Summary
Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.
Abstract
La retina de mamífero es un tejido en capas compuesta de múltiples tipos neuronales. Para entender cómo las señales visuales se procesa dentro de su red sináptica intrincada, registros electrofisiológicos se utilizan con frecuencia para estudiar las conexiones entre las neuronas individuales. Hemos optimizado un preparado de montaje plana para la grabación de patch clamp de neuronas marcadas genéticamente en tanto GCL (capa de células ganglionares) y INL (capa nuclear interna) de las retinas de ratones. Grabación de las neuronas en INL-montajes planos se ve favorecida sobre las rebanadas porque las conexiones verticales y laterales se conservan en la antigua configuración, permitiendo que los circuitos de la retina con grandes componentes laterales para ser estudiado. Hemos utilizado este procedimiento para comparar las respuestas de las neuronas espejo, mediante asociación en las retinas como las células amacrinas starburst colinérgicos (ZEC).
Protocol
Ética aprobación - los procedimientos que implican sujetos animales se realizaron de conformidad con las reglas y regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud de los animales de investigación, tal como fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el uso comité de Baylor College of Medicine.
1. externa y de soluciones internas
- Use la solución de Ringer de mamíferos durante la disección retina y como la solución externa de registro electrofisiológico posterior. Preparar la solución de Ringer mamífero de la solución madre 10x (sin calcio) en el día de la grabación, y añadir CaCl2 gota a gota, después de 15 minutos de carbogenation (95% de O2 y 5% de CO 2). La solución final 1x contiene (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 y 10 D-glucosa.
- Use dos soluciones internas para caracterizar las oscilaciones SAC. Pruebala utilidad de las soluciones preparadas en las grabaciones de patch clamp de células enteras prolongados en CGR de ratón adulto y almacenar los lotes verificados en 500 ml de alícuotas a -20 ° C hasta su uso.
- Para la grabación de potencial de membrana de oscilación, utilice una solución interna a base de potasio que contiene (en mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina (w / v). Ajustar el pH a 7,3 con KOH.
- Para la grabación de excitación y de las corrientes postsinápticas inhibitorias, utilice una solución interna a base de cesio que contiene (en mM): 100 Cs-metanosulfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina ( Virginia Occidental). Ajustar el pH a 7,3 con CsOH.
2. Preparación para el Día de la grabación
- Para preparar una membrana de nitrocelulosa con los agujeros abiertos, perforar manualmente la membrana con un golpeador personalizada a partir de una 16 G aguja de la jeringa romo y aplanar la membrana entre dos placas de vidrio limpias. Por su conjunto-montar retina, hacer un agujero central de 0,2 mm de diámetro y rodearlo de 4 agujeros más grandes que son 1-1,2 mm de diámetro.
- Para hacer un filamento de material de relleno a medida para cargar solución interna en los electrodos, fundir una punta de pipeta de 10 l en el medio y alargar suavemente la parte fundida hasta que se enfría y se endurece. Justo antes de usar, usar una hoja de afeitar limpia para cortar el filamento hasta que es ligeramente más largo que las pipetas de parche.
- Tire de pipetas de parche en un extractor programable de tubo de vidrio de borosilicato con un filamento interno. Fabricación las micropipetas el día del experimento y utilizarlos inmediatamente.
NOTA: Para las ZEC de grabación, se utiliza la siguiente configuración de tirador: calor: 484; tire: 0; velocidad: 25; el tiempo de retardo: 1; presión: 400 y un valor de rampa de 462. El OD e ID de los tubos de borosilicato son 1,65 mm y 1,0 mm, respectivamente. Resistencia de las pipetas es 10-14 mO. - Una hora antes de la cosecha de tejidos, descongelar un tubo de solución interna por Shaking en un vórtice para> 30 min.
3. La disección de la retina
- Anestesiar al animal en un 4% de isoflurano en oxígeno hasta que el animal pierde la capacidad de respuesta a una pizca dedo del pie. Sacrificar al animal por dislocación cervical.
- Corte ambos globos oculares fuera de los nervios ópticos a 1-2 mm de distancia de las cabezas del nervio óptico con Iris-rectas señalado tijeras.
