Summary
Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.
Abstract
De zoogdierretina is een gelaagd weefsel bestaat uit meerdere neuronale types. Om te begrijpen hoe de visuele signalen binnen haar ingewikkelde synaptische netwerk worden verwerkt, zijn elektrofysiologische opnames vaak gebruikt om verbindingen tussen individuele neuronen te bestuderen. We hebben een flatscreen-mount voorbereiding voor patch clamp opname van genetisch gemarkeerde neuronen in zowel GCL (ganglion cellaag) en INL (innerlijke nucleaire layer) van de muis netvliezen geoptimaliseerd. Opnemen INL neuronen in flat-mounts wordt bevoordeeld ten opzichte van plakken omdat zowel de verticale en laterale verbindingen worden bewaard in het voormalige configuratie, waardoor het netvlies circuits met grote laterale componenten worden bestudeerd. We hebben deze procedure gebruikt om de reacties van de mirror-partnered neuronen in netvliezen te vergelijken, zoals de cholinerge starburst amacrine cellen (SBZ).
Protocol
Ethische goedkeuring - procedures waarbij proefdieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de National Institutes of Health richtlijnen voor proefdieren, zoals goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissie van Baylor College of Medicine.
1. Externe en interne Solutions
- Gebruik oplossing zoogdieren Ringer's tijdens netvlies dissectie en als externe oplossing in de daaropvolgende elektrofysiologische opname. Bereid de zoogdieren Ringer's oplossing van 10x stockoplossing (zonder calcium) op de dag van opname en voeg CaCl2 druppelsgewijze na 15 min carbogenation (95% O2 en 5% CO2). De uiteindelijke 1x oplossing bevat (in mM): 120 NaCl, 5 KCI, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO 4 en 10 D-glucose.
- Gebruik twee interne oplossingen voor SAC oscillaties karakteriseren. Proefhet nut van bereide oplossingen langdurige whole-cell patch clamp on volwassen muis RGC en bewaar de geverifieerde batches in 500 gl aliquots bij -20 ° C tot gebruik.
- Voor het opnemen membraanpotentiaal oscillatie gebruik een basis van kalium interne oplossing die (in mM) bevat: 125 K-gluconaat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES en 0,2% biocytine (w / v). Stel de pH tot 7,3 met KOH.
- Voor het opnemen van prikkelende en remmende postsynaptische stromingen, gebruik een cesium gebaseerde interne oplossing die bevat (in mM): 100 Cs-methaansulfonaat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES en 0,2% biocytine ( w / v). Stel de pH tot 7,3 met CsOH.
2. Voorbereiding van de Dag van de Recording
- Om een nitrocellulose membraan met open gaten voor te bereiden, met de hand het membraan punch met een aangepaste puncher gemaakt van een afgestompte 16 G injectienaald en plat het membraan tussen twee schone glazen platen. Voor een groot-mount netvlies, maakt een centrale opening 0,2 mm in diameter en omgeven door 4 grotere gaten die 1-1,2 mm.
- Om een aangepaste opvulling filament voor het laden van interne oplossing in elektrodes te maken, smelt een 10 ul pipet tip in het midden en zachtjes verlengen de gesmolten gedeelte totdat het afkoelt en verhardt. Vlak voor het gebruik, gebruik dan een schone scheermesje om het filament trimmen totdat het is iets langer dan de patch pipetten.
- Trek patch pipetten in een programmeerbare trekker van borosilicaatglas buis met een interne filament. Vervaardiging van de micropipetten op de dag van het experiment en direct gebruiken.
LET OP: Voor het opnemen SBZ, gebruiken we de volgende puller instelling: warmte: 484; Trek: 0; snelheid: 25; vertragingstijd: 1; druk: 400 en een helling 462. De waarde van OD en ID van de boorsilicaat buizen 1,65 mm en 1,0 mm werden. Weerstand van de pipetten wordt 10-14 MQ. - Eén uur voor weefsel oogst, ontdooien een buis van de interne oplossing shaking het op een vortex gedurende> 30 min.
3. Retina Dissection
- Verdoven het dier met 4% isofluraan in zuurstof, totdat het dier responsiviteit verliest aan een teen knijpen. Offer het dier door cervicale dislocatie.
- Snijd beide oogappels van de oogzenuwen op 1-2 mm van de oogzenuw hoofden met rechte wees iris schaar.
- Rol de ogen op een schone papieren handdoek om bloed te verwijderen en vervolgens dompel ze in carbogenated zoogdieren Ringer's oplossing. Punch een gat op de limbus met een 23 G naald en halveren de oogbollen door te snijden langs de limbus met micro-schaar. Verwijder het hoornvlies en de lens met behulp van fijne pincet.
