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Neuroscience

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

Published: October 13, 2016 doi: 10.3791/54608

Summary

Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.

Abstract

La retina dei mammiferi è un tessuto stratificato composto da più tipi di neuroni. Per capire come i segnali visivi vengono elaborati all'interno della propria rete sinaptica intricata, registrazioni elettrofisiologiche sono spesso utilizzati per studiare le connessioni tra i singoli neuroni. Abbiamo ottimizzato una preparazione TV a monte per la registrazione patch clamp di neuroni geneticamente marcate sia in GCL (strato di cellule gangliari) e INL (strato nucleare interno) di retine di topo. Registrazione neuroni INL a Flat-monti è favorita rispetto fette perché le connessioni sia verticali e laterali sono conservati nella ex di configurazione, consentendo circuiti della retina con componenti di grandi dimensioni laterali da studiare. Abbiamo usato questa procedura per confrontare le risposte dei neuroni specchio-partnered in retine come i colinergici cellule amacrine starburst (ZSC).

Protocol

l'approvazione etica - procedure che coinvolgono soggetti animali sono state condotte in conformità con le norme ei regolamenti del National Institutes of linee guida sanitarie per gli animali di ricerca, come approvato dalla cura degli animali istituzionale e usare comitato di Baylor College of Medicine.

1. esterno e delle soluzioni interne

  1. Utilizzare la soluzione di Ringer mammiferi durante la dissezione retina e la soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer mammiferi da 10x soluzione madre (senza calcio) il giorno della registrazione, e aggiungere CaCl 2 goccia a goccia dopo 15 min di carbogenation (95% O 2 e il 5% di CO 2). La soluzione finale 1x contiene (in mM): 120 NaCl, KCl 5, 25 NaHCO 3, 0.8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 e 10 D-glucosio.
  2. Utilizzare due soluzioni interne per caratterizzare oscillazioni SAC. Testl'utilità di soluzioni preparate in cellule intere registrazioni di patch clamp prolungati sulla RGCs topo adulto e memorizzare i lotti verificati in 500 microlitri aliquote a -20 ° C fino al momento dell'uso.
    1. Per la registrazione potenziale di membrana di oscillazione, utilizzare una soluzione interna a base di potassio contenente (in mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Regolare il pH a 7,3 con KOH.
    2. Per la registrazione eccitatori e correnti postsinaptiche inibitorie, utilizzare una soluzione interna cesio base contenente (in mM): 100 Cs-metansolfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Regolare il pH a 7,3 con CsOH.

2. Preparazione per il giorno di registrazione

  1. Per preparare una membrana di nitrocellulosa con fori aperti, punch manualmente la membrana con un perforatore personalizzato fatto da un smussata 16 G ago della siringa e appiattire la membrana tra due lastre di vetro pulite. Per un all'in- grossomontare retina, fare un foro centrale di 0,2 mm di diametro e circondarla da 4 fori più grandi che sono 1-1,2 mm di diametro.
  2. Per fare un filamento di riempimento personalizzato per caricare soluzione interna in elettrodi, sciogliere un puntale 10 microlitri nel mezzo e allungare delicatamente la parte fusa fino a quando si raffredda e si indurisce. Appena prima dell'uso, utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare il filamento finché è leggermente più lungo le pipette di patch.
  3. Tirare le pipette di patch in un estrattore programmabile da tubo di vetro borosilicato con un filamento interno. Fabbricazione le micropipette il giorno dell'esperimento e utilizzarli immediatamente.
    NOTA: per ZSC registrazione, usiamo la seguente impostazione puller: calore: 484; tirare: 0; Velocità: 25; tempo di ritardo: 1; pressione: 400 e un valore di rampa 462. L'OD e ID dei tubi borosilicato sono rispettivamente di 1,65 millimetri e 1,0 mm. La resistenza delle pipette è 10-14 MW.
  4. Una h prima della raccolta dei tessuti, scongelare un tubo di soluzione interna per shaking su un vortex per> 30 min.