- Rollo de los globos oculares en una toalla de papel limpia para eliminar la sangre y luego sumergirlos en una solución de Ringer carbogenated mamíferos. Haz un agujero en el limbo con una aguja de 23 G y la bisectriz de los globos oculares cortando a lo largo del limbo con micro-tijeras. Retire la córnea y el cristalino utilizando unas pinzas finas.
- Para todo el montaje de la retina, pelar suavemente toda la retina fuera del epitelio pigmentado con unas pinzas finas y hacer cortes cuatro 1,5-2 mm ortogonales desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico.
- Sumergir una membrana de nitrocelulosa perforado en el plato y arrastrar suavemente sobre la retina conGCL el lado hacia arriba. Coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central en la preparación de todo el montaje en una retina. La transferencia de la membrana con la retina en otro plato limpio. aplanar suavemente la retina con un pincel fino para parecerse a una cruz de Malta y sentar los cuatro bordes a través de los agujeros.
- Si una fracción de la retina debe ser examinado en un momento, corte cada ocular preparado a partir de la Etapa 3.3 en 3-4 piezas con una cuchilla de afeitar con el epitelio pigmentado permanece unido. Proteger las piezas no utilizadas de la luz en la solución externa carbogenated y usarlos dentro de las 12 horas.
- Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel de filtro seco y eliminar la membrana limitante interna vítreo y con unas pinzas y un pincel.
- Asegúrese de que todos los bordes de la retina están totalmente unidos a la membrana antes de transferir el conjunto en la cámara de grabación con un cubreobjetos de vidrio sellado en la parte inferior. Asegure la membrana con grasa de vacío a la hoja de la cubierta y rehydrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire debajo de la asamblea.
- Ajuste la cámara en el escenario de un microscopio vertical. Perfundir la cámara con (34-35 ° C) solución externa caliente carbogenated a una velocidad de ~ 3 ml por min.
- Examinar la retina bajo una lente objetivo de 10x primero y, a continuación, utilizar una lente de 60x de inmersión en agua para ver neuronas GCL y INL bajo contraste de interferencia diferencial (DIC) y / o de epifluorescencia. Para visualizar las ZEC tdTomato expresan, utilice una fuente de luz blanca LED en combinación con un filtro de excitación de 554 nm y un filtro de emisión de 581 nm.
4.-Patch Clamp células enteras de grabación del plano de montaje en la retina
- Filtrar la solución interna a través de un filtro de jeringa en el filamento relleno personalizado.
- Inserte el filamento en una micropipeta recién tirada y dispensar la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubre el electrodo de alambre de plata para>5 mm. Sujetar la micropipeta sobre un soporte del electrodo con un poste de succión, a través del cual la presión dentro del electrodo se puede ajustar empujando o tirando el émbolo de una jeringa de plástico de 10 ml de tubo conectado.
- Encuentra la pipeta con arreglo al objetivo y llevarlo hasta ~ 100 m por encima de la retina. Bajo el modo actual seguidor (I = 0), el uso DC offset a cero la señal de tensión de corriente continua de pie. Mida la resistencia de la pipeta bajo la grapa de corriente en modo (I Clamp) mediante la inyección de corrientes de onda cuadrada de amplitud fija a través de la pipeta mientras está en el baño y neutralizar la diferencia girando el mando rAccede. Utilice la lectura en el pomo rAccede para calcular la resistencia de la pipeta por la ley de Ohm.
- Poco a poco llevar el electrodo de ~ 10 m por encima de la retina. Aplicar presión positiva al electrodo. Ver el cambio de la reflexión cerca de la punta de la pipeta cuando se aproxima a la retina. Rápidamente, pero forzar suavemente la pipeta en el GCL y reducir el pressu positivovolver inmediatamente.
- Mover la pipeta hacia una neurona marcada. Evitar el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y endfeet de células de Muller. Aplique presión más positiva si es necesario para evitar la obstrucción del electrodo.
- Coloque la punta de la pipeta cerca de la línea media de una neurona marcada hasta un hoyuelo es visible. Liberar la presión positiva y permitir que la membrana plasmática para rebotar de nuevo en la punta de la pipeta.
- Aplicar 20 a 120 pA corrientes negativas a la pipeta para ayudar a la formación de un sello giga-ohm. Aplicar una succión suave si es necesario tirar de la membrana plasmática en la pipeta. Esperar 5 min después de la formación del sello a la ruptura de la membrana celular. Esto permite que la solución interna derramado a que se solucione mediante superfusión. Romper la membrana por una suave succión.
