Introduction
المجتمعات البكتيرية متعددة الخلايا تلعب أدوارا هامة في البيئات الطبيعية والبشرية، ويمكن أن تكون مفيدة أو ضارة للغاية. ومن المعروف أن هذه المستعمرات متعددة الخلايا كما الأغشية الحيوية، حيث يتم تضمين الخلايا الفردية في المواد البوليمرية خارج الخلية الذات المنتجة (EPS) المصفوفة. العائد على السهم تلتزم بقوة الخلايا على سطح أنها استعمار. أنها بمثابة درع ضد القوات الميكانيكية والكيميائية وإنشاء اتصال وثيق بين الخلايا المجاورة، وتسهيل الاتصالات الخلوية 1. يمكن مشاهدة بيوفيلم كمجتمع متباينة، حيث تستخدم الخلايا درجة عالية من التنظيم، منسقة عمليات لتنسيق أنشطتها داخل المجتمع، وكذلك عبر الأنواع 2-5. وكثيرا ما يرتبط الانتقال من العوالق، ووضع حرة المعيشة للنمو إلى حالة بيوفيلم مع العمليات التنموية. وخير مثال هو بكتيريا التربة العصوية الرقيقة موجبة الجرام، وبالتالي على undomeيخدم سلالة sticated كما كائن نموذج قوي لدراسة مراحل النمو مما يؤدي إلى تشكيل بيوفيلم. في هذه البكتيريا وخلايا متحركة تنظيم أنفسهم في هياكل متعددة الخلايا واضح لتنفيذ مهام متخصصة 4. مجموعة واحدة من الخلايا، المنتجين مصفوفة تفرز exopolysaccharides 6، بروتين اميلويد الطاسه 7،8، والبروتين للا مائية سطح BslA 9،10. وكلها مشاركة في الجمعية العامة للEPS 11-13.
وبالنظر إلى وفرة من الأغشية الحيوية في المنافذ الطبيعية والبشرية والضرر القاتل المفترض أنها يمكن أن تسبب، هناك حاجة ملحة لايجاد سبل لمنع تكونها. يمكن مثبطات جزيء صغير مساعدة في اكتشاف مسارات تنظيمية جديدة، والانزيمات والبروتينات الهيكلية تشارك في تشكيل بيوفيلم، وبالتالي تعزيز الرؤى في العمليات المعقدة التجمع مجتمع متعدد الخلايا. كما B. الرقيقة هو نموذج المدروس لالحيويتشكيل الفيلم 14،15، ويمكن استخدامه لتقييم آثار مختلف مثبطات بيوفيلم. تتناول هذه الدراسة أربعة أساليب الأساسية التي هي مفتاح لتقييم استجابة من الأغشية الحيوية لمثبطات جزيء صغير. أولا، للتأكد من أن هذه المثبطات لديها هدف محدد بيوفيلم، والفصل بين تأثير على نمو العوالق من التأثير على تشكيل بيوفيلم أمر بالغ الأهمية. معظم وكلاء المضادة للبكتيريا تستهدف الخلايا في مرحلة النمو العوالق، ولكن الجزيئات التي تستهدف حياة بيوفيلم نادرة. بالإضافة إلى ذلك، كما الجزيئات التي لا تؤثر على نمو العوالق ليست سامة، يمكن أن تقلل من الضغط الانتقائي لصالح المسوخ المقاومة للمضادات الحيوية 16. على سبيل المثال، عندما يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع الأحماض الأمينية-D أو بعض الجزيئات الأخرى خلية التدخل الجدار، إما بالانزعاج هم أو تفكيكها، ولكن هذه المثبطات فقط تؤثر أقل ما يقال 12،17 نمو العوالق. في المقابل، العديد من المضادات الحيوية يضعف بشكل كبير نمو العوالق، مع لإيتل أو أي تأثير على تشكيل بيوفيلم 17.
ثانيا، وضع إطار تجريبي ثابت وقوي لدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة أمر بالغ الأهمية. لاحظنا أن نطاق تركيز نشط من مثبطات جزيء صغير حساس للشروط مسبقة الثقافة والإعداد التجريبية المستخدمة لدراسة تأثير هذه المثبطات جزيء صغير. تقارير مختلفة، لا سيما أولئك الذين يدرسون B. الرقيقة، وكشف الاختلافات في مدى التركيز الذي الأحماض الأمينية-D تمنع تشكيل pellicles - العائمة الأغشية الحيوية البكتيرية 12،17-19. وتشير النتائج المعروضة هنا أن العوامل التالية تمثل اختلافات في مدى تركيز نشاط: من شروط مسبقة ثقافة (لوغاريتمي 12،17 مقابل مرحلة نمو 20 في وقت متأخر من ثابتة)، ومتوسط النمو المستخدمة في حالة ما قبل الثقافة (الأغنياء، غير معروف [لوريا مرق، LB] مقابل يعرف [الغلوتامات أحادية الصوديوم-glycerol، MSgg])، ونسبة التلقيح وخصوصا إزالة المتوسطة قبل الثقافة قبل التلقيح. وأظهرت درجة حرارة النمو جليدة ثابت دورا أقل أهمية في نطاق نشاط صغير جزيء المانع D-ليسين، وهو حمض تمثيلي-D الأمينية المستخدمة في هذه الدراسة.
وأخيرا، مرة واحدة يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع مثبطات بيوفيلم محددة، يطلب من وسائل قوية ومفيدة لوصف آثار هذه المثبطات على اللياقة البدنية بيوفيلم. هنا، يتم وصف طريقتين لوصف مستقل تأثير مثبطات جزيء صغير بالتفصيل: (1) تأثير على الخلايا وحيدة داخل مستعمرة بيوفيلم ومقاومتها للمضادات الحيوية. الخلايا في الأغشية الحيوية تكون في العادة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية بالمقارنة مع البكتيريا التي تعيش خالية من 21-23. رغم أن هذه الظاهرة هي سياقاتها، وغالبا ما تعتبر قدرة EPS للحد من تغلغل المضادات الحيوية كتفسير جذابة 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تقييم تأثير الصغيرة جزيء المانعون على جليدة وبيوفيلم مستعمرة تشكيل
- يعد حل 2X من المعرفة الذي يحفز بيوفيلم MSgg المتوسطة 25 دون كلوريد الكالسيوم والحديد (III) هيدرات كلوريد. بعد تصفية التعقيم، إضافة كلوريد الكالسيوم. وسيلة جاهزة للاستخدام مباشرة أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام.