- Voor het netvlies whole-mount, zachtjes schil de gehele retina van de gepigmenteerde epitheel met fijn pincet en maak vier 1,5-2 mm orthogonale bezuinigingen van de rand in de richting van de oogzenuw hoofd.
- Dompel een geperforeerd nitrocellulosemembraan in de schaal en voorzichtig sleep het netvlies over het metde GCL kant naar boven. Plaats de oogzenuw hoofd in het gat in het midden bij de voorbereiding van een hele-mount netvlies. Breng de membraan met het netvlies in een andere schone gerecht. Voorzichtig plat het netvlies met een fijn penseel te lijken op een Maltezer kruis en leg alle vier de randen over de gaten.
- Als een deel van het netvlies is tegelijkertijd te onderzoeken, snijd elke oogschelp bereid uit stap 3.3 in 3-4 stukken met een scheermesje met de gepigmenteerde epitheel bevestigd blijft. Bescherm de ongebruikte stukken uit het licht in carbogenated externe oplossing en gebruik ze binnen 12 uur.
- Dep de nitrocellulose membraan met een stuk droog filter papier en verwijder het glasvocht en innerlijke beperkende membraan met een tang en een kwast.
- Zorg ervoor dat alle retinale randen volledig op voordat het overbrengen van de constructie in de opname kamer met een afgesloten glazen deksel slip op de bodem zijn bevestigd aan het membraan. Zet het membraan met vacuüm vet om het deksel slip en rehydrate het netvlies met de externe oplossing. Wees voorzichtig niet te vangen eventuele luchtbellen onder de montage.
- Stel de kamer op het podium van een rechtopstaande microscoop. Perfuseren de kamer met warm (34-35 ° C) carbogenated externe oplossing met een snelheid van ~ 3 ml per min.
- Onderzoek de retina onder een 10x objectief, en dan gebruik maken van een 60x water-immersie lens GCL en INL neuronen onder differentieel interferentie contrast (DIC) en / of epifluorescentie te zien. To-tdTomato uitdrukken SBZ visualiseren, gebruik maken van een witte LED-lichtbron in combinatie met een excitatie filter van 554 nm en een emissie filter van 581 nm.
4. Whole-cell Patch Clamp Opnemen van Flat-mount Retina
- Filter de interne oplossing door een spuit filter in de aangepaste opvulling gloeidraad.
- Steek de gloeidraad in een vers getapt micropipet en afzien van de interne oplossing in de buurt van de top tot de oplossing omvat de elektrode draad zilver voor>5 mm. Bevestig de micropipet op een elektrodehouder met een zuig- paal, waardoor de druk binnen de elektrode kan worden aangepast door duwen of trekken van de zuiger van een buis verbonden 10 ml plastic spuit.
- Vind de pipet in het kader van de doelstelling en breng het naar beneden tot ~ 100 micrometer boven het netvlies. Onder de huidige-volger mode (I = 0), gebruiken DC offset aan de permanente gelijkspanning signaal nul. Meet de pipet weerstand onder de huidige klem (I Klem) modus door het injecteren van vaste amplitude vierkante golf stromen door de pipet terwijl het in het bad en neutraliseren het verschil door de rToegang tot knop. Gebruik de lezing over de rToegang tot knop om pipet weerstand te berekenen door de wet van Ohm.
- Langzaam breng de elektrode ~ 10 urn boven de retina. Toepassen positieve druk aan de elektrode. Kijk naar de reflectie verandering in de buurt van de pipet tip als het het netvlies benadert. Snel maar voorzichtig te dwingen de pipet in de GCL en vermindering van de positieve pressure onmiddellijk.
- Verplaats de pipet in de richting van een gelabelde neuron. Vermijd contact opneemt met andere neuronen, bloedvaten en eindvoetjes van astrocyten van Muller cellen. Toepassen positieve druk indien nodig elektrode verstopping te voorkomen.
- Plaats de pipet tip in de buurt van de middellijn van een gelabelde neuron totdat er een kuiltje zichtbaar is. Laat de positieve druk en laat de plasmamembraan om terug te stuiteren op de pipet tip.
- Toepassen 20 tot 120 pA negatieve stromen aan de pipet om de vorming van een giga-ohm afdichting helpen. Breng een zachte zuigkracht eventueel naar de plasmamembraan te trekken in de pipet. Wacht 5 minuten na afdichting formatie de celmembraan scheuren. Hierdoor kan de gemorste interne oplossing kon worden gekeerd door superfusie. Scheuren van het membraan door een zachte zuigkracht.