- Después de la ruptura de la membrana y en el modo de fijación de corriente, cambiar el equilibrio del puente y ajustar con el mando rAccede.
NOTA: Para una pequeña celda como el SAC, sólo es necesario un ligero ajuste, en su caso. Alterntivamente, ficha excitatoria y inhibitoria postsináptica corrientes en el modo de fijación de voltaje (V Clamp) por la celebración de la célula en los potenciales de inversión de cloruro (alrededor de -75 mV) y glutamato (en torno a 0 mV), respectivamente. Comprobar y ajustar la posición de la pipeta si es necesario para dar cabida a la retina ocasional y / o la deriva micromanipulador. - Para grabar el potencial de membrana o cambio de corriente antes, durante y después del tratamiento farmacológico, preparar bloqueadores sinápticas (por ejemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) y moduladores del canal (por ejemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenámico, etc.) fresca en el día del experimento de las existencias congeladas. Diluir los fármacos con solución de Ringer carbogenated. Aplicarlos de manera lotes a través de la perfusión.
- Después de la grabación, eliminar suavemente la pipeta del soma. Transferir el conjunto de la cámara a un plato limpio. Desconecte y vuelva a colocar la retina en otra membrana de nitrocelulosa aplanado y sin hol perforadaes para asegurar la planitud retina durante la fijación.
- Fijar la retina por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 30 min a RT. Retire la retina de la membrana de nitrocelulosa y enjuagarlo extensamente con PBS 1x. Revelar la morfología de las células registradas por O tinción / N con estreptavidina conjugada con colorante diluido en 1x PBS con 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Montar la retina en un medio antifade y observar las células grabados utilizando un microscopio confocal de barrido.
NOTA: Los procedimientos que implican paraformaldehído, que es volátil y tóxico, deben llevarse a cabo en un proyecto de la cámara de seguridad.
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Representative Results
Grabaciones representativas de dentro y fuera de tipo ZEC de una retina del ratón deafferentated se muestran en la Figura 1. Células colinérgicas en tanto GCL y INL se pueden identificar de forma fiable mediante fluorescencia tdTomato y específicas para la grabación de células enteras patch clamp bajo DIC (Figura 1A) para revelar la oscilación de sus potenciales de membrana (Top trazas) y las corrientes sinápticas que la impulsan (trazas de fondo, la figura 1B). Las corrientes sinápticas inhibitorias y excitatorias se revelan mediante la celebración de las células a 0 mV y -75 mV, respectivamente, en condiciones de fijación de voltaje (Figura 1B, los rastros de fondo). Los niveles típicos de arborización dendríticas y estratificación del SAC en la IPL (Figura 1C) pueden ser visualizados por tinción de post hoc para la estreptavidina biocitina dializada interna. La ritmicidad y la frecuencia de fluctuación potencial de membrana postsináptica y cambios actuales puedencuantificarse mediante el cálculo de la densidad espectral de potencia. Bloqueo farmacológico, o la falta de ella, se puede utilizar para discernir los diferentes mecanismos subyacentes sinápticas potencial de membrana de oscilación 7.
Figura 1. Morfología y potenciales de membrana dentro y fuera del starburst de células amacrinas de la retina del ratón. Nob (A) tanto en el SAC en GCL y fuera de las ZEC en INL fueron identificados fácilmente por la expresión tdTomato impulsado por Cre y específica para la grabación bajo DIC. Las barras de escala son iguales a 20 micras como se indica. (B) Los principales vestigios son los cambios potenciales de membrana grabadas desde dentro y fuera de las ZEC como se indica. Las huellas son inferiores corriente postsináptica excitatoria rítmica representante (EPSC) que impulsan la oscilación de potencial de membrana y la corriente postsináptica inhibidora arrítmico (IPSC). (C) Post hoc caracterización histológica de células grabadas indica los niveles típicos dendríticas morfología y estratificación del SAC en la IPL. Las barras de escala son iguales a 50 micras como se indica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Muchos laboratorios han registrado desde las neuronas GCL en la preparación 15-18 plana de montaje, pero nuestros procedimientos permiten la grabación de las neuronas de la INL. Por la presente hacemos hincapié en varios pasos que son críticos para las grabaciones de rutina con éxito.