- إعداد تخفيف 1X MSgg في يوم التجربة.
- تمييع المتوسطة 2X MSgg ل1x أخرى مع الماء المعقم المقطر (pellicles) أو 3٪ الساخن (80 درجة مئوية) أجار معقم (الأغشية الحيوية) وإضافة الحديد (III) هيدرات كلوريد إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر (pellicles) أو 250 ميكرومتر ( الأغشية الحيوية). إضافة المضادات الحيوية أو مثبطات جزيء صغير إلى التركيز المطلوب وتخلط جيدا. على سبيل المثال، للحصول على التركيز النهائي من 0.5 ملي D-ليسين في 30 مل لإنشاء pellicles أو الأغشية الحيوية، إضافة 196.6 ميكرولتر من 76.3 ملم (10 ملغ / مل)-D يسين حل الأسهم.
لاالشركة المصرية للاتصالات: يوصف التركيب 1X MSgg النهائي في الجدول 1 مقارنة الوصفة الأصلية 25، تضمن المتوسطة تم زيادة 50 ميكروغرام / مل ثريونين وتركيز الحديد في النمو المستعمرات بيوفيلم في المتوسط MSgg الصلبة 2.5x و لتحسين مورفولوجيا مستعمرة التجاعيد .
- تمييع المتوسطة 2X MSgg ل1x أخرى مع الماء المعقم المقطر (pellicles) أو 3٪ الساخن (80 درجة مئوية) أجار معقم (الأغشية الحيوية) وإضافة الحديد (III) هيدرات كلوريد إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر (pellicles) أو 250 ميكرومتر ( الأغشية الحيوية). إضافة المضادات الحيوية أو مثبطات جزيء صغير إلى التركيز المطلوب وتخلط جيدا. على سبيل المثال، للحصول على التركيز النهائي من 0.5 ملي D-ليسين في 30 مل لإنشاء pellicles أو الأغشية الحيوية، إضافة 196.6 ميكرولتر من 76.3 ملم (10 ملغ / مل)-D يسين حل الأسهم.
- بعد تصلب أجار، تجفيف لوحات MSgg الصلبة في غطاء البيولوجي ل30-45 دقيقة قبل التلقيح.
- لتحديد مثبطات المحددة التي تتداخل مع آليات تشكيل جليدة (الشكل 1)، يستبعد أن التركيزات المستخدمة تؤثر العوالق ونمو ثابت.
- تحديد نمو العوالق (الزيادة في الكثافة الضوئية على مر الزمن في الثقافة السائلة) في منحنى نمو بسيط عن طريق قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر كل ساعة حتى مرحلة نمو ثابتة.
- للتأكد من أن تعكر ثقافة تقاس يمثل عدد الخلايا الحية، وتحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة (كفو)من الخلايا في مرحلة النمو العوالق من ثقافة الهز بعد عدة نقاط الوقت.
- لتقييم تأثير مثبطات جزيء صغير على النمو جليدة ثابت، وخلايا الحصاد في نهاية الحضانة لمدة 3 أيام في 23 درجة مئوية من خلية ثقافة 24-جيدا جيدا، تلقيح في ظل نفس الظروف كما هو موضح في أقسام 1،7-1،9 وتحديد كفو. لعنصر التحكم هذا، استخدم سلالة جليدة قاصرة تفتقر إلى operons ترميز لمكونات المصفوفة خارج الخلية (أي، B. الرقيقة Δ epsH، Δ الطاسه).
ملاحظة: هذه السلالة قادرة على النمو في ظل ظروف ثابتة، ولكن على النقيض من النوع البري تشكيل جليدة، فمن نقص في القدرة على تطفو إلى واجهة السائل في الهواء، حيث يفضل النمو نتيجة لزيادة مستويات الاوكسجين 26. وهكذا، وهذا المصفوفة خارج الخلية وسلالة جليدة ناقصة هو سلالة المرجعية الموصى بها لتقييم النمو في ظل ظروف ثابتة.
ملاحظة: للحصول على السابقين محددوافرة من غير متعارف عليه-D الأحماض الأمينية D-ليسين هو موضح أدناه، لها تأثير على العوالق ونمو ثابت في تركيزات أن تتدخل تم استبعاد تشكيل جليدة من 12،17. وصفت وسائل لتحديد العوالق ونمو ثابت في التفاصيل 17.
الشكل 1. نظرة عامة المفاهيمية لتحديد الإعداد التجريبي القوي لتقييم تثبيط محددة من تشكيل بيوفيلم. معايير الاختيار لمثبطات جزيء صغير التي تشير إلى تدخل معين مع تشكيل بيوفيلم دون تأثير واضح على نمو العوالق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- خط من B. الرقيقة من -80 ° C الأسهم (LB cultuإعادة 10 9 خلية / مل المجمدة في الجلسرين 20٪) لعزل المستعمرات واحد على٪ لوحة أجار 1.5 LB مع طرف عقيمة أو عصا قضيب.
- تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
- خطوة حاسمة: لتثبيط جليدة قوية من الأحماض غير متعارف عليه D-الأمينية مثل D-ليسين، تنمو مستعمرة واحدة التقطت من٪ لوحة أجار 1.5 LB في 3 مل مرق LB عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في هز حاضنة (تهز سرعة 200 دورة في الدقيقة). استبدال مرق LB مع يحفز بيوفيلم MSgg المتوسطة قبل التلقيح بواسطة الطرد المركزي ثقافة 1.5 مل بداية لمدة 4 دقائق في 6000 x ج، وإزالة بعناية طاف وإعادة تعليق-بيليه في 1.5 مل MSgg المتوسطة. ما تبقى من ثقافة يمكن التخلص منها.
هام: لضمان متانة النظام، وينبغي أن تكون الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من ثقافة بداية غسلها بين 0.6 و 1. - خلال نمو ثقافة بداية، وإعداد 12-جيدا لزراعة الخلايا لوحة multidish containinز 3 مل من MSgg وسيط وبدون أو مع مجموعة تركيز جزيء صغير مثبطات (على سبيل المثال، 0.3، 0.5، 1 ملم مد يسين 17). استبعاد آثار الحافة، توزيع موقع تركيزات مختلفة عبر لوحة multidish. بدلا من ذلك، استخدم 24-جيدا لزراعة الخلايا لوحات multidish تحتوي على 1.5 مل من MSgg المتوسطة.
