologiske opptak ofte brukt til å studere forbindelser mellom enkeltnerveceller. Vi har optimalisert en flat-mount forberedelse for patch clamp opptak av genetisk merket nevroner i både GCL (ganglion celle laget) og INL (indre kjernefysiske lag) muse netthinne. Opptak INL nevroner i flat-mounts er favoriserte over skiver fordi både vertikale og laterale tilkoblinger er bevart i den tidligere konfigurasjon, slik at retinal kretser med store side komponenter som skal studeres. Vi har brukt denne fremgangsmåten for å sammenligne svarene fra speil samarbeid nevroner i netthinne slik som kolinerge starburst amacrine celler (sekker).
Protocol
Etisk godkjenning - prosedyrer som involverer dyr fag ble gjennomført i samsvar med regler og forskrifter av National Institutes of Health retningslinjer for forsøksdyr, som er godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité av Baylor College of Medicine.
1. Ekstern og intern løsning
- Bruk pattedyr Ringers oppløsning i løpet av retina disseksjon og som den eksterne løsningen i påfølgende elektrofysiologisk opptak. Forbered pattedyr Ringer løsning fra 10x stamløsning (uten kalsium) på dagen av innspillingen, og legge CaCl 2 dråpevis etter 15 min av carbogenation (95% O 2 og 5% CO 2). Den endelige 1x oppløsning inneholder (i mM): 120 NaCl, 5 KCI, 25 NaHCO3, 0,8 Na2 HPO 4, 0,1 NaH 2PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 og 10 D-glukose.
- Bruk to interne løsninger for å karakterisere SAC svingninger. Testnytten av preparerte løsninger i lengre hel-celle patch clamp opptak på voksne mus RGCs og lagre de verifiserte partier i 500 ul porsjoner ved -20 ° C inntil bruk.
- For opptak av membranpotensiale oscillasjon, bruker en kaliumbasert indre løsning som inneholder (i mM): 125 K-glukonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES og 0,2% biocytin (w / v). Juster pH til 7,3 med KOH.
- For opptak av eksitatoriske og hemmende postsynaptisk strøm, bruke en cesium-baserte indre løsning som inneholder (i mM): 100 Cs-metansulfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES og 0,2% biocytin ( w / v). Juster pH til 7,3 med CsOH.
2. Forberedelse til Day of Recording
- For å forberede en nitrocellulosemembran med åpne hull, manuelt slå membranen med en tilpasset puncher laget av en avstumpet 16 G sprøytespissen og flat membran mellom to rene glassplater. For en hel-montere retina, lage et sentralt hull 0,2 mm i diameter og omslutter den med 4 større hull som er 1-1,2 mm i diameter.
- For å gjøre en tilpasset fylling filament for lasting intern løsning inn elektroder, smelte en 10 mL pipette tips i midten og forsiktig forlenge smeltet delen til den kjøler og stivner. Like før bruk, bruk en ren barberblad å trimme filament til den er litt lengre enn de patch pipetter.
- Trekk lapp pipetter i en programmerbar avtrekker fra borsilikatglass rør med en intern filament. Produsere mikropipetter på dagen for forsøket og bruke dem umiddelbart.
MERK: For opptak blærer, bruker vi følgende puller innstilling: heat: 484; Trekk: 0; hastighet: 25; Forsinkelse: 1; trykk: 400 og en rampe verdi på 462. OD og ID av borosilicate rør er 1,65 mm og 1,0 mm, henholdsvis. Resistance av pipettene er 10-14 Megohm. - En time før vev innhøsting, tine en tube med intern løsning av Shaking det på en vortex for> 30 min.
3. Retina Dissection
- Bedøve dyret med 4% isofluran i oksygen før dyret mister respons på en tå klype. Offer dyret ved halshugging.
- Kutt begge øyeepler utenfor synsnervene på 1-2 mm fra synsnerven hoder med rette-spiss iris saks.
- Rull øyeepler på et rent papirhåndkle for å fjerne blod og deretter dyppe dem i carbogenated pattedyr Ringer løsning. Punch et hull på limbus med en 23 G nål og halvere øyeepler ved å kutte langs limbus med mikro-saks. Fjern hornhinnen og linsen bruker fine tang.