La frescura y planeidad de la retina son importantes para penetrar en él con una pipeta de grabación. En este sentido, la firma de la unión de la retina a la membrana de nitrocelulosa perforado es de suma importancia y se consigue por la absorción transitoria de la solución seguido de rehidratación oportuna (Paso 3.4 a 3.6). Durante este corto periodo, por lo general menos de 30 segundos, el vítreo se comporta como una gelatina suelta y se puede desprender. Nuestra técnica es más eficiente cuando se compara con varios procedimientos publicados, donde se extrae el vítreo manualmente en solución de 17,19 o por acciones enzimáticas 18,20. Otro método utilizado con frecuencia se refiere a quitar la membrana limitante interna fuera usando una pipeta de parche para cada celda vacíaa grabar 21,22. Nosotros no seguimos el método de rasgadura por temor a desmontar la retina. Sin embargo, el pelado de la fuera vítrea algo transparente y gelatinosa en ocasiones puede desalojar la retina de la membrana. Por lo tanto, este es un paso que requiere la práctica como el mantenimiento de la retina en la membrana de nitrocelulosa es esencial para la grabación de las neuronas de la INL. Una buena práctica es utilizar una membrana de nitrocelulosa bien aplanada y completamente hidratado. Un punto digno de mención aquí es la aparente compromiso entre el área de grabación (es decir, el tamaño de un agujero perforado), la planitud de la retina, y la firmeza de unión a la membrana. Se prefiere una ventana de grabación más grande, pero un agujero perforado más grande significa que hay menos área de membrana de la retina para adjuntar a. Del mismo modo, el montaje de la retina a través de un agujero más pequeño asegura fijación firme pero planitud se puede reducir, y también lo es el área grabable.
Para insertar un electrodo a través del vítreo enla CGT y la INL (Paso 4.4), se aplica una presión positiva para evitar que se atasque electrodo. La reducción inmediata de esta presión sobre la penetración en la retina también es fundamental para la reducción de la tinción de fondo y para la conservación de la oscilación. Un punto de control importante es acortar el tiempo entre la penetración y la obtención de la junta, preferiblemente menos de 30 segundos para las neuronas GCL y dentro de 60 seg para las neuronas INL. Otro punto importante es el período de espera de 5 minutos después de la formación de la junta giga-ohmios y antes de romperse la membrana. Este periodo de espera asegura la limpieza de la solución interna derramado en la trayectoria del electrodo y es especialmente relevante cuando una solución interna basada potasio se utiliza porque el alto contenido de potasio puede despolarizar temporalmente neuronas vecinas y perturbar oscilación. Por último, una característica poco convencional de nuestro enfoque (Paso 4.7) es que nos acercamos a una célula, formar un sello giga-ohmios, y luego acceder de células enteras bajo el mo pinza de corrientede, según lo aconsejado por el Dr. Rory McQuiston de Virginia Commonwealth University, que nos ayudó con nuestros registros electrofisiológicos iniciales. Este método permite que el cambio de resistencia rápida sobre robo para ser capturado por los cambios de tensión (visibles a través de un osciloscopio) y protege la célula registrada de la repentina oscilación del potencial de membrana en el nivel de célula entera. Otra característica útil de este método es la corriente negativa aplicada a la punta del electrodo, lo que ayuda a atraer a los fosfolípidos de membrana cargados positivamente y facilita la formación de sellado.
Con respecto a la preservación de los circuitos de la retina laterales, se ha sugerido una preparación horizontalmente en rodajas de la retina 20. Si bien este método expone de manera eficiente las dendritas horizontalmente en expansión y conexiones sinápticas en el IPL para la grabación y de formación de imágenes, la vía vertical está lamentablemente interrumpida y por lo tanto este método sólo se puede utilizar para fines limitados. Por último, los refinamientos que implementan enlos procedimientos de preparación de tejidos y permiten la grabación de rutina dirigido grabaciones de las neuronas INL como ZEC OFF-7. Mediante la incorporación de dos fotones de imágenes y microscopía de contraste mejora, dirigido a las células bipolares y células horizontales cerca de la capa plexiforme externa de patch clamp grabar bajo diferentes condiciones de iluminación que ahora se considera factible en una preparación plana de montaje.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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