- تطعيم الآبار من 12 لوحة جيدا multidish لزراعة الخلايا مع 3 ميكرولتر من الثقافة بداية غسلها (1: 1000 تمييع).
ملاحظة: انخفاض نسبة التخفيف، أي 1: 500 يمكن استخدامها. هذا يقلل من الوقت اللازم لتطوير من pellicles. - زراعة pellicles في 23 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة لمدة ثلاثة أيام. لا تحرك pellicles خلال هذا الوقت، لأنها يمكن أن تؤثر على مورفولوجية سطح النهائي للجليدة.
- الحصول على الصور مع التعرض مجهر ومتجانس من البرق. بدلا من ذلك، التقاط صورة من pellicles مع كاميرا ذات دقة عالية. لتجنب القطع الأثرية التي تسببها inconsisزوايا ضوء خيمة والظلال، والتقاط صور من أعلى إلى أسفل مع الكاميرا ثابتة على ترايبود واستخدام مصدر ضوء لينة وكبيرة في 45 درجة من كلا الجانبين.
ملاحظة: أسلوب بديل لدراسة B. الرقيقة multicellularity هي بيوفيلم مستعمرة الفحص على الصلب، الذي يحفز بيوفيلم MSgg المتوسطة. مثل pellicles، هذا الاختبار يسمح للدراسة العمليات الزمانية المكانية. مرة واحدة يتم تحديد مجموعة نشطة من مثبطات جزيء صغير، تأثيرها على تشكيل مستعمرة بيوفيلم يمكن دراستها. - أن تنمو المستعمرات بيوفيلم، متناظر بقعة 1.5 ميكرولتر من غير مغسولة قبل الثقافة (الخطوة 1.7) على MSgg 1.5٪ لوحة أجار المجففة مع مساعدة من القالب - 4 قطرات في طبق بيتري من 8.5 سم القطر. دع قطرات كثف لوحة قبل نقلها.
ملاحظة: القالب يساعد على الحصول على المساواة في توزيع المستعمرات بيوفيلم داخل المنطقة حيث تزرع الخلايا. لإعداد القالب، ورسم المساحة الكلية للنمو في جداول الأصلية، نقسمه على قدم المساواة الطائفةالأملاح وبمناسبة المركز. لطبق بيتري جولة من 8.5 سم القطر، وهذا يعين مستعمرة بيوفيلم 14 سم 2 إلى واحد. - احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. خلال هذا الوقت، المستعمرات بيوفيلم تتطور وتشكل ثلاثي الأبعاد، هيكل التجاعيد.
- التقاط الصور كما في الخطوة 1.11.
2. الإيثانول المقاومة الفحص
- تنمو الأغشية الحيوية كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،7 و1،12-1،14.
- بعد 68 ساعة من النمو عند 30 درجة مئوية، وقطع المستعمرات بيوفيلم إلى قسمين متساويين مع مساعدة من شفرة الحلاقة والقالب.
الشكل 2. مثال لتصميم تجريبي لتقييم مقاومة الخلايا مستعمرة بيوفيلم إلى وكلاء تعقيم. (A) قالب المستخدمة في المساواة في توزيع المستعمرات بيوفيلم عبر طبق بتري ولقطع. (B)صور من أعلى إلى أسفل من غير المعالجة من النوع البري بيوفيلم نمت 68 ساعة على الصلب، الذي يعرف MSgg المتوسطة الذي يحفز بيوفيلم عند 30 درجة مئوية. يظهر توسيع كيف مستعمرة بيوفيلم يمكن أن تقطع إلى نصفين متساويين. (ج) يتم التعامل مع نصفين بيوفيلم متساوية على قدم المساواة (السيطرة، PBS) أو مع أي برنامج تلفزيوني أو تعقيم وكيل ومعالجتها كما هو موضح. شريط مقياس: 1 سم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- رفع بعناية كل شوط من مستعمرة بيوفيلم من لوحة أجار مع ملعقة صغيرة ونقله إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إذا لزم الأمر، تتخلص من الخلايا المتبقية من لوحة ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge كذلك.
ملاحظة: يتم التعامل مع النصف الثاني من مستعمرة بيوفيلم تفاضليا، اعتمادا على ما إذا كان هو السيطرة أو لاختبار مقاومة ستيريوكلاء LIZING. - من أجل السيطرة، واحتضان النصف الثاني من مستعمرة بيوفيلم في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 2.3. لتقييم مقاومة للعوامل تعقيم، ونقل النصف الثاني من مستعمرة بيوفيلم إلى 500 ميكرولتر 50٪ (ت / ت) الإيثانول.
ملاحظة: البديل تعقيم وكلاء مثل هيبوكلوريت الصوديوم يمكن استخدامها. لجميع وكلاء تعقيم المستخدمة، وتحديد تركيز وحضانة وقت نشط في التجربة الأولية. - احتضان المستعمرات بيوفيلم لمدة 10 دقيقة على مقاعد البدلاء أعلى في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي المستعمرات بيوفيلم لمدة 5 دقائق في 18000 x ج وإزالة بعناية طاف مع ماصة. إضافة 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- يصوتن الخلايا أقل ما يقال (السعة 10٪، نبض 5 ثانية) مع microtip من sonicator.
ملاحظة: يجب أن تكون الطاقة صوتنة كافية لالمجاميع بيوفيلم منفصلة. ومع ذلك، صوتنة قاسية جدا قد ليز الخلايا. تأكيد مقدما بواسطة المجهر الضوئي أن الطاقة صوتنةالمستخدمة لا ليز الخلايا وأن جميع المجاميع تذوب. - إضافة 700 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الحجم النهائي من 1 مل. إجراء التخفيف المتسلسل (10 -7) في برنامج تلفزيوني ونشر 100 ميكرولتر من 3 التخفيفات على لوحة أجار٪ 1.5 LB باستخدام الخرز الزجاجي معقمة.
ملاحظة: التخفيفات الأمثل أن يكون مطلي ينبغي أن تحدد في التجربة الأولية، وهذا يتوقف على كمية من الخلايا في مستعمرة بيوفيلم من الفائدة ومعدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا في الاستجابة إلى وكيل تعقيم. - احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، والاعتماد على كفو وتحديد كفو / مل. من النهائي كفو / مل من كل المستعمرات بيوفيلم نصف، وحساب النسبة المئوية للناجين.