- For retinal hel-mount, forsiktig skrelle hele netthinnen av pigmentert epitel med fine tang og gjøre fire 1,5-2 mm ortogonale kutt fra kanten mot synsnervepapillen.
- Lev et stemplet nitrocellulosemembran i formen og forsiktig dra hinnen over den medGCL siden opp. Plasser synsnervepapillen i sentrumshullet når du forbereder en hel-mount netthinnen. Overfør membranen med netthinnen til en annen ren tallerken. Forsiktig flate netthinnen med en fin pensel til å se ut som en malteserkors og lå alle fire kanter over hullene.
- Hvis en brøkdel av netthinnen som skal undersøkes på en gang, kutt hver eyecup fremstilt fra trinn 3,3 til 3-4 stykker med et barberblad med den pigmenterte epitel forblir festet. Beskytt ubrukte brikker fra lys i carbogenated ekstern løsning og bruke dem innen 12 timer.
- Blot nitrocellulosemembranen med et stykke tørt filterpapir og ta ut glasslegemet og indre begrensende membran med pinsett og en pensel.
- Sørge for at alle retina kantene er fullstendig bundet til membranen før overføring av sammenstillingen inn i opptakskammeret med et forseglet glass dekkglass i bunnen. Fest membran med vakuum fett på dekkglass og rehydrate netthinnen med ekstern løsning. Vær forsiktig med å felle noen luftbobler under monteringen.
- Sett kammeret på scenen av en oppreist mikroskop. Perfuse kammeret med varm (34-35 ° C) carbogenated eksterne løsningen med en hastighet på ~ 3 ml per min.
- Undersøke netthinnen under et 10x objektiv først, og deretter bruke en 60x vann nedsenking linse for å se GCL og INL nevroner i henhold differensial interferens kontrast (DIC) og / eller epifluorescence. For å visualisere tdTomato-uttrykke sekker, bruk en hvit LED-lyskilde i kombinasjon med en eksitasjon filter av 554 nm og en emisjonsfilter 581 nm.
4. Hel-celle Patch Clamp opptak fra Flat-mount Retina
- Filtrer intern løsning gjennom en sprøyte filter i den egendefinerte fylling filament.
- Sett filament i en nytappet mikropipette og dispensere den interne løsningen nær spissen til løsningen dekker sølv elektrode wire for>5 mm. Feste mikropipette på en elektrodeholder med en suge pol, gjennom hvilken trykket inne i elektroden kan justeres ved å skyve eller trekke stempelet til en slange koblet 10 ml plastsprøyte.
- Finn pipetten under målet og bringe det ned til ~ 100 mikrometer over netthinnen. Under dagens-tilhenger modus (I = 0), bruker DC offset for å nullstille stående DC spenningssignal. Mål pipette motstand under strømtangen (I Clamp) modus ved å injisere fast amplitude firkantet bølge strømmer gjennom pipette mens den er i badekaret og nøytralisere forskjellen ved å vri på rFå tilgang knott. Bruk lesing på rFå tilgang knappen for å beregne pipette motstand av Ohms lov.
- Sakte bringe elektroden til ~ 10 um over netthinnen. Anvende positivt trykk til elektroden. Se refleksjonen endringen nær pipettespissen som det nærmer seg netthinnen. Raskt, men forsiktig press pipetten inn i GCL og redusere den positive Manometerre umiddelbart.
- Flytt pipette mot en merket neuron. Unngå kontakt med andre nerveceller, blodårer og endfeet av Muller celler. Anvende mer positivt trykk hvis det er nødvendig for å forhindre tilstopping elektrode.
- Plasser pipettespissen nær midtlinjen av en merket nevron til et smilehull er synlig. Slipp overtrykk og la plasma membranen til å sprette tilbake på pipettespissen.
- Anvende 20 til 120 pA negative strømmer til pipetten for å bidra til dannelsen av en giga-ohm tetning. Anvende en svak suge om nødvendig for å trekke plasmamembranen inn i pipetten. Vent i 5 minutter etter at tetningen formasjonen til å sprekke cellemembranen. Dette gjør at sølt intern løsning for å bli klarert av superfusjons. Briste membranen ved en skånsom sugekraft.
