Summary
Denne protokol viser, hvordan du udfører hel-celle patch clamp optagelse på retinale neuroner fra en flad-mount forberedelse.
Abstract
Den mammale nethinden er et lagdelt væv består af flere neuronale typer. For at forstå, hvordan visuelle signaler behandles inden for sit indviklede synaptisk netværk, er elektrofysiologiske optagelser ofte bruges til at undersøge forbindelser mellem individuelle neuroner. Vi har optimeret en flad-mount forberedelse til patch clamp registrering af genetisk mærket neuroner i både GCL (ganglion cellelag) og INL (indre nukleare lag) af muse nethinder. Optagelse INL neuroner i flade-mounts er begunstiget i skiver fordi både lodrette og vandrette forbindelser er bevaret i den tidligere konfiguration, så retinale kredsløb med store laterale komponenter, der skal undersøges. Vi har brugt denne fremgangsmåde for at sammenligne svarene fra spejl partner med neuroner i nethinder såsom cholinerge starburst amacrine celler (SAC).
Protocol
Etisk godkendelse - procedurer, der involverer dyr emner blev gennemført i overensstemmelse med de regler og forskrifter for National Institutes of Health retningslinjer for forsøgsdyr, som er godkendt af den institutionelle Dyrepleje og bruge udvalg af Baylor College of Medicine.
1. Eksterne og interne løsninger
- Brug pattedyr Ringers opløsning under nethinden dissektion og som ekstern løsning i efterfølgende elektrofysiologiske optagelse. Forbered pattedyr Ringers opløsning fra 10x stamopløsning (uden calcium) på dagen for optagelsen, og tilsæt CaCl2 dråbevis efter 15 min af carbogenation (95% O2 og 5% CO2). Den endelige 1x opløsning indeholder (i mM): 120 NaCl, 5 KCI, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 og 10 D-glucose.
- Brug to interne løsninger til at karakterisere SAC svingninger. Prøvenytten af fremstillede opløsninger i længere helcelle patch clamp optagelser på voksne mus RGC'er og gemme de verificerede batches i 500 pi alikvoter ved -20 ° C indtil anvendelse.
- Til optagelse membranpotentiale svingning, så brug en kalium-baseret intern opløsning, der indeholder (i mM): 125 K-gluconat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES og 0,2% biocytin (w / v). Indstil pH til 7,3 med KOH.
- Til optagelse stimulerende og hæmmende postsynaptiske strømninger, brug en cæsium-baserede intern opløsning, der indeholder (i mM): 100 Cs-methansulfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES og 0,2% biocytin ( vægt / volumen). Indstil pH til 7,3 med CsOH.
2. Forberedelse Dag Recording
- Til fremstilling af en nitrocellulosemembran med åbne huller, manuelt Punch membranen med en tilpasset puncher fremstillet af et afstumpet 16 G kanyle og tromle membranen mellem to rene glasplader. For en engros-mount nethinden, gør et centralt hul 0,2 mm i diameter og omgive det med 4 større huller, der er 1-1,2 mm i diameter.
- For at gøre en tilpasset glødetråd opfyldning til indlæsning intern løsning i elektroder, smelte en 10 pi pipettespids i midten og forsigtigt forlænge den smeltede del, indtil det køler og hærder. Lige før brug, så brug en ren barberblad at trimme glødetråden, indtil det er lidt længere end de patch pipetter.
- Træk patch pipetter i et programmerbart aftrækker af borsilikatglas rør med en indre filament. Fremstilling af mikropipetter på dagen for eksperimentet og bruge dem med det samme.
BEMÆRK: For optagelse habitatområder, bruger vi følgende aftrækker indstilling: varme: 484; pull: 0; hastighed: 25; forsinkelse: 1; tryk: 400 og en rampe værdi på 462. OD og ID af borsilicatmaterialerne rør er 1,65 mm og 1,0 mm. Modstand af pipetter er 10-14 MQ. - En time før væv høst, tø et rør af intern løsning ved Shaking det på en vortex i> 30 min.
3. Retina Dissektion
- Bedøver dyret med 4% isofluran i oxygen indtil dyret mister lydhørhed over for en tå knivspids. Sacrifice dyret ved cervikal dislokation.
- Skær begge øjne off synsnerven på 1-2 mm fra den optiske nerve hoveder med lige-pegede iris saks.
