Summary
Detta protokoll visar hur man utför hela-cell patch clamp inspelning på näthinnans nervceller från en platt-mount preparatet.
Abstract
Däggdjurs näthinnan är en tissue består av flera neuronala typer. För att förstå hur visuella signaler behandlas inom dess invecklade synaptiska nätverk, elektrofysiologiska inspelningar ofta för att studera sambanden mellan enskilda nervceller. Vi har optimerat en platt-mount förberedelse för patch clamp inspelning av genetiskt märkta neuroner i både GCL (ganglion cellager) och INL (inre nukleära lagret) av mus näthinnor. Inspelning INL nervceller i platt-fästen gynnas över skivor eftersom både vertikala och laterala anslutningar bevaras i den tidigare konfigurationen, så att retinala kretsar med stora sido komponenter som ska studeras. Vi har använt detta förfarande för att jämföra svaren från spegel partnered neuroner i näthinnor såsom kolinerga starburst amakrina celler (SAC).
Protocol
Etiskt godkännande - förfaranden som involverar djurförsök genomfördes i enlighet med de regler och förordningar National Institutes of Health riktlinjer för försöksdjur, som godkändes av den institutionella djurvård och använda kommitté Baylor College of Medicine.
1. Extern och Internal Solutions
- Använd däggdjur Ringers lösning under näthinnan dissekering och som extern lösning i efterföljande elektrofysiologiska inspelning. Förbered däggdjurs Ringers lösning från 10x stamlösning (utan kalcium) på dagen för inspelning, och tillsätt CaCl2 droppvis efter 15 min av carbogenation (95% O2 och 5% CO2). Den slutliga 1x lösningen innehåller (i mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCOa 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO 4 och 10 D-glukos.
- Använd två interna lösningar för att karakterisera SAC svängningar. Testanyttan av beredda lösningar i långvariga helcells-patch clamp inspelningar på vuxna mus RGC och lagra de kontrollerade partier i 500 mikroliter alikvoter vid -20 ° C fram till användning.
- För inspelning membranpotential svängning, använd en kaliumbaserad intern lösning som innehåller (i mM): 125 K-glukonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES och 0,2% biocytin (w / v). Justera pH till 7,3 med KOH.
- För inspelning retande och hämmande postsynaptiska strömmar, använder en cesium-baserade intern lösning som innehåller (i mM): 100 Cs-metansulfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES och 0,2% biocytin ( vikt / volym). Justera pH till 7,3 med CsOH.
2. Förberedelse för dagen av inspelning
- För att förbereda ett nitrocellulosamembran med öppna hål, stansa manuellt membranet med en anpassad laget gjord av en trubbig 16 G sprutnål och platta membranet mellan två rena glasplattor. För en parti-mount näthinnan, göra ett centralt hål 0,2 mm i diameter och omge den med 4 större hål som är 1-1,2 mm i diameter.
- För att göra en anpassad återfyllning filament för lastning inre lösningen i elektroder, smälta en 10 mikroliter pipettspets i mitten och försiktigt förlänga smälta delen tills den svalnar och hårdnar. Precis före användning, använd en ren rakblad för att trimma tråden tills den är något längre än de patch pipetter.
- Pull patch pipetter i en programmerbar avdragare från borsilikat glasrör med en inre glödtråd. Tillverka mikropipetter på dagen för experimentet och använda dem omedelbart.
OBS: För inspelning SBO, använder vi följande avdragare inställning: värme: 484; pull: 0; hastighet: 25; fördröjningstid: 1; tryck: 400 och en ramp värde på 462. Den OD och ID för borsilikatet rören är 1,65 mm och 1,0 mm, respektive. Motstånd av pipetterna är 10-14 Mohm. - En timme före vävnads skörd, tina en tub med intern lösning av Shaking den på en virvel för> 30 min.
3. Retina Dissection
- Söva djuret med 4% isofluran i syre till dess att djuret förlorar känslighet för en tå nypa. Offra djuret genom cervikal dislokation.
- Skär båda ögonglober utanför synnerverna på 1-2 mm från synnerven huvuden med raka pekade iris sax.