ملاحظة: عندما يقوم وتحليلها كما وصفها، نصفي مستعمرة تحكم بيوفيلم ودون علاج مقابل نصف المعالجة الإيثانول من مستعمرة بيوفيلم غير المعالجة ينبغي أن تسفر الاختلافات أقل من 10٪ في عدد خلايا قابلة للحياة، والتحقق من التماثل أو المقاومة للمستعمرة ، respectively. بدلا من ذلك، فإن النتائج يمكن أن تكون ممثلة في مجموع كفو. وينبغي أن يظل عدد الخلايا من السيطرة ومستعمرة بيوفيلم غير المعالجة في نفس الترتيب من حيث الحجم. في المقابل، من المتوقع أن ينخفض بنسبة لا تقل عن اثنين من حيث الحجم في المطالبة بزيادة حساسية للوكيل تعقيم عدد الخلايا في النصف المعالجة الإيثانول من مستعمرة بيوفيلم صغيرة المعالجة الجزيء.
3. بيوفيلم مستعمرة إعداد نموذج لالمجهر الإلكتروني
- تنمو المستعمرات بيوفيلم كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،7 و1،12-1،14.
- إعداد دفعة جديدة من 2٪ (ت / ت) غلوتارالدهيد، 3٪ (ت / ت) حل لامتصاص العرق في 100 ملي كاكوديلات الصوديوم، 5 ملي العازلة كلوريد الكالسيوم، ودرجة الحموضة 7.3. إعداد 5 مل من تثبيتي لكل طبق بيتري من 8.5 سم القطر.
تنبيه: غلوتارالدهيد وامتصاص العرق تشكل خطرا. التعامل معها معدات السلامة داخل غطاء الكيميائية. تجاهل الحلول والمواد الملوثة إلى هازالنفايات ardous. - بعناية إضافة تثبيتي إلى المستعمرات بيوفيلم، دون الاستغناء مباشرة على الجزء العلوي من الأغشية الحيوية.
ملاحظة: نظرا للطابع مسعور من مستعمرة بيوفيلم، المستعمرات فصل ببطء من أجار والبدء في تعويم. - بعناية ختم لوحات مع شريط من بارافيلم. احتضان على شاكر دوارة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك نقل لوحات إلى 4 درجة مئوية لمدة ليلة وضحاها.
- في اليوم التالي، وإزالة بعناية السائل مع ماصة باستير الزجاج متصلة مضخة فراغ.
- بعناية إضافة 10 مل 100 ملي كاكوديلات الصوديوم، كلوريد الكالسيوم عازلة 5 ملي لغسل بيوفيلم واحتضان لمدة 5 دقائق. إزالة بلطف السائل مع ماصة باستير الزجاج من زاوية لوحة لتجنب إتلاف بيوفيلم وإضافة محلول الغسيل جديدة من قبل pipetting لطيف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- للجفاف المستعمرات بيوفيلم، المضي قدما في الخطوات التالية: 2X 5 دقائق في [ده 2 O؛ 2X 20 دقيقة في 30٪ من الإيثانول. 2X 20 دقيقة في 50٪ من الإيثانول. 2X 20 دقيقة في 70٪ من الإيثانول. 2X 20 دقيقة في 96٪ من الإيثانول. 2X 30 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪.
- إضافة 15 مل من السائل لكل طبق بيتري من 8.5 سم القطر في كل خطوة وإزالة السائل بعناية بعد كل الحضانة.
- استخدام واحدة من طريقتين مختلفتين لتجفيف العينات من الإيثانول.
- لتجفيف الهواء من الإيثانول:
- قطع ورقة فلتر السليلوز (قطر 9 سم) في الفصول. لفترة وجيزة غمر ربع في الإيثانول بنسبة 100٪، ومن ثم نقل بعناية واحد العائمة مستعمرة بيوفيلم على ذلك. وضع ورقة الترشيح الرطب في طبق بيتري اصطف مع ورق الترشيح. تغطية طبق بتري والسماح للمستعمرات بيوفيلم بين عشية وضحاها الجاف في غطاء الكيميائية.
- لنقطة حرجة (CP) -drying باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2)، والسائل الانتقال:
- ملء 75٪ من نقطة تجفيف غرفة الماكينة المهمة مع الإيثانول بنسبة 100٪. نقل العينات إلى حامل، كل عينة إلى ج الخاصةهامبر. إذا لزم الأمر، وقطع بيوفيلم مع مقص إلى أجزاء أصغر. ترك العينات المغمورة في الإيثانول خلال كل المناولة. ثم، ونقل حامل في غرفة وإغلاق الغرفة بإحكام.
- تبريد الغرفة إلى 7 درجة مئوية والبدء في التحريك. تملأ الغرفة تماما مع ثاني أكسيد الكربون السائل 2. خلال فترة الحضانة 7 دقائق، والسماح للخليط الايثانول مع CO 2. ثم، وتفريغ 25٪ من الحل.
ملاحظة: لا إفراغ غرفة تحت مستوى العينة. - كرر الخطوة 3.8.2.2 أربع مرات.
- كرر الخطوة 3.8.2.2 خمس مرات مع فترة حضانة لمدة 5 دقائق فقط. وأخيرا، ينبغي الاستعاضة عن الايثانول تماما من CO 2.
- خلال الجولة الأخيرة، فارغة 5٪ فقط من الغرفة. إيقاف التحريك والتبريد. بدء تسخين الغرفة إلى 42 درجة مئوية. عند درجة حرارة 31.1 درجة مئوية وضغط من 73.9 بار، السائل CO 2 تصل إلى نقطة حرجة، الدولة التي الرقم الهيدروجيني الغازيبورصة عمان لديها نفس الكثافة كما الطور السائل من المذيبات 27. وبمجرد وصول درجة حرارة 42 درجة مئوية، واحتضان لمدة 10 دقيقة. في 42 درجة مئوية، وCO 2 في غرفة كما هو معمول به الغاز فوق الحرجة.
ملاحظة: تحقق باستمرار الضغط من الغرفة. يجب أن لا يتجاوز ضغط 120 بار في 42 درجة مئوية. - بدء لاطلاق سراح ببطء الغاز مع التدفئة مستمرة. هذا يحافظ على عينات في المرحلة CO 2 -gas ويمنع تشوه التشكل عينة من خلال توتر سطح السائل. تعيين مقياس الجريان إلى 5 لتر / ساعة عن طريق ضبط صمام القياس السيطرة على مقياس الجريان. انتظر حتى يتم تحرير كل الضغوط في الغرفة. الآن فتح غرفة وإزالة العينات بعناية من حامل.