- Rul øjne på et rent stykke køkkenrulle for at fjerne blod og derefter nedsænke dem i carbogenated pattedyr Ringers opløsning. Punch et hul på limbus med en 23 G nål og gennemskære de øjne ved at skære langs limbus med mikrosakse. Fjern hornhinden og linsen ved hjælp fine pincet.
- For retinal hel-mount, forsigtigt skræl hele nethinden fra pigmenteret epitel med fine pincet og gøre fire 1,5-2 mm ortogonale udskæringer fra kant mod synsnerven.
- Fordyb et knytnæveslag nitrocellulose membran i fadet, og træk forsigtigt nethinden over det medDen GCL opad. Placer det optiske nervehoved i midterhullet ved udarbejdelsen af en hel-mount nethinden. Overfør membranen med nethinden i en anden ren skål. flade forsigtigt nethinden med en fin pensel til at ligne et malteserkors og lægge alle fire kanter over hullerne.
- Hvis en brøkdel af nethinden er at blive behandlet på et tidspunkt, skæres hver øjestykket forberedt fra trin 3.3 i 3-4 stykker med et barberblad med pigmenteret epitel forbliver fastgjort. Beskyt de ubrugte stykker fra lys i carbogenated ekstern løsning og bruge dem inden for 12 timer.
- Dup nitrocellulosemembran med et stykke tørt filtrerpapir og fjern glaslegemet og indre begrænsende membran med pincet og en pensel.
- Sørg for at alle retinale kanter er fuldt fastgjort til membranen før overførsel samlingen ind i optagelsen kammer med et forseglet glas dække slip i bunden. Fastgør membranen med vakuum fedt på dækglas og rehydrate nethinden med den eksterne løsning. Pas på ikke at fælde eventuelle luftbobler nedenunder samlingen.
- Indstil kammeret ind på scenen af en opretstående mikroskop. Perfundere kammeret med varmt (34-35 ° C) carbogenated ekstern opløsning med en hastighed på ~ 3 ml pr min.
- Undersøg nethinden under en 10x objektiv først, og derefter bruge en 60x vand-nedsænkning linse til at se GCL og INL neuroner under differential interferens kontrast (DIC) og / eller epifluorescens. For at visualisere tdTomato udtrykker habitatområderne, bruge en hvid LED-lyskilde i kombination med en excitation filter af 554 nm og en emission filter 581 nm.
4. Whole-celle Patch Clamp Optagelse fra Flat-mount Retina
- Filtreres indre opløsning gennem en sprøjte filter over i glødetråden brugerdefinerede opfyldning.
- Sæt glødetråd i en frisk trukket mikropipette og dispensere den interne løsning nær spidsen, indtil opløsningen dækker sølv elektrode tråd til>5 mm. Fastgør mikropipette på en elektrodeholder med en suge stang, hvorigennem tryk inde i elektroden kan justeres ved at skubbe eller trække stemplet af et rør-forbundet 10 ml plastsprøjte.
- Find pipetten under målet og bringe det ned til ~ 100 pm over nethinden. Under det nuværende-follower tilstand (I = 0), bruge DC offset til nul stående DC spænding signal. Mål pipette modstand under den nuværende clamp (I Clamp) mode ved at injicere fast amplitude firkantbølge strømme gennem pipetten mens den er i badet og neutralisere forskellen ved at dreje rFå adgang knop. Brug aflæsningen på rFå adgang knop til at beregne pipette modstand af Ohms lov.
- Langsomt bringe elektroden til ~ 10 um over nethinden. Påfør positivt tryk til elektroden. Se refleksioner ændring nær pipettespidsen, når den nærmer nethinden. Hurtigt, men forsigtigt tvinge pipette ind i GCL og reducere den positive tryk lore det samme.
- Flyt pipetten mod en mærket neuron. Undgå at kontakte andre neuroner, blodkar og endfeet af Muller celler. Påfør mere positivt tryk hvis det er nødvendigt for at forhindre elektrode tilstopning.
- Placer pipettespidsen nær midterlinien af en mærket neuron, indtil en forsænkning er synlig. Slip positive tryk og tillade plasmamembranen at hoppe tilbage på pipettespidsen.