- Rulla ögonglober på en ren pappershandduk för att avlägsna blod och sedan doppa dem i carbogenated däggdjur Ringers lösning. Slå ett hål på limbus med en 23 G nål och bisect ögonglober genom att skära längs limbus med mikro-sax. Ta bort hornhinnan och linsen med fin pincett.
- För retinal hel-mount, försiktigt dra hela näthinnan av pigmenterade epitel med fin pincett och göra fyra 1,5-2 mm ortogonala snitt från kanten mot papillen.
- Doppa en stansad nitrocellulosamembran i skålen och försiktigt dra näthinnan över den medGCL uppåt. Placera synnerven huvudet i centrumhålet vid framställning av en hel-mount näthinnan. Överför membranet med näthinnan till en annan ren skål. platta försiktigt näthinnan med en fin pensel för att se ut som en maltesisk kors och lägga alla fyra kanter över hålen.
- Om en del av näthinnan ska undersökas vid en tidpunkt, skär varje ögonmussla framställd från steg 3,3 i 3-4 bitar med ett rakblad med den pigmenterade epitel sitter kvar. Skydda oanvända bitar från ljus i carbogenated extern lösning och använda dem inom 12 timmar.
- Blot nitrocellulosamembran med en bit torrt filterpapper och avlägsna glaskroppen och inre avgränsande membranet med pincett och en målarpensel.
- Se till att alla retinal kanter är helt fäst vid membranet innan överföring enheten i inspelningen kammaren med en förseglad glaskupa slip längst ned. Fäst membranet med vakuum fett till täckglas och rehydrate näthinnan med extern lösning. Var noga med att inte fälla några luftbubblor på undersidan av aggregatet.
- Ställ kammaren på scenen av en upprätt mikroskop. BEGJUTA kammaren med varmt (34-35 ° C) carbogenated extern lösning med en hastighet av ~ 3 ml per min.
- Undersök näthinnan under 10x objektiv först, och sedan använda en 60x vatten nedsänkning lins för att se GCL och INL nervceller enligt differential interferens kontrast (DIC) och / eller epifluorescence. Att visualisera tdTomato-uttryck SBO, använd en vit LED-ljuskälla i kombination med ett excitationsfilter av 554 nm och en emissionsfilter av 581 nm.
4. Hela-cell Patch Clamp Inspelning från Platt-mount Retina
- Filtrera den inre lösningen genom ett sprutfilter in i den anpassade fyllningen filamentet.
- Sätt tråden i en nyligen drog mikropipett och fördela den interna lösningen nära spetsen tills lösningen omfattar silverelektroden tråd för>5 mm. Fäst mikropipett på en elektrodhållare med en sugan pol, genom vilken trycket inuti elektroden kan justeras genom att skjuta eller dra kolven av ett rör-ansluten 10 ml plastspruta.
- Hitta pipetten under målet och föra den ner till ~ 100 pm över näthinnan. Enligt den nuvarande-följläge (I = 0), använder DC-offset till noll den stående likströmsspänningssignalen. Mäta pipetten motståndet under den aktuella klämman (I Clamp) läget genom att injicera fast amplitud fyrkantvåg strömmarna genom pipetten när den sitter i badet och neutralisera skillnaden genom att vrida på rVisa reglaget. Använd avläsningen på rVisa ratten för att beräkna pipett motstånd av Ohms lag.
- Långsamt upp elektroden till ~ 10 pm över näthinnan. Applicera positivt tryck till elektroden. Titta på reflektionsförändringar nära pipettspetsen när den närmar sig näthinnan. Snabbt men försiktigt tvinga pipetten i GCL och minska den positiva pressure omedelbart.
- Flytta pipetten mot en märkt neuron. Undvik kontakt med andra nervceller, blodkärl och endfeet av Muller celler. Applicera mer positivt tryck om det behövs för att förhindra elektrodigensättning.
- Placera pipettspetsen nära mittlinjen av en märkt neuron tills en grop är synlig. Frigöra det positiva trycket och tillåta plasmamembranet för att studsa tillbaka på pipettspetsen.
- Applicera 20 till 120 pA negativa strömmar till pipetten för att hjälpa bildningen av en giga-ohm tätning. Applicera en mild sugning om det är nödvändigt att dra plasmamembranet i pipetten. Vänta 5 min efter tätningsbildning att brista cellmembranet. Detta gör det möjligt för spilld intern lösning som ska raderas genom superfusion. Spräcka membranet genom en mild sugning.