- Etter membran brudd og mens i den nåværende klemme modus, slå på brua balanse og juster den ved hjelp av rFå tilgang knott.
MERK: For en liten celle som SAC, bare liten justering er nødvendig, hvis noen. Alternatively, rekord stimulerende og hemmende postsynaptiske strømninger i spenning klemme modus (V Clamp) ved å holde cellen ved reversering potensialer av klorid (rundt -75 mV) og glutamat (rundt 0 mV), henholdsvis. Kontroller og juster pipette posisjon hvis det er nødvendig for å få plass til en og annen netthinnen og / eller micromanipulator drift. - For å ta opp membranpotensialet eller nåværende endring før, under og etter farmakologisk behandling, forberede synaptiske blokkere (f.eks CNQX, AP5, pikrotoksin, tubocurarine, etc.) og kanal modulatorer (f.eks flupirtine, dopamin, meclofenamic syre, etc.) fersk på dagen forsøket fra frosne aksjer. Fortynne medikamenter med carbogenated Ringer løsning. Anvende dem i en satsvis måte ved perfusjon.
- Etter innspillingen forsiktig fjerne pipetten fra soma. Overfør sammenstillingen fra kammeret til en ren tallerken. Ta og re-feste netthinnen til en annen flatet nitrocellulosemembran uten slo holes for å sikre netthinnen planhet under fiksering.
- Feste netthinnen ved å dyppe den i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern netthinnen fra nitrocellulosemembranen og skyll den grundig med 1x PBS. Avsløre morfologien av de registrerte celler ved O / N farging med fargestoffet-konjugert streptavidin ble fortynnet i 1 x PBS med 0,4% Triton X-100 ved 4 ° C 14. Monter netthinnen i antifade medium og observere innspilt celler ved hjelp av en scanning confocal mikroskop.
MERK: Prosedyrer som involverer paraformaldehyde, som er flyktig og giftig, bør gjennomføres i et utkast kammer for sikkerhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative opptak av on-og off-type sekker fra et deafferentated mus hinnen er vist i figur 1. Kolinerge celler i både GCL og INL kan bli pålitelig identifiseres av tdTomato fluorescens og målrettet for hel-celle patch clamp opptak i henhold til DIC (figur 1A) å avsløre svinging av sine membranpotensialer (øverst spor) og synaptic strømninger som driver det (nederst spor, Figur 1b). Hemmende og eksitatoriske synaptiske strømmer avsløres ved å holde cellene ved 0 mV og -75 mV, henholdsvis under spenning klemme forhold (figur 1B, bunn spor). Typiske SAC dendrittiske arborization og lagdeling nivåer i IPL (figur 1C) kan visualiseres ved post hoc streptavidin farging for internt dialysert biocytin. Den rhythmicity og hyppigheten av membranpotensialet svingninger og postsynaptiske aktuelle endringer kankvantifiseres ved beregning av spektrale effekttetthet. Farmakologisk blokade, eller mangel derav, kan anvendes for å skjelne forskjellige synaptiske mekanismer som ligger under membranpotensialet oscillasjon 7.
Figur 1. morfologi og membran potensialene av på- og utenfor starburst amacrine celle i Nob musen netthinnen. (A) både på sekker på GCL og AV-sekker ved INL ble lett identifisert av Cre-drevet tdTomato uttrykk og målrettet for opptak i henhold til DIC. Skala barer lik 20 mikrometer som angitt. (B) Den øverste sporene er membran potensielle endringer registrert fra on-og off-sekker som angitt. De nederste spor er representative rytmisk eksitatoriske postsynaptiske strøm (EPSC) som driver svinging av membranpotensialet og arytmisk hemmende postsynaptiske strøm (IPSC). (C) Post hoc histologisk karakterisering av innspilte celler indikerer typiske SAC dendrittiske morfologi og lagdeling nivåer i IPL. Skala barer lik 50 mikrometer som angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange laboratorier har registrert fra GCL nevroner i flat-mount forberedelse 15-18, men våre prosedyrer tillater opptak fra INL nevroner. Vi vektlegger herved flere trinn som er avgjørende for vellykkede rutine opptak.