- Na het breken van de vliezen en terwijl in de huidige klem modus te schakelen op de brug balans en aan te passen met behulp van de rToegang tot knop.
OPMERKING: Voor een kleine cel, zoals de SAC, slechts geringe aanpassing nodig is, indien van toepassing. Alterntief, opnemen prikkelende en remmende postsynaptische stromingen in het voltage clamp-modus (V Clamp) door het vasthouden van de cel op omkering potentieel van chloride (ongeveer -75 mV) en glutamaat (ongeveer 0 mV), respectievelijk. Controleer en stel pipet positie als dat nodig is om af en toe een retina en / of micromanipulator drift tegemoet te komen. - Om membraanpotentiaal of stroomverandering voor verse, opnemen, tijdens en na de farmacologische behandeling, bereiden synaptische blokkers (bijv CNQX, AP5, picrotoxine, tubocurarine, etc.) en kanaal modulatoren (bijvoorbeeld flupirtine, dopamine, meclofenaminezuur, etc.) de dag van het experiment uit bevroren voorraden. Verdun de drugs met de oplossing carbogenated Ringer's. Pas hen in een ladingsgewijze manier door perfusie.
- Na de opname, verwijder voorzichtig de pipet uit de soma. Breng de assemblage van de kamer naar een schone schotel. Los te maken en opnieuw te bevestigen het netvlies naar een andere afgeplat nitrocellulosemembraan zonder geperforeerd holes naar retina vlakheid te garanderen tijdens fixatie.
- Bevestig de retina door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het netvlies van het nitrocellulose membraan en spoel het uitgebreid met 1x PBS. Tonen de morfologie van de cellen opgenomen door O / N kleuring met kleurstof-geconjugeerd streptavidine verdund in 1x PBS met 0,4% Triton X-100 bij 4 ° C 14. Monteer de retina in antifade medium en observeer opgenomen cellen met behulp van een scanning confocale microscoop.
OPMERKING: Procedures waarbij paraformaldehyde, dat is vluchtig en giftig, moeten worden uitgevoerd in een ontwerp-kamer voor de veiligheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve opnamen van AAN- en UIT-type SAC een deafferentated muis netvlies weergegeven in figuur 1. Cholinerge cellen in zowel GCL en INL betrouwbaar kan worden geïdentificeerd door tdTomato fluorescentie en gericht voor whole-cell patch clamp opnamen bij DIC (Figuur 1A) om trilling van hun membraan potentials (boven de sporen) en de synaptische stromingen die het te drijven (onderste sporen, figuur 1B) te onthullen. Remmende en prikkelende synaptische stromen worden onthuld door het vasthouden van de cellen bij 0 mV en -75 mV, respectievelijk onder voltage clamp omstandigheden (Figuur 1B, onder sporen). Typische SAC dendritische arborization en gelaagdheid niveaus in de IPL (figuur 1C), kunnen worden gevisualiseerd door post hoc streptavidine kleuring voor het intern gedialyseerd biocytine. Het ritme en de frequentie van membraanpotentiaal fluctuatie en postsynaptische huidige veranderingen kanworden gekwantificeerd door het berekenen van de spectrale vermogensdichtheid. Farmacologische blokkade of het gebrek daaraan, kan worden gebruikt om verschillende synaptische mechanismen verantwoordelijk membraanpotentiaal oscillatie 7 onderscheiden.
Figuur 1. Morfologie en membraan mogelijkheden van on- en off-starburst amacrine cel in het Nob muis netvlies. (A) Beide ON-SBZ op GCL en UIT-SBZ bij INL werden gemakkelijk geïdentificeerd door Cre-driven tdTomato expressie en gericht voor het opnemen onder DIC. Schaalbalken gelijk 20 urn zoals aangegeven. (B) De bovenste sporen membraan potentiële veranderingen opgenomen van ON en OFF-SBZ zoals aangegeven. De onderste sporen zijn representatief ritmische prikkelende postsynaptische stroom (EPSC), die de trilling van membraan potentieel en de aritmische remmende postsynaptische stroom (IPSC) te rijden. (C) Voeg hoc histologische karakterisering van opgenomen cellen geeft de typische SAC dendritische morfologie en gelaagdheid niveaus in de IPL. Schaal bars gelijk aan 50 pm, zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel labs hebben opgenomen van GCL neuronen in de flat-mount voorbereiding 15-18, maar onze procedures maken het mogelijk opnemen van INL neuronen. Hierbij bieden wij benadrukken verschillende stappen die essentieel zijn voor een succesvolle routine opnamen.