- لتجفيف الهواء من الإيثانول:
- معطف من المجهري كعب الإلكترون مع الشريط الكربون. مع مساعدة من ملاقط، ونقل بعناية المستعمرات بيوفيلم على كعب. ربط كل مستعمرة إلى كعب بإضافة جسر رقيقة من سيارةبون الشريط، وهو أمر حاسم للقضاء تهمة تحت شعاع الالكترون. في هذه المرحلة، والتعامل مع المستعمرات بيوفيلم مع الرعاية كما أنها هشة جدا. تخزين العينات في المجفف لمدة 24 ساعة على الأقل أو حتى فحص.
- يوم الامتحان مع الميكروسكوب الالكتروني، تفل معطف المستعمرات بيوفيلم لمدة 2 دقيقة في زاوية 60 درجة في الذهب والبلاديوم تفل المغطي. كرر هذه الخطوة مرتين وتدوير عينات من 120 درجة في ما بين. في النهاية، تفل معطف العينات مرة واحدة لمدة 3 دقائق من أعلى. طبقة 20 نانومتر رقيقة من الذهب والبلاديوم يحسن الموصلية ويعزز النقيض من العينة للتصوير في SEM.
- تخزين العينات في مجفف لتجنب معالجة الجفاف من العينة 28 حتى التصوير مع المجهر الالكتروني الماسح 29،30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فحص جليدة هو أسلوب واحد لدراسة العمليات درجة عالية من التنظيم والحيوية من B. الرقيقة multicellularity. وبالاضافة الى هذا، هي مناسبة لفحص جليدة لاختبار مجموعة وإما شروط مسبقة بداية أو تركيزات جزيء صغير في لوحة multidish واحدة لزراعة الخلايا في تجربة واحدة. ومع ذلك، B. الرقيقة تشكيل جليدة حساسة للشروط مسبقة الثقافة (على سبيل المثال، متوسط النمو لما قبل الثقافة ومرحلة نموها)، ونسبة التلقيح وإزالة المتوسط قبل الثقافة. وبالتالي فإننا فحص أولا للحصول على الإعداد التجريبية التي سمحت لنا لإنتاج تثبيط جليدة التي كتبها D-ليسين. نتائجنا تظهر ان استنساخه تثبيط جليدة التي كتبها D-ليسين ويمكن الحصول على إذا كانت الخلايا ما قبل مثقف في غير معروف، متوسطة LB الغنية إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي (مستعمرة واحدة في 3 مل LB عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع اهتزاز )، ونسج أسفل وإعادة علقت في المتوسط MSgg محددة قبل 1: inoculat 1000ايون (الشكل 3A). عندما كانت تزرع الخلايا في MSgg المتوسطة إلى لوغاريتمي منتصف مرحلة النمو (مستعمرة واحدة في 1 مل LB لمدة 2 ساعة، وإعادة المخفف 1: 100 إلى 3 مل MSgg، ونمت لمدة 5 ساعة على 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة)، لم إزالة المتوسطة قبل الثقافة لا يكون لها تأثير على النشاط-D يسين. الخلايا المزروعة إلى مرحلة النمو ثابتة (مستعمرة واحدة في 1 مل LB لمدة 2 ساعة، وإعادة المخفف 1: 100 إلى 3 مل MSgg، ونمت لمدة تصل إلى 20 ساعة في الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة) وغسلها في MSgg المتوسطة قبل كان التلقيح أقل حساسية. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الزيادة في المقاومة تجاه تأثير جليدة تثبيط D-ليسين يرجع ذلك إلى كثافة الخلية أعلى من قبل الثقافة، وزيادة نسبة التلقيح. نسبة التلقيح من قبل الثقافة في نمو ثابت في MSgg المتوسطة، أي 1: 500 أو 1: 1000، أثرت على نطاق النشاط من D-ليسين والوقت للتنمية جليدة (الشكل 3B). جليدة تثبيط التي كتبها D-ليسين حدثفي درجات حرارة النمو المختلفة (23 درجة مئوية و 30 درجة مئوية، والشكل 3C). الأهم من ذلك، في حين أن حساسية الخلايا لD-ليسين تعتمد على شروط مسبقة والثقافة، واستنساخ الظواهر عند درجات حرارة مختلفة يوضح أن جليدة عن طريق تثبيط جزيء صغير D-ليسين لديها ميزات قوية.
وإلى أن يتم تقييم الشكل 3. النتائج مثال أن تظهر آثار مختلف شروط مسبقة الثقافة على تثبيط جليدة التي كتبها D-ليسين عدة المعلمات للحصول على الإعداد التجريبية القوية، بما في ذلك: (أ) إزالة الملوثات من نمو ما قبل الثقافة متوسطة (وليس غسلها مقابل غسلها)، متوسط النمو لما قبل الثقافة (غنية، غير محدد LB المتوسطة أو تعريف المتوسطة MSgg الذي يحفز بيوفيلم)، ودولة النمو لما قبل الثقافة (وغاريتمي مقابل مرحلة نمو ثابتة)، (ب) نسبة التلقيح (1: 1000 مقابل 1: 500) من قبل الثقافة في المتوسط نمو جليدة النهائي، و (C) درجة حرارة النمو (23 درجة مئوية مقابل 30 درجة مئوية) ب. كانت تزرع الرقيقة NCIB 3610 الخلايا في الوسط المبين (LB أو MSgg) لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة أكثر من ليلة (س / ن) مع اهتزاز، واستعيض المتوسطة قبل الثقافة عن طريق MSgg إذا أشار (غسلها أو لا غسلها). وأخيرا، تم تلقيح الثقافة بداية 1: 1000 إذا لم ينص على خلاف ذلك وكانت تزرع pellicles في ظل ظروف ثابتة عند 23 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. تم الحصول عليها الصور من أعلى إلى أسفل مع الكاميرا. حسنا قطرها 22 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد تحديد شروط مسبقة الثقافة والإعداد التجريبية التي سمحت لمجموعة النشاط استنساخه من D-leucine على تشكيل جليدة (قبل ثقافة نمت في LB إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي، وغسلها في MSgg، المخفف 1: 1000 ونمت عند 23 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام)، تم اختبار تأثير للقوة لها. لهذا الغرض، تم تقييم النشاط من D-يسين على تشكيل جليدة في مختلف وسائل الإعلام MSgg المعدلة (الشكل 4). وكان نطاق النشاط من D-ليسين في تثبيط جليدة ثابت في وسائل الإعلام الخمسة المختبرة، وتبين أن تأثير مد يسين على تشكيل جليدة قوي. ولوحظ اتجاه مماثل مع D-التيروسين، حيث تثبيط جليدة في تركيز تتراوح كان يصل إلى 2 ميكرومتر ثابت في العديد من وسائل الإعلام MSgg المعدلة (انخفاض تركيز الحديد واستبدال مصدر النيتروجين مع كلوريد الأمونيوم أو مصدر الكربون مع الجلوكوز، البيانات لا معروضة).