- Efter membranbrott och medan i strömtång läge, slå på bron balans och justera den med hjälp av rVisa ratten.
OBS: För en liten cell som SAC, behövs endast smärre justering, om något. Alterntivt, spela retande och hämmande postsynaptiska strömmar i spänningsklämläge (V Clamp) genom att hålla cellen vid återföring potentialer av klorid (ca -75 mV) och glutamat (ca 0 mV), respektive. Kontrollera och justera pipett läge om det behövs för att tillgodose tillfälliga näthinnan och / eller mikromanipulator drift. - För att spela in membranpotentialen eller strömändring före, under och efter farmakologisk behandling, förbereda synaptiska blockerare (t.ex. CNQX, AP5, pikrotoxin, tubokurarin, etc.) och kanal modulatorer (t.ex. flupirtin, dopamin, meklofenamsyra, etc.) färskt dagen för experimentet från frysta lager. Späd de läkemedel med carbogenated Ringers lösning. Tillämpa dem på ett parti sätt genom perfusion.
- Efter inspelningen försiktigt bort pipetten från soma. Överföra aggregatet från kammaren till en ren skålen. Lossa och åter fästa näthinnan på en annan tillplattad nitrocellulosamembran utan stansade holes att säkerställa näthinnan planhet under fixering.
- Fixera näthinnan genom nedsänkning i 4% paraformaldehyd under 30 min vid RT. Ta bort näthinnan från nitrocellulosamembranet och skölj det i stor utsträckning med 1x PBS. Avslöjar morfologin hos de inspelade celler genom O / N färgning med dye-konjugerat streptavidin utspätt i 1 x PBS med 0,4% Triton X-100 vid 4 ° C 14. Montera näthinnan i antifade medelstora och observera inspelade celler med hjälp av ett svep konfokalmikroskop.
OBS: Rutiner involverar paraformaldehyd, som är flyktig och giftig, bör genomföras i ett utkast till kammare för säkerheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa inspelningar av on- och off-typ SBO från en deafferentated mus näthinnan visas i figur 1. Kolinerga celler i både GCL och INL kan identifieras på ett tillförlitligt sätt genom tdTomato fluorescens och riktade för hel-cell patch clamp inspelning enligt DIC (Figur 1A) att avslöja svängning av deras membranpotentialer (överst traces) och de synaptiska strömmar som driver den (nedre spår, Figur 1B). Hämmande och excitatoriska synaptiska strömmar avslöjas genom att hålla cellerna vid 0 mV och -75 mV, respektive, under spänning klämma förhållanden (Figur 1B, botten traces). Typiska SAC dendritiska arborization och skiktnings nivåer i IPL (Figur 1C) kan visualiseras genom post hoc streptavidin färgning för den invändigt dialyse biocytin. Den rhythmicity och frekvensen av membranpotential fluktuationer och postsynaptiska pågående förändringar kankvantifieras genom att beräkna den spektrala effekttätheten. Farmakologisk blockad, eller brist på sådan, kan användas för att urskilja olika synaptiska mekanismerna bakom membranpotential svängning 7.
Figur 1. morfologi och membranpotentialerna på och utanför starburst amakrina cell i Nob mus näthinnan. (A) både på SBO på GCL och AV-SBO på INL var lätt identifieras genom Cre-driven tdTomato uttryck och riktade för inspelning enligt DIC. Skalstrecken motsvarar 20 um som anges. (B) Den översta spår är membran eventuella förändringar som spelats in från ON- och OFF-säckar som anges. Botten spåren är representativa rytmisk excitatoriska postsynaptiska ström (epsc) som driver svängning membranpotentialen och arytmiska hämmande postsynaptiska ström (IPSC). (C) Post hoc histologisk karakterisering av inspelade celler visar typiska SAC dendritiska morfologi och skiktning nivåer i IPL. Skalstrecken lika 50 um som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många laboratorier har spelats in från GCL nervceller i platt-mount beredning 15-18, men våra rutiner tillåter inspelning från INL nervceller. Vi härmed betonar flera steg som är avgörande för framgångsrika rutin inspelningar.