- Påfør 20 til 120 pA negative strømme til pipetten for at hjælpe dannelsen af en giga-ohm tætning. Anvende en mild sugning om nødvendigt at trække plasmamembranen ind i pipetten. Vent 5 min efter forsegling formation for at bryde cellemembranen. Dette gør det muligt spildt intern løsning at ekspedere væk for overhældning. Sprænge membranen ved en blid sugning.
- Efter membranen brud, og mens i den aktuelle clamp tilstand, tænde bro balance og juster den ved hjælp af rFå adgang knappen.
BEMÆRK: For en lille celle som SAC, kun er brug for mindre justering, hvis nogen. alterntivt, optage excitatoriske og inhibitoriske postsynaptiske strømme i spænding clamp modus (V Clamp) ved at holde cellen ved vending potentialer chlorid (omkring -75 mV) og glutamat (omkring 0 mV), hhv. Kontroller og juster pipette position, hvis nødvendigt for at imødekomme lejlighedsvis nethinde og / eller mikromanipulator afdrift. - For at optage membran potentielle eller nuværende forandring før, under og efter farmakologisk behandling, forberede synaptiske blokkere (f.eks CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarin, etc.) og kanal modulatorer (fx flupirtin, dopamin, meclofenaminsyre, etc.) friske på dagen for eksperimentet fra frosne bestande. Fortynd de lægemidler med carbogenated Ringers opløsning. Påfør dem i en batch måde gennem perfusion.
- Efter optagelsen forsigtigt fjerne pipetten fra soma. Overfør samlingen fra kammeret til en ren skål. Tag og re-vedhæfte nethinden på en anden fladtrykt nitrocellulose membran uden udstansede holes at sikre nethinden fladhed under fiksering.
- Fix nethinden ved nedsænkning i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern nethinden fra nitrocellulosemembranen og skyl det grundigt med 1x PBS. Afslører morfologien af de optagede celler med O / N-farvning med farvestof-konjugeret streptavidin fortyndet i 1x PBS med 0,4% Triton X-100 ved 4 ° C 14. Monter nethinden i antifade medium og observere optagne celler ved hjælp af et konfokalt.
BEMÆRK: Procedurer, der involverer paraformaldehyd, som er flygtige og giftige, bør gennemføres i et udkast kammer til sikkerhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative optagelser af on- og off-typen habitatområderne fra en deafferentated mus nethinden er vist i figur 1. Cholinerge celler i både GCL og INL kan opgøres pålideligt identificeres ved tdTomato fluorescens og målrettet for hel-celle patch clamp optagelse under DIC (figur 1A) at afsløre svingning af deres membran potentialer (top spor) og synaptiske strømme, der driver det (nederst spor, Figur 1B). Hæmmende og excitatoriske synaptiske strømme er afsløret ved at holde cellerne ved 0 mV og -75 mV, henholdsvis under spænding clamp betingelser (figur 1B, nederste spor). Typiske SAC dendritiske arborization og lagdeling niveauer i IPL (figur 1C) kan visualiseres ved post hoc streptavidin farvning for internt dialyseret biocytin. Den rytme og hyppigheden af membranpotentialet udsving og postsynaptiske aktuelle ændringer kankvantificeres ved at beregne power spectral density. Farmakologisk blokade, eller mangel på samme, kan anvendes til at skelne forskellige synaptiske mekanismer bag membranpotentiale oscillation 7.
Figur 1. Morfologi og membran potentialer on- og off-starburst amacrine celle i Nob mus nethinden. (A) Både ON-habitatområderne på GCL og OFF-habitatområderne på INL var let identificeres ved Cre-drevet tdTomato udtryk og målrettet til optagelse under DIC. Skalapanelerne svarer til 20 um som angivet. (B) De øverste spor er membran potentielle ændringer optaget fra on- og off-habitatområderne som angivet. De nederste spor er repræsentative rytmiske excitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC), der kører svingningerne i membranpotentiale og arytmiske inhibitoriske postsynaptiske strøm (IPSC). (C) Post hoc histologisk karakterisering af optagne celler angiver de typiske SAC dendritiske morfologi og lagdeling niveauer i IPL. Scale barer lig med 50 um som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange laboratorier har optaget fra GCL neuroner i det flade-mount forberedelse 15-18, men vores procedurer tillader optagelse fra INL neuroner. Vi lægger vægt hermed flere trin, der er afgørende for en vellykket rutinemæssige optagelser.