الشكل 4. حساسية إلى مد يسين يحدث فيوسائط النمو المختلفة. المعروضة هي صور من أعلى إلى أسفل من B. الرقيقة NCIB 3610 pellicles، ونمت في ظل ظروف ثابتة عند 23 درجة مئوية في المعرفة، الذي يحفز بيوفيلم MSgg المتوسطة أو في مختلف وسائل الإعلام MSgg المعدلة (مصدر الكربون 0.5٪ الجلوكوز، مصدر النيتروجين 0.5٪ (NH 4) 2 SO 4 وارتفاع الحديد 250 ميكرومتر FeCl 3؛ انخفاض الجلسرين 0.125٪ الجلسرين) لمدة ثلاثة أيام، إلا على المدى المتوسط مصدر النيتروجين البديل (حيث كانت تزرع pellicles لمدة خمسة أيام) أي بدون أو مع مد يسين في تركيزات المشار إليها. وقد نمت كاتب الثقافات لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية مع اهتزاز في غير معروف، متوسطة LB الغنية. قبل التلقيح، وكانت تغسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في وسط النمو جليدة المقابلة. ثقافة بداية كان المخفف 1: 1000، وقطر البئر 22 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
طريقة بديلة لدراسة B. الرقيقة multicellularity هي بيوفيلم مستعمرة فحص على متوسطة MSgg الصلبة. مثل pellicles، هذا الاختبار يسمح للدراسة العمليات الزمانية المكانية. مرة واحدة يتم تحديد مجموعة نشطة من مثبطات جزيء صغير في نظام جليدة، تأثيرها على تشكيل مستعمرة بيوفيلم يمكن دراستها. في هذه الدراسة، تم استخدام المستعمرات بيوفيلم لتقييم تأثير مد يسين على المقاومة من المستعمرات بيوفيلم لعوامل تعقيم، لأن المستعمرات بيوفيلم أقل الهشة وعلى خلفية صلبة، فهي أسهل للتلاعب. عندما تتعرض المستعمرات بيوفيلم تعامل مع D-ليسين إلى 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، ونسبة الخلايا على قيد الحياة قطرات مقارنة بشكل كبير إلى جزء غير المعالجة (الشكل 5). ويمكن تطوير هذه الطريقة إضافية لتقييم آثار مثبطات جزيء صغير الأخرى وتأثيرها على مقاومة عوامل جراثيم (STERILوكلاء تشغيلها على أو المضادات الحيوية).
الشكل 5. النتائج مثال غير المعالجة أو المعالجة المقاومة مستعمرة بيوفيلم ضد وكيل تعقيم. المستعمرات بيوفيلم من B. كانت تزرع الرقيقة NCIB 3610 على الصلب المتوسطة المحددة لل68 ساعة على 30 درجة مئوية، مع أو بدون 0.5 ملي D-ليسين. بعد قطع المستعمرات في نصفين متساويين، وعولج نصف مع برنامج تلفزيوني (الرقابة الداخلية) والنصف الآخر مع 50٪ من الإيثانول أو برنامج تلفزيوني (مراقبة). بعد صوتنة معتدل، التخفيف المتسلسل، والطلاء والفرز لمستعمرة، تم حساب نسبة الناجين بالمقارنة مع الرقابة الداخلية. أظهرت هي نتائج ثلاث تجارب مستقلة مع متوسطات اثنين (A) أو ثلاثة (B، C) يعيد وانحرافها القياسية. يرجى النقر هنا رس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) هو أداة قوية التي يمكن استخدامها للتركيز على البنية المكانية التجاعيد مستعمرة بيوفيلم، وفرة وتوطين EPS ومورفولوجيا خلية واحدة (31). يتطلب SEM التصوير العينات التي يمكن تصويرها تحت فراغ عالية. التحقيق في عينات في ظل ظروف فراغ عالية، وإلى أن إزالة كافة جزيئات الماء بكميات كبيرة، وبالتالي، SEM التصوير يتطلب جفاف العينة قبل التصوير. بدلا من ذلك، والعينات ويمكن تصويرها في ظل ظروف فراغ منخفضة في وضع مبللة المسح البيئي المجهر الإلكتروني (ESEM)، حيث يتم تجفيف العينة المائية بلطف في غرفة المجهر. لتقييم آثار مثبطات جزيء صغير في الهندسة المعمارية مستعمرة بيوفيلم، المنظمة EPS وخلية التشكل، وتمت مقارنة ثلاثة أنواع مختلفة من العينة الجفاف: جفاف في المجهر تحت مو الرطبالشروط دي (ESEM)، المجفف من نقطة المذيبات أو الحرجة (CP) المجفف في الهواء باستخدام ثاني أكسيد الكربون كما السائل الانتقالية. في غير المعالجة أو المعالجة D-ليسين-ب. الرقيقة المستعمرات بيوفيلم مراحل ترطيب مختلفة وفقا لطريقة استخدامها ويمكن ملاحظة. التصوير في ظروف فراغ منخفضة في وضع مبللة ESEM الحفاظ على حالة طبيعية جدا للمستعمرة بيوفيلم. ومع ذلك، فإن المعلومات عن مورفولوجيا خلية واحدة وEPS الوفرة والهندسة المعمارية النادرة، كما كانت ربحية السهم لا يزال رطب تماما وكان جزءا لا يتجزأ من الخلايا في EPS (لا تظهر البيانات). من حيث الجفاف، وكان CP-تجفيف الإجراء الأكثر صرامة. إزالته أكثر هيكليا جزيئات الماء المربوطة والسائبة من الأنسجة، وهو ما يمثل خسارة حجم 30-70٪، اعتمادا على النسيج 32. في المقابل، تجفيف الهواء الحفاظ على جزيئات الماء المربوطة. على الأنسجة الجنينية على سبيل المثال فقدت 18٪ من حجمه بعد تجفيف الهواء من الإيثانول المذيبات متقلبة و 59٪ بعد CP-تجفيف 32 (الشكل 6A) . المستعمرات بيوفيلم التي كانت المجففة مع الإيثانول وCP المجففة أيضا الحفاظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد، وظهر EPS مثل بيت العنكبوت (الشكل 6C). في عينات الهواء المجفف والمجففة CP،، كانت آثار صغيرة جزيء المانع D-يسين على بنية مستعمرة بيوفيلم مورفولوجيا الخلايا وEPS هيكل واحد واضح (الشكل 6B وD). كانت المستعمرات بيوفيلم نمت في وجود مد يسين أصغر وكانت التجاعيد أقل وضوحا. وممدود الخلايا المعالجة D-ليسين، النمط الظاهري الذي هو observed في الخلايا تعامل مع استهداف جدار الخلية الجزيئات 33. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا وبوضوح أقل مغطاة العائد على السهم وليس مرتبطة ارتباطا وثيقا الخلايا المجاورة لها عن طريق EPS كما رأينا في المستعمرات بيوفيلم غير المعالجة. تظهر النتائج المقدمة أن كلا أساليب بيوفيلم مستعمرة الجفاف، مجففة CP من الإيثانول أو المجفف في الهواء باستخدام ثاني أكسيد الكربون كما السائل الانتقال تعطي أفكارا قيمة حول تأثير جزيئات صغيرة على التشكل خلية واحدة، فضلا عن وفرة EPS والهندسة المعمارية.