Färskhet och planhet av näthinnan är viktiga för att penetrera den med en inspelning pipett. I detta avseende är den fasta fastsättningen av näthinnan till stansade nitrocellulosamembranet av största vikt och uppnås genom transient absorption av lösningen, följt av snabb återhydratisering (Steg 3,4-3,6). Under denna korta period, vanligtvis mindre än 30 sek, uppför sig glaskroppen som en lös gelé och kan skalas av. Vår teknik är effektivare jämfört med flera publicerade förfaranden, där glaskroppen avlägsnas manuellt i lösning 17,19 eller genom enzymatiska åtgärder 18,20. En annan ofta använd metod är att riva det inre avgränsande membranet av med en tom fläckpipetten för varje cellsom ska spelas in 21,22. Vi inte fullfölja riva metoden av rädsla för demontering näthinnan. Men skalar något genomskinligt och geléliknande glasartad off kan ibland rubba näthinnan från membranet. Detta är därför ett steg som kräver övning som bibehållandet av näthinnan på nitrocellulosamembranet är nödvändig för inspelning INL nervceller. En god praxis är att använda väl tillplattad och fullt hydratiserade nitrocellulosamembran. En punkt värt att notera här är den skenbara avvägningen mellan det inspelningsbara området (dvs., storleken på ett stansat hål), planheten av näthinnan, och fastheten av bindning till membranet. En större inspelningsfönstret är att föredra men en större stansat hål innebär att det finns mindre membranarea för näthinnan att fästa till. På samma sätt, montering näthinnan över ett mindre hål säkerställer fast bifogad fil men planhet kan reduceras, och så är inspelningsbart område.
Om du vill infoga en elektrod genom glaskroppen iGCL och INL (steg 4,4), vi tillämpar ett positivt tryck för att förhindra elektrod störning. Den omedelbar minskning av detta tryck vid inträngning i näthinnan är också avgörande för att minska färgning bakgrund och för att bevara svängning. En viktig Check Point är att förkorta tiden mellan penetration och få tätningen, företrädesvis mindre än 30 sekunder för GCL neuroner och inom 60 sekunder för INL nervceller. En annan viktig punkt är 5 min vänta period efter bildningen av giga-ohm tätning och innan membranet spricker. Denna väntetid säkerställer clearing av den utspillda intern lösning i vägen för elektroden och är särskilt relevant när en kaliumbaserad intern lösning används eftersom den höga kaliumhalten kan tillfälligt depolarize grann nervceller och störa svängning. Slutligen är en något okonventionell inslag i vår strategi (steg 4,7) att vi närmar oss en cell, bildar en giga-ohm tätning, och sedan få helcells-tillträde enligt den aktuella kläm mode, som rekommenderas av Dr Rory McQuiston av Virginia Commonwealth University, som hjälpt oss med våra första elektrofysiologiska inspelningar. Denna metod medger snabb resistens förändring vid inbrott att fångas upp av spänningsförändringar (synliga genom ett oscilloskop) och skyddar den inspelade cellen från den plötsliga swing av membranpotential vid helcells-nivå. En annan användbar funktion i vår metod är den negativa strömmen som appliceras på elektrodspetsen, vilket hjälper till att attrahera positivt laddade membranfosfolipider och underlättar tätning bildning.
När det gäller att bevara laterala näthinnan kretsar, har en horisontellt skivad beredning av näthinnan 20 föreslagits. Även om denna metod exponerar effektivt de horisontellt expanderande dendriter och synapsförbindelser i IPL för inspelning och bildbehandling, är den vertikala vägen tyvärr störd och därmed denna metod kan endast användas för begränsade ändamål. Slutligen, de förbättringar vi genomför iberedning och inspelnings vävnad förfaranden tillåter rutin riktade inspelningar av INL neuroner såsom OFF-SBO 7. Genom att införliva två-photon avbildning och kontrastförstärkande mikroskopi, inriktning på de bipolära celler och horisontella celler nära det yttre plexiformskiktet för patch clamp inspelning under olika ljusförhållanden anses nu vara möjligt i en platt-mount preparatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
- Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
- Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
- Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
- Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
- Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
- Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
- Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
- Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
- Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
- Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