3. Retina Dissection

  1. Anestetizzare l'animale del 4% isoflurano in ossigeno fino a quando l'animale perde la reattività di un pizzico dito del piede. Sacrificare l'animale da dislocazione cervicale.
  2. Tagliare due bulbi oculari fuori i nervi ottici a distanza dalle teste del nervo ottico con Iris rette punte forbici 1-2 mm.
  3. Lancia i bulbi oculari su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il sangue e poi immergerli in una soluzione carbogenated mammiferi di Ringer. Effettuare un foro sul limbus con un ago G 23 e bisect bulbi oculari tagliando lungo il limbus con micro-forbici. Rimuovere la cornea e la lente utilizzando una pinza sottile.
    1. Per retina tutto il montaggio, rimuovere delicatamente tutta la retina fuori dell'epitelio pigmentato con una pinza sottile e fare tagli quattro 1,5-2 mm ortogonali dal bordo verso la testa del nervo ottico.
  4. Immergere una membrana di nitrocellulosa perforato nel piatto e trascinare delicatamente la retina su di esso conil GCL verso l'alto. Mettere la testa del nervo ottico nel foro centrale quando si prepara un tutto il montaggio della retina. Trasferire la membrana della retina in un altro piatto pulito. appiattire delicatamente la retina con un pennello fine per assomigliare ad una croce di Malta e porre i quattro bordi sui fori.
    1. Se una frazione della retina è da esaminare alla volta, tagliare ogni eyecup preparati dal punto 3.3 in 3-4 pezzi con una lama di rasoio con l'epitelio pigmentato rimane attaccato. Proteggere i pezzi inutilizzati dalla luce in soluzione esterna carbogenated e utilizzarli entro 12 ore.
  5. Tamponare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta da filtro asciutta e rimuovere la membrana vitreo e interna limitativo con una pinza e un pennello.
  6. Assicurarsi che tutti i bordi retiniche sono completamente attaccati alla membrana prima di trasferire il gruppo nella camera di registrazione con una copertura in vetro sigillato antiscivolo sul fondo. Fissare la membrana con grasso vuoto per la polizza di copertura e rehydratvia e la retina con la soluzione esterna. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d'aria sotto l'assemblaggio.
  7. Impostare la camera sulla scena di un microscopio verticale. Profumato la camera con acqua calda (34-35 ° C) soluzione esterna carbogenated ad una velocità di ~ 3 ml al minuto.
  8. Esaminare la retina sotto una lente obiettivo 10X prima, e poi utilizzare un obiettivo 60x acqua-immersion per vedere i neuroni GCL e INL sotto contrasto interferenziale differenziale (DIC) e / o epifluorescenza. Per visualizzare ZSC tdTomato esprimenti, utilizzare una sorgente di luce bianca in combinazione LED con un filtro di eccitazione di 554 nm e un filtro di emissione di 581 nm.

4. patch clamp whole-cell da Flat-mount Retina

  1. Filtrare la soluzione attraverso un filtro interno siringa nel filamento riempimento personalizzato.
  2. Inserire il filamento in una micropipetta appena spillata e dispensare la soluzione interna vicino alla punta fino a che la soluzione copre il filo elettrodo d'argento per>5 mm. Fissare la micropipetta su un portaelettrodo con un palo di aspirazione, attraverso il quale la pressione all'interno dell'elettrodo può essere regolata premendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 ml tubo collegato.
  3. Trova la pipetta sotto l'obiettivo e portarlo fino a ~ 100 micron sopra la retina. Sotto la modalità corrente-seguace (I = 0), utilizzare offset DC a zero il segnale di tensione continua in piedi. Misurare la resistenza pipetta sotto il morsetto modalità corrente (I morsetto) iniettando corrente ad onda quadra di ampiezza fissa tramite la pipetta mentre è nel bagno e neutralizzare la differenza ruotando la manopola raccess. Utilizzare la lettura sulla manopola raccess per calcolare la resistenza pipetta dalla legge di Ohm.
  4. Portare lentamente l'elettrodo a ~ 10 micron sopra la retina. Applicare pressione positiva all'elettrodo. Guarda il cambiamento riflessione vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina la retina. Rapidamente, ma delicatamente forzare la pipetta nel GCL e ridurre il PRESSU positivori immediatamente.
  5. Spostare la pipetta verso un neurone etichettati. Evitare il contatto con altri neuroni, vasi sanguigni e delle cellule endfeet Muller. Applicare una pressione più positivo, se necessario, per evitare l'intasamento degli elettrodi.
  6. Posizionare la punta della pipetta vicino alla linea mediana di un neurone marcato fino a quando una fossetta è visibile. Rilasciare la pressione positiva e lasciare la membrana plasmatica di riprendersi sulla punta della pipetta.
  7. Applicare 20 a 120 pA correnti negative alla pipetta per aiutare la formazione di una tenuta giga ohm. Applicare una delicata aspirazione se necessario tirare la membrana plasmatica nella pipetta. Attendere 5 min dopo la formazione della guarnizione di rottura della membrana cellulare. In questo modo la soluzione interna versato viene controllata da superfusione. Rompere la membrana da una delicata aspirazione.
  8. Dopo la rottura della membrana e in modalità morsetto corrente, accendere l'equilibrio ponte e regolarlo con la manopola raccess.
    NOTA: Per una piccola cella come il SAC, è necessaria solo leggero aggiustamento, se presente. Alterntivamente, registrare eccitatorio e le correnti post-sinaptiche inibitorie in modalità morsetto tensione (V morsetto) tenendo il cellulare a potenziali inversione di cloruro (circa -75 mV) e il glutammato (circa 0 mV), rispettivamente. Controllare e regolare la posizione della pipetta, se necessario, per ospitare retina occasionale e / o micromanipolatore deriva.
  9. Per registrare potenziale di membrana o variazione di corrente prima, durante e dopo il trattamento farmacologico, preparare bloccanti sinaptiche (ad esempio, CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarina, etc.) e modulatori dei canali (ad esempio, flupirtina, dopamina, acido meclofenamico, ecc) fresco su il giorno dell'esperimento dalle scorte congelati. Diluire i farmaci con la soluzione carbogenated di Ringer. applicarle in maniera lotto attraverso la perfusione.
  10. Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma. Trasferire il gruppo dalla camera di un piatto pulito. Staccare e ricollegare la retina su un altro membrana di nitrocellulosa appiattita senza Hol perforatoES per garantire la planarità della retina durante la fissazione.
  11. Fissare la retina immergendolo in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a RT. Rimuovere la retina dalla membrana di nitrocellulosa e risciacquare a lungo con PBS 1x. Rivela la morfologia delle cellule registrate da O / N colorazione con streptavidina colorante coniugato diluito in PBS 1x con 0,4% Triton X-100 a 4 ° C 14. Montare la retina in media antifade e osservare le cellule registrati utilizzando un microscopio confocale a scansione.
    NOTA: Le procedure che coinvolgono paraformaldeide, che è volatile e tossica, dovrebbero essere condotte in un progetto da camera per la sicurezza.