يمكن الشكل 6. الجزيئات الصغيرة تغيير على نطاق واسع وقليل من الهندسة المعمارية مستعمرة بيوفيلم. المستعمرات بيوفيلم من B. الرقيقة NCIB 3610 نمت (A و D) في غياب أو (B و D) في وجود 0.5 ملي D-ليسين لمدة 72 ساعة على 30 درجة مئويةفي المتوسط MSgg الصلبة كانوا يركزون على النحو المبين في البروتوكول والمجففة من الإيثانول على النحو التالي: (A و B) المجفف في الهواء و(C و D) باستخدام ثاني أكسيد الكربون كما السائل الانتقال المجفف CP. أظهرت هي أعلى إلى أسفل الصور مجهر المستعمرات بيوفيلم (من اليسار، لوحات العليا)، أعلى إلى أسفل الصور من المستعمرات بيوفيلم المجففة التي شنت على بذرة المجهر الإلكتروني قبل الذهب البلاديوم طلاء (من اليسار، لوحات أقل)، المنخفضة وعالية التكبير الصور التي حصلت عليها وزارة شؤون المرأة لإظهار العمارة 3D من التجاعيد مستعمرة بيوفيلم أو الخلية التشكل المنظمة / EPS واحدة. أشرطة النطاق من اليسار إلى اليمين: 5 مم، 100 ميكرون، 2 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1.925 مم | وعاءassium أحادي فوسفات |
| 3.075 مم | البوتاسيوم فوسفات ثنائي القاعدة |
| 100 ملي | 3- (N -morpholino) حمض propanesulfonic، ودرجة الحموضة 7.1 |
| 2 مم | هيدرات كلوريد المغنيسيوم |
| 700 ميكرومتر | اللامائية كلوريد الكالسيوم |
| 50 ميكرومتر ل | الحديد (III) هيدرات كلوريد |
| 125 ميكرومتر ب | |
| 1 ميكرومتر | اللامائية كلوريد الزنك |
| 2 ميكرومتر | هيدروكلوريد الثيامين |
| 50 ميكروغرام / مل | التربتوفان |
| 50 ميكروغرام / مل | الفنيل الأنين |
| 50 ميكروغرام / مل | ثريونين |
| 0.5٪ (ت / ت) | الجلسرين اللامائية |
| 0.5٪ (ث / ت) | L-الجلوتاميك أملاح حامض الصوديوم هيدرات |
| ولفحص جليدة، ب لفحص بيوفيلم | |
الجدول 1. تكوين النهائي 1X MSgg المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العصوية الرقيقة أشكال قوية ومنظم للغاية الأغشية الحيوية في كل من السائل (pellicles) وعلى وسط صلب (المستعمرات). وبالتالي، فإنه بمثابة كائن نموذجا مثاليا لوصف طريقة عمل مثبطات بيوفيلم محددة. على وسائل الاعلام الصلبة، الخلايا تشكل هياكل متعددة الخلايا مع السمات المميزة التي ليست واضحة في pellicles، مثل التجاعيد يشع من المركز إلى الحافة. وهكذا، pellicles والمستعمرات هي أنظمة تكميلية لدراسة B. الرقيقة multicellularity.
الهدف من هذه الدراسة هو تطوير B. نظام نموذجي الرقيقة للبيوفيلم (pellicles والمستعمرات) تثبيط. عدة خطوات حاسمة لاستنساخ مقال بيوفيلم اضطراب. والخطوة الحاسمة الأولى هي للتأكد من أن التأثير على تشكيل بيوفيلم ليس بسبب السمية العامة للبكتيريا التي تزرع في نمط الحياة العوالق. ويمكن اعتبار هذا بمقارنة تأثير تركيز معين من حيثمركز جزيء المانع على تثبيط بيوفيلم النسبي لتأثير هذا الجزيء على نمو العوالق. وهناك تأثير أقوى بشكل كبير على التنمية بيوفيلم يمكن ضمان تحديد آليات المستهدفة التي هي مهمة خصيصا لتطوير الأغشية الحيوية. وعلاوة على ذلك، توضح الدراسة الواردة في هذه الوثيقة على أهمية شروط مسبقة الثقافة في تنمية pellicles وحساسيتها للجزيئات صغيرة. قبل توصيف تأثير جزيئات صغيرة، الظروف التجريبية استنساخه وقوية (على سبيل المثال، درجة حرارة النمو جليدة وعدم وجود حساسية لتكوين وسائل الاعلام) لاختبار آثارها يجب أن تكون محددة. العثور على مثل هذه الظروف، فإن وسائل الإعلام من حالة ما قبل الثقافة، وينبغي النظر في مرحلة نمو وسائل الإعلام قبل والثقافة، وإزالة وسائل الإعلام قبل الثقافة، ودرجة الحرارة النمو والنمو.