Friskhed og planhed af nethinden er vigtige til penetrering med en optagelse pipette. I denne henseende firmaet fastgørelse af nethinden til det stansede nitrocellulosemembran er altafgørende, og opnås ved transient absorption af opløsning efterfulgt af rettidig rehydrering (trin 3,4-3,6). I løbet af denne korte periode, normalt mindre end 30 sek, glaslegemet opfører sig som en løs gelé og kan skrælles. Vor teknik er mere effektiv, når sammenlignet med flere publicerede fremgangsmåder, hvor glaslegemet fjernes manuelt i opløsning 17,19 eller ved enzymatiske aktioner 18,20. Et andet ofte anvendt metode er at rive den indre begrænsende membran fra med en tom patch pipette for hver celleregistreres 21,22. Vi har ikke forfølge rive metoden af frygt for afmontering af nethinden. Men peeling den noget gennemsigtigt og gelé-lignende glasagtige off kan til tider fjerne nethinden fra membranen. Dette er derfor et skridt, der kræver praksis opbevaring af nethinden på nitrocellulosemembranen er afgørende for optagelse af INL neuroner. En god praksis er at bruge godt fladtrykt og fuldt hydreret nitrocellulosemembran. Et punkt værd at bemærke her er den tilsyneladende afvejning mellem det skrivbare område (dvs. størrelsen af en udstanset hul), fladhed af nethinden, og fasthed fastgørelse til membranen. En større vindue optagelse foretrækkes, men et større udstansede hul betyder, at der er mindre membranareal for nethinden til at knytte til. Tilsvarende montering nethinden over et mindre hul sikrer fast fastgørelse men fladhed kan reduceres, og således er skrivbar område.
For at indsætte en elektrode gennem glaslegemet indDen GCL og INL (Trin 4.4), anvender vi et positivt pres for at forhindre elektrode jamming. Den umiddelbare reduktion af dette tryk ved indtrængning i nethinden er også kritisk for at reducere farvning baggrund og til konservering svingning. Et vigtigt kontrolpunkt er at forkorte tiden mellem penetration og opnåelse forseglingen, fortrinsvis mindre end 30 sekunder ved GCL neuroner og inden 60 sek for INL neuroner. Et andet vigtigt punkt er 5 min venteperioden efter dannelsen af den giga-ohm tætning og før membranen brister. Denne venteperiode sikrer clearing af det spildte intern løsning i vejen for elektroden og er især relevant, når en kalium baseret intern opløsning anvendes, fordi det høje indhold af kalium midlertidigt depolarisere omkringliggende neuroner og forstyrrer svingning. Endelig en noget utraditionel funktion i vores tilgang (trin 4.7) er, at vi nærmer os en celle, danner en giga-ohm sæl, og derefter få hel-celle adgang under den nuværende clamp mode, som anbefales af Dr. Rory McQuiston af Virginia Commonwealth University, der hjalp os med vores indledende elektrofysiologiske optagelser. Denne fremgangsmåde tillader hurtig modstandsændring ved indbrud skal indfanges af spændingsændringer (synlige gennem et oscilloskop) og beskytter optaget celle fra den pludselige sving af membranpotentiale ved helcelle-niveau. En anden nyttig funktion i vores metode er den negative strøm tilført til elektroden spids, som hjælper tiltrække positivt ladede membranphospholipider og letter forseglingsdannelse.
Med hensyn til at bevare laterale retinale kredsløb, er blevet foreslået en vandret skåret fremstilling af nethinden 20. Selv om denne fremgangsmåde effektivt blotlægger de vandret ekspanderende dendritter og synaptiske forbindelser i IPL for registrering og billeddannelse, er den lodrette pathway desværre forstyrret og derfor kan denne fremgangsmåde kun anvendes til begrænsede formål. Endelig raffinementer vi gennemføre iprocedurer forberedelse og optagelse væv tillader rutine målrettet optagelser af INL neuroner såsom OFF-habitatområderne 7. Ved at inkorporere to-foton billedbehandling og kontrast forbedre mikroskopi, rettet mod de bipolære celler og vandrette celler nær den ydre pleksiforme lag til patch clamp optagelse under forskellige lysforhold betragtes nu som mulig i en flad-mount forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
- Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
- Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
- Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
- Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
- Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
- Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
- Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
- Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
- Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
- Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