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Representative Results

Registrazioni rappresentativi di on e off-tipo ZSC da una retina deafferentated del mouse sono mostrati in figura 1. Le cellule colinergici sia in GCL e INL può essere attendibilmente identificate da tdTomato fluorescenza e mirati per la cellula intera registrazione patch clamp sotto DIC (Figura 1A) a rivelare l'oscillazione dei loro potenziali di membrana (in alto tracce) e le correnti sinaptiche che la determinano (tracce di fondo, figura 1b). Correnti sinaptiche inibitorie ed eccitatorie sono rivelati tenendo le cellule a 0 mV e -75 mV, rispettivamente in condizioni di clamp di tensione (Figura 1B, tracce di fondo). Tipici dendritiche livelli arborization e stratificazione SAC nel IPL (Figura 1C) possono essere visualizzati dal post-hoc streptavidina colorazione per la biocitina dializzata internamente. La ritmicità e la frequenza del potenziale di membrana fluttuazioni e cambiamenti in corso post-sinaptici puòessere quantificato calcolando la densità spettrale di potenza. Blocco farmacologico, o la sua mancanza, possono essere utilizzati per distinguere diversi meccanismi sinaptici sottostanti potenziale di membrana di oscillazione 7.

Figura 1
Figura 1. Morfologia e membrane potenziali di bilancio e fuori starburst cellule amacrine nella retina di topo Nob. (A) sia on-ZSC a GCL e OFF-ZSC a INL sono stati facilmente identificati da espressioni tdTomato Cre-driven e mirati per la registrazione sotto DIC. bar scala uguale 20 micron come indicato. (B) Le tracce superiori sono membrane potenziali variazioni registrate dalla cassa e fuori ZSC come indicato. Le tracce inferiori sono rappresentativi corrente post-sinaptica eccitatoria ritmica (EPSC) che guidano l'oscillazione del potenziale di membrana e la corrente post-sinaptica inibitoria aritmico (IPSC). (C) Post hoc istologica caratterizzazione delle cellule registrate indica le tipiche dendritiche livelli morfologia e stratificazione SAC in IPL. Bar scala uguale a 50 micron, come indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Molti laboratori hanno registrato dai neuroni GCL nella preparazione 15-18 TV a monte, ma le nostre procedure consentono la registrazione da neuroni INL. Con la presente sottolineare diversi passaggi che sono fondamentali per le registrazioni di routine di successo.

La freschezza e planarità della retina sono importanti per penetrare con una pipetta di registrazione. A questo proposito, il fermo attaccamento della retina alla membrana di nitrocellulosa perforato è fondamentale e si ottiene l'assorbimento transiente della soluzione seguito da reidratazione tempestiva (Passo 3,4-3,6). Durante questo breve periodo, di solito meno di 30 secondi, il vitreo si comporta come una gelatina allentata e può essere staccata. La nostra tecnica è più efficiente rispetto alle diverse procedure pubblicate, dove il vitreo viene rimosso manualmente in soluzione 17,19 o da azioni enzimatiche 18,20. Un altro metodo utilizzato di frequente è quello di strappare la membrana limitante interna off utilizzando un pipetta di patch vuoto per ogni cellada registrare 21,22. Non abbiamo perseguire il metodo strappo per paura di smontaggio della retina. Tuttavia, peeling off vitrea in qualche modo trasparente e gelatinosa può a volte staccare la retina dalla membrana. Si tratta quindi di un passo che richiede pratica la conservazione della retina sulla membrana di nitrocellulosa è essenziale per la registrazione neuroni INL. Una buona pratica è quella di utilizzare la membrana di nitrocellulosa ben appiattita e completamente idratata. Un punto degno di nota qui è l'apparente compromesso tra l'area registrabile (cioè, la dimensione di un foro punzonato), la planarità della retina, e la fermezza di attacco alla membrana. Una finestra di registrazione più grande è preferibile ma un foro punzonato grande significa che c'è area della membrana inferiore per la retina da allegare al. Analogamente, il montaggio della retina sopra un foro più piccolo assicura allegato aperta planarità può essere ridotto, e quindi è area registrabile.