ويتمثل التحدي الرئيسي، مرة واحدة تم العثور على مثبطات معينة لتشكيل بيوفيلم، هو العثور على كميةوالطرق النوعية التي تميز آثار هذه مثبطات جزيء صغير على التنمية بيوفيلم والمقاومة. هنا، يتم وصف منهجين مهمة في التفاصيل التي يمكن استخدامها لتقييم آثار هذه المثبطات. أولا، نحن نقدم طريقة الكمية البسيطة التي يمكن تحقيق بتكاثر مقاومة تعامل مقابل الأغشية الحيوية مستعمرة غير المعالجة إلى البكتريا، مثل الإيثانول. وتظهر نتائج تمثيلية للحساسية من المستعمرات بيوفيلم تعامل D-ليسين إلى 50٪ من الإيثانول. ومع ذلك، هذا مقال يمكن تعديلها بسهولة باستخدام مختلف وكلاء تعقيم أو المضادات الحيوية. ثانيا، يتم وصف طريقة SEM في التفاصيل التي تسمح عالية الدقة فحص التغيرات في مستعمرة بيوفيلم الناجمة عن مثبط جزيء صغير في عدة مستويات يكمل: الهيكل العام للمنظمة وفرة من المصفوفة EPS ومكوناته، و الأشكال التضاريسية وحيدة الخلية في جميع أنحاء بيوفيلم. ونلاحظ أن طريقتين من dehydratiعلى (تجفيف الهواء من الإيثانول بنسبة 100٪ أو CP-التجفيف باستخدام ثاني أكسيد الكربون كما السائل الانتقالية) يمكن استخدامها على حد سواء خلال عينة إعداد SEM من مستعمرة بيوفيلم. الأهم التثبيت الناجح للعينة بيوفيلم يعتمد إلى حد كبير على للا مائية من مستعمرة بيوفيلم. هذه للا مائية هي سمة أصلية من B. الأغشية الحيوية الرقيقة بسبب الطبقة السطحية مسعور 10،34.
استخدمت عدة نهج سابقا لدراسة التجمع بيوفيلم والتنمية مع B. الرقيقة كما كائن نموذج 35. أظهر عدد من الدراسات المستقلة آثار تكوين وسائل الإعلام على التنمية بيوفيلم 36-38. وحتى الآن ومع ذلك، كان تقييم منهجي لآثار تكوين وسائل الإعلام على تثبيط بيوفيلم، إلى حد علمنا، غير موجودة. وتوضح هذه الدراسة أنه في حين أن تثبيط جليدة باء الرقيقة من جزيئات صغيرة حساسة إلى ما قبل الثقافة الظروف، فمن أوناffected من آثار درجة الحرارة وتكوين وسائل الإعلام، وبالتالي من المفيد للشاشات منهجية مثبطات جزيء صغير. أيضا، أنشأنا طريقة بسيطة، قابلة للتكرار والكمي لتقييم مقاومة غير المعالجة أو صغيرة جزيء المعالجة المانع المستعمرات بيوفيلم لعوامل مضادة للجراثيم، وتفتقر حاليا في نموذج بيوفيلم الكائن B. الرقيقة.
B. الأغشية الحيوية الرقيقة في تركيبة مع الصحفيين الفلورسنت التي يمكن اتخاذها مزيد للبحث عن مثبطات جزيء صغير التي تستهدف إما خطوة تطويرية محددة من تشكيل بيوفيلم أو محددة لشبه السكان من الخلايا داخل بيوفيلم. الطرق هنا وصفها لا توفر قرار خلية واحدة من حيث التعبير الجيني داخل بيوفيلم. طرق تحليل التعبير EPS مصفوفة الجينات داخل B. أنشئت الأغشية الحيوية الرقيقة على مستوى خلية واحدة بنجاح 39.
الأغشية الحيوية البكتيرية هي من cruciaأهمية لتر في إعدادات الزراعية والصناعية والطبية. في سياق الزراعي، والقدرة على تشكيل الأغشية الحيوية يزيد من الاستعمار المضيف مصنع للعديد من النباتات مسببات الأمراض 40، وفي سياق السريرية، والأغشية الحيوية هي بطبيعتها مقاومة للمضادات الحيوية 21 و هم في صميم العديد من الالتهابات البكتيرية المستمرة والمزمنة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المسلم به الآن أن الأغشية الحيوية لها آثار التكلفة الضخمة لصناعة لأنها من الصعب للغاية إزالة وضبط 41. وهكذا، وضع إطار تجريبي لدراسة مثبطات بيوفيلم الميكروبية سيوفر كبيرة الزراعية 42،43، 21،44 السريرية، والتكنولوجية 45-47 التقدم.
تقتصر الطرق الحالية لB. الرقيقة. ونحن نشجع التالية المفاهيم الكمية والنوعية وصفه لدراسة مثبطات جزيء صغير بيوفيلم محددة في الأنواع الأخرى أيضا. بالإضافة الى ، وتتعلق هذه الدراسة إلى مثال محدد لتثبيط بيوفيلم التي كتبها D-ليسين، من عدة مثبطات بيوفيلم محدد نشرت سابقا 17. الأهم من ذلك، تميزت D-ليسين بالفعل كما جزيء مكافحة بيوفيلم في العوامل المسببة للأمراض النبات مستصفرة ليمونية 48، وتقديم أوجه التشابه المحتملة بين الاستعمار النبات وتشكيل بيوفيلم. تشكيل بيوفيلم (جليدة وتشكيل مستعمرة rugose) كما هو شائع في الكائنات الممرضة للإنسان (على سبيل المثال، الزائفة الزنجارية 49-51 والإشريكية القولونية uropathogenic 52،53). الأساليب المذكورة يمكن بلورته للبحث عن أدوية محددة التي تحول دون تشكيل بيوفيلم وتقليل مقاومة بوساطة بيوفيلم إلى العوامل المضادة للجراثيم في البحوث السريرية. وعموما، فإن الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم كأساس لتطوير المفاهيم الكمية والنوعية لدراسة مثبطات جزيء صغير بيوفيلم محددة في الأنواع الأخرى أيضا.
الإقليم الشمالي "> باختصار، نحن نقدم بسيط ومفيد أداة المربع الذي يدل على القوة والمزالق المحتملة في استخدام B. الرقيقة لدراسة مثبطات بيوفيلم.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