De frisheid en vlakheid van de retina zijn belangrijk voor het binnendringen met een opname pipet. In dit opzicht is de stevige bevestiging van het netvlies aan de geperforeerde nitrocellulosemembraan voorop en wordt bereikt door transiënte spectroscopie oplossing gevolgd door tijdige rehydratatie (stap 3,4-3,6). Tijdens deze korte periode, gewoonlijk minder dan 30 seconden, het glasvocht gedraagt zich als een losse gelei en kan worden afgepeld. Onze techniek is efficiënter in vergelijking met een aantal gepubliceerde procedures, waarbij het glasachtige handmatig 17,19 oplossing of door enzymatische activiteiten 18,20 verwijderd. Een andere vaak gebruikte methode is het binnenste beperkende membraan scheurt met een lege patch pipet voor elke celworden geregistreerd 21,22. We hadden niet de scheuren methode voort te zetten uit angst voor demontage van het netvlies. Echter, het schillen van de ietwat transparante en geleiachtig glasvocht af kan soms los van het netvlies van het membraan. Dit is daarom een stap die praktijk vereist de retentie van netvlies op de nitrocellulose membraan essentieel is voor het opnemen INL neuronen. Een goede praktijk is om goed afgevlakte en volledig gehydrateerd nitrocellulose membraan te gebruiken. Een punt Vermeldenswaard is de schijnbare wisselwerking tussen het opneembare gebied (dat wil zeggen, de grootte van een geponst gat), de vlakheid van het netvlies en de stevigheid van de bevestiging aan het membraan. Een grotere opnamevenster voorkeur maar groter gaatje betekent dat er minder membraanoppervlak van het netvlies te hechten aan. Ook het monteren van de retina over een kleiner gat zorgt voor stevige bevestiging, maar vlakheid kan worden verminderd, en zo is opneembaar gebied.
Om een elektrode te voegen door middel van het glasvocht inhet GCL en INL (Stap 4.4), passen we een positieve druk om elektrode vastlopen te voorkomen. De onmiddellijke verlaging van de druk op penetratie in het netvlies is ook kritisch voor het reduceren kleuring achtergrond en voor het behoud van oscillatie. Een belangrijk controlepunt is de tijd tussen penetratie en het verkrijgen van de verbinding, bij voorkeur minder dan 30 seconden voor GCL neuronen en binnen 60 seconden voor INL neuronen verkorten. Een ander belangrijk punt is de 5 minuten wachttijd na de vorming van het giga-ohm afdichting en voor het membraan scheurt. Deze wachttijd zorgt het opruimen van gemorste de inwendige oplossing in de baan van de elektrode en is met name relevant als een basis van kalium interne oplossing wordt gebruikt omdat het hoge kaliumgehalte tijdelijk aangrenzende neuronen depolariseren verstoren oscillatie. Tot slot, een ietwat onconventionele kenmerk van onze aanpak (Stap 4.7) is dat we een cel benaderen, vormen een giga-ohm afdichting en vervolgens toegang krijgen whole-cel onder de huidige klem mode, zoals geadviseerd door Dr. Rory McQuiston van de Virginia Commonwealth University, die ons geholpen met onze eerste elektrofysiologische opnames. Deze methode maakt het mogelijk snel weerstandsverandering op break-in te worden opgevangen door de spanning veranderingen (zichtbaar door een oscilloscoop) en beschermt de opgeslagen cel van de plotselinge schommeling van de membraanpotentiaal in de whole-cell niveau. Een andere nuttige eigenschap van onze methode is ontkennend wordt toegepast op de elektrode, waardoor positief geladen membraan fosfolipiden aantrekken en vergemakkelijkt de vorming afdichting.
Met betrekking tot het behoud laterale retinale circuits, heeft een horizontaal gesneden preparaat van de retina 20 voorgesteld. Hoewel deze methode doeltreffend de horizontale uitbreiding dendrieten en synaptische verbindingen in de IPL voor opname en weergave blootstelt, wordt de verticale pad nog verstoord en derhalve kan deze methode alleen gebruikt voor beperkte doeleinden. Tenslotte verfijningen we implementerenweefsel voorbereiding en registratie procedures toestaan routine gerichte opnames van INL neuronen zoals OFF-SBZ 7. Door de integratie van twee-foton imaging en contrast verbeteren microscopie, gericht op de bipolaire cellen en horizontale cellen in de buurt van de buitenste plexiforme laag voor patch clamp opnamen onder verschillende lichtomstandigheden wordt nu beschouwd als haalbaar in een flat-mount voorbereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
- Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
- Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
- Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
- Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
- Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
- Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
- Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
- Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
- Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
- Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