Per inserire un elettrodo attraverso il vitreo inil GCL e INL (punto 4.4), si applica una pressione positiva per evitare inceppamenti elettrodo. La riduzione immediata di questa pressione sulla penetrazione nella retina è essenziale anche per ridurre la colorazione di fondo e per preservare oscillazione. Un importante punto di controllo è quello di abbreviare il tempo tra penetrazione e ottenere la tenuta, preferibilmente minore di 30 secondi per i neuroni GCL ed entro 60 secondi per i neuroni INL. Un altro aspetto importante è il periodo di attesa 5 min dopo la formazione del sigillo giga ohm e prima delle rottura della membrana. Questo periodo di attesa assicura la compensazione della soluzione interna versato nel percorso dell'elettrodo ed è particolarmente rilevante quando una soluzione interna base di potassio viene utilizzato perché l'alto contenuto di potassio può depolarizzare temporaneamente neuroni vicini e disturbare oscillazione. Infine, una caratteristica un po 'non convenzionale del nostro approccio (Step 4.7) è che ci avviciniamo a un cellulare, formano un sigillo giga ohm, e quindi ottenere l'accesso a cellula intera sotto il mo pinza correntede, come consigliato dal Dr. Rory McQuiston della Virginia Commonwealth University, che ci ha aiutato con le nostre registrazioni elettrofisiologiche iniziali. Questo metodo permette la variazione di resistenza rapido su break-in per essere catturato da cambiamenti di tensione (visibili attraverso un oscilloscopio) e protegge la cellula registrata dalla improvvisa oscillazione del potenziale di membrana a livello di tutta la cellula. Un'altra caratteristica utile del nostro metodo è la corrente negativa applicata alla punta dell'elettrodo, che aiuta ad attirare fosfolipidi di membrana carica positiva e facilita la formazione di tenuta.

Per quanto riguarda la conservazione circuiti retinici laterali, una preparazione fette orizzontale della retina 20 è stato suggerito. Mentre questo metodo espone efficacemente i dendriti espansione orizzontale e connessioni sinaptiche nel IPL per la registrazione e l'imaging, il percorso verticale è purtroppo interrotto e quindi questo metodo può essere utilizzato solo per scopi limitati. Infine, le raffinatezze che implementano inprocedure di preparazione dei tessuti e di registrazione consentono di routine mirata registrazioni di neuroni INL, come OFF-ZSC 7. Incorporando l'imaging a due fotoni e contrasto migliorando la microscopia, mira le cellule bipolari e le cellule orizzontali nei pressi dello strato plessiforme esterno per la registrazione in condizioni di illuminazione patch clamp è ora considerato fattibile in un preparato flat-mount.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fixed-stage fluorescent microscope with DIC Olympus BX51-WI
Micromanipulators Sutter MP-225
Patch clamp amplifier A-M System AM2400
AD converter National Instrument NI-USB-6221
Heater controller Warner Instrument TC-324B
Inline heater Warner Instrument SC-20
Peristaltic pump Rainin Dynamax
pipette puller Sutter Instrument P-1000
Glass tube with filament King Precision Glass Customized
Stimulator A.M.P.I. Master-8
Biocytin Sigma B4261
NaCl Sigma S6191
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Fisher BP328-1
Na2HPO4 Sigma S0876
Na2HPO4 Sigma S5011
CaCl2 Sigma C5670
MgSO4 Sigma M1880
D-glucose Sigma G6152
K-gluconate Sigma G4500
ATP-Mg Sigma A9187
Li-GTP Sigma G5884
EGTA Sigma E0396
HEPES Sigma H4034
KOH Sigma P5958
Cs-methanesulfonate Sigma C1426
CsOH Sigma 232041
Syringer filter Nalgene 171
1 ml syring Rainin 17013002
10 μl pipette tip Genesee Scientific 24-130RL
Streptavidin-488 ThermoFisher S-11223
10x PBS Lonza 17-517Q

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References

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Tu, H. Y., Hsu, C. C., Chen, Y. J., Chen, C. K. Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina. J. Vis. Exp. (116), e54608, doi:10.3791/54608 (2016).

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