Introduction
Multi-cellulaire bacteriële gemeenschappen spelen een belangrijke rol in natuurlijke en anthropogene omgevingen, en kan nuttig of zeer schadelijk zijn. Deze meercellige kolonies bekend als biofilms, waarbij de afzonderlijke cellen zijn ingebed in een zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) matrix. De EPS sterk hechten de cellen aan het oppervlak ze koloniseren. Ze dienen als een schild tegen mechanische en chemische krachten en het creëren van nauw contact tussen naburige cellen, cellulaire communicatie 1 te vergemakkelijken. Een biofilm kan worden gezien als een gedifferentieerd gemeenschap, waar de cellen in hoge mate gebruik gereguleerd, georkestreerd processen om hun activiteiten binnen de gemeenschap te coördineren, evenals verschillende diersoorten 2-5. De overgang van een plankton, vrijlevende modus van de groei van een biofilm toestand wordt vaak geassocieerd met ontwikkelingsprocessen. Een goed voorbeeld is de Gram-positieve bodem bacterie Bacillus subtilis, en dus een undomesticated stam dient als een robuust model organisme om de ontwikkelingsfasen die leiden tot de vorming van biofilm te bestuderen. In deze bacterie, beweeglijke cellen zichzelf te organiseren in het oog springende meercellige structuren die gespecialiseerde taken 4 uit te voeren. Een groep cellen, de matrix-producenten uitscheiden exopolysaccharides 6, het amyloïde proteïne TASA 7,8 en de oppervlaktehydrofobiciteit eiwit BSLA 9,10; die allemaal deelnemen aan de vergadering van de EPS 11-13.
Gezien de overvloed van biofilms in natuurlijke en antropogene niches en de vermeende fatale schade die ze kunnen veroorzaken, is er dringend behoefte aan manieren om hun vorming te voorkomen vinden. Kleinmoleculige remmers kunnen helpen bij het ontdekken van nieuwe regulatorische ketens, enzymen en structurele eiwitten betrokken bij biofilmvorming, en daardoor inzicht in de complexe processen van meercellige Gemeenschapsopbouw promoten. Zoals B. subtilis is een goed bestudeerde model voor biofilmvorming 14,15, kan het worden gebruikt om de effecten van verschillende biofilminhibitoren beoordelen. Deze studie behandelt vier fundamentele methoden die sleutel voor het evalueren van de respons van biofilms te klein molecuul-remmers zijn. Eerst, zodat deze remmers een biofilm-specifiek doel, de afscheiding van het effect op plankton groei en het effect op biofilmvorming kritisch. De meeste antibacteriële middelen richten op cellen in hun planktonische groeifase, maar moleculen die de biofilm levensstijl richten op zijn zeldzaam. Bovendien, zoals moleculen die geen invloed plankton groei niet toxisch, ze kunnen de selectiedruk begunstiging antibiotica resistente mutanten 16 verminderen. Wanneer bijvoorbeeld biofilms worden behandeld met D-aminozuren of bepaalde andere celwand storende moleculen, ze ofwel verstoord of gedemonteerd, maar deze inhibitoren slechts licht beïnvloeden planktonische groei 12,17. Daarentegen veel antibiotica drastisch beïnvloeden plankton groei, aan little of geen effect op biofilmvorming 17.
Ten tweede, de oprichting van een consistent en robuust experimenteel kader om het effect van de kleine moleculen te bestuderen is cruciaal. We zagen dat het werkzame concentratiebereik van kleine molecule inhibitoren was gevoelig voor de voorkweek omstandigheden en de experimentele opstelling gebruikt om het effect van deze kleine molecule inhibitoren bestuderen. Verschillende rapporten, met name bestuderen B. subtilis onthulde variaties in het concentratietraject waarbij D-aminozuren remmen de vorming van pellicles - de drijvende bacteriële biofilms 12,17-19. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat de volgende factoren verantwoordelijk zijn voor verschillen in de actieve concentratiegebied: de pre-kweekomstandigheden (logaritmische 12,17 versus late stationaire groeifase 20), het gebruikte groeimedium in de pre-kweekomstandigheid (rijk, undefined [Luria bouillon, LB] versus gedefinieerd [mononatriumglutamaatglycerol, MSgg]), de verhouding inoculatie het bijzonder het verwijderen van de pre-kweekmedium voor enting. De temperatuur van statische huidje groei vertoonden een minder belangrijke rol in het activiteitsgebied van de kleine molecule inhibitor D-leucine, representant D-aminozuur gebruikt in deze studie.
Tenslotte, zodra de biofilms worden behandeld met specifieke biofilm remmers, robuuste en informatief zijn vereist om de effecten van deze inhibitoren op biofilm fitness karakteriseren. Hier twee methoden onafhankelijk karakteriseren van het effect van kleine molecule inhibitoren worden beschreven: (1) Het effect op individuele cellen binnen een biofilm kolonie en hun resistentie tegen antimicrobiële agentia. Cellen in biofilms algemeen beter bestand tegen antibiotica vergeleken met vrijlevende bacteriën 21-23. Hoewel dit fenomeen multifactorieel, werd het vermogen van de EPS antibiotische penetratie beperken vaak beschouwd als een aantrekkelijke verklaring 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beoordeling van het effect van kleine molecule inhibitoren op Pellicle en biofilm Colony Formation
- Bereid een 2x oplossing van toegezegde biofilm inducerende MSgg medium 25 zonder calciumchloride en ijzer (III) chloride hexahydraat. Na filter sterilisatie, voeg de calciumchloride. Het medium is direct gereed en kan bij 4 ° C worden bewaard in het donker.
- Maak de 1x MSgg verdunning op de dag van het experiment.
- Verdun het 2x MSgg medium tot 1x met steriel gedestilleerd water (pellicles) of steriele 3% warm (80 ° C) agar (biofilms) en voeg ijzer (III) chloride hexahydraat tot een uiteindelijke concentratie van 50 uM (pellicles) of 250 uM ( biofilms). antibiotica of kleinmoleculige remmers toevoegen gewenste concentratie en meng goed. Bijvoorbeeld, tot een eindconcentratie van 0,5 mM D-leucine verkregen in 30 ml tot pellicles of biofilms stellen, voeg 196,6 ul van een 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucine voorraadoplossing.
NEETE. De uiteindelijke 1x MSgg samenstelling wordt beschreven in Tabel 1 in vergelijking met het originele recept 25, het medium bevatte 50 ug / ml threonine en de ijzerconcentratie te biofilm kolonies groeien op vaste MSgg medium werd verhoogd 2.5x de gerimpelde kolonie morfologie optimaliseren .
- Verdun het 2x MSgg medium tot 1x met steriel gedestilleerd water (pellicles) of steriele 3% warm (80 ° C) agar (biofilms) en voeg ijzer (III) chloride hexahydraat tot een uiteindelijke concentratie van 50 uM (pellicles) of 250 uM ( biofilms). antibiotica of kleinmoleculige remmers toevoegen gewenste concentratie en meng goed. Bijvoorbeeld, tot een eindconcentratie van 0,5 mM D-leucine verkregen in 30 ml tot pellicles of biofilms stellen, voeg 196,6 ul van een 76,3 mM (10 mg / ml) D-leucine voorraadoplossing.
- Na stollen van de agar, droog de vaste MSgg platen in een biologisch kap gedurende 30-45 minuten vóór