Friskhet og planhet av netthinnen er viktig for å trenge det med et opptak pipette. I denne forbindelse, fast feste av netthinnen til stemplet nitrocellulosemembranen er viktig, og blir oppnådd ved forbigående absorpsjon av løsningen, etterfulgt av tidsriktig rehydrering (trinn 3.4 til 3.6). I løpet av denne korte periode, vanligvis mindre enn 30 sek, oppfører det glassaktige som en løs gelé og kan skrelles av. Vår teknikk er mer effektiv i forhold til flere publiserte prosedyrer, hvor glasslegemet fjernes manuelt i oppløsning 17,19 eller ved enzymatisk handlinger 18,20. En annen hyppig brukt metode er å rive den indre begrensende membran av ved hjelp av en tom patch pipette for hver celleskal registreres 21,22. Vi gjorde ikke forfølge den rivende metode for frykt for demontering netthinnen. Men peeling det noe gjennomsiktig og geleaktig glasslegemet off til tider kan løsne netthinnen fra membranen. Det er derfor et trinn som krever øvelse som bibehold av netthinnen på nitrocellulosemembranen er avgjørende for opptak av INL neuroner. En god praksis er å bruke godt flat og fullt hydrert nitrocellulosemembran. Et punkt verdt å merke seg her er den tilsynelatende avveining mellom den skrivbare området (dvs, på størrelse med et utstanset hull), flathet av netthinnen, og fastheten i tilknytning til membranen. En større innspilling vindu er foretrukket, men en større stansede hull betyr at det er mindre membranareal for netthinnen for å feste til. Tilsvarende montering av netthinnen over et mindre hull sikrer fast feste men planhet kan bli redusert, og det er opptakbar område.
Slik setter du inn en elektrode gjennom glasslegemet innGCL og INL (trinn 4.4), bruker vi et positivt press for å hindre elektrode jamming. Den umiddelbar reduksjon av dette trykk ved inntrengning i retina er også viktig for å redusere farging bakgrunn og for å bevare oscillasjon. Et viktig poeng er sjekk for å forkorte tiden mellom penetrasjon og skaffe tetning, fortrinnsvis mindre enn 30 sekunder for GCL nerveceller og i løpet av 60 sekunder for INL neuroner. Et annet viktig punkt er 5 min venteperioden etter dannelsen av den giga-ohm tetning og før membranen brister. Denne venteperiode sikrer rensing av sølt indre løsning i banen av elektroden og er spesielt relevant når et kaliumbasert indre løsning anvendes fordi den høye kaliuminnhold kan midlertidig å depolarisere nabo neuroner og forstyrre oscillasjon. Endelig, en noe ukonvensjonell trekk ved vår tilnærming (trinn 4.7) er at vi nærmer oss en celle, danner en giga-ohm forsegling, og deretter få hel-celle-tilgang under strømtang mode, som anbefales av Dr. Rory McQuiston av Virginia Commonwealth University, som har hjulpet oss med vår første elektrofysiologiske opptak. Denne metoden tillater rask motstand endring på break-in for å bli fanget av spenningsendringer (synlige gjennom et oscilloskop) og beskytter den innspilte celle fra den plutselige swing av membranpotensialet på hel-celle-nivå. Et annet nyttig trekk ved vår fremgangsmåte er den negative strøm tilføres til elektrodespissen, noe som bidrar tiltrekke positivt ladede membranfosfolipider og letter tetningen formasjonen.
Med hensyn til å bevare side retinal kretser har et horisontalt skiver utarbeidelse av retina 20 blitt foreslått. Selv om denne metoden effektivt utsetter horisontalt voksende dendritter og synaptiske forbindelser i IPL for opptak og bildebehandling, er den vertikale veien dessverre forstyrret og dermed denne metoden kan bare brukes for begrensede formål. Endelig avgrensninger vi gjennomføre ivev forberedelse og opptaksprosedyrer tillate rutine målrettet innspillinger av INL nevroner som OFF-sekker 7. Ved å innlemme to-foton bildebehandling og kontrast styrke mikroskopi, rettet mot bipolare celler og horisontale celler nær den ytre plexiform lag for patch clamp opptak under ulike lysforhold er nå ansett som mulig på en flatskjerm-mount forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
- Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
- Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
- Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
- Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
- Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
- Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
- Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
- Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
- Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
- Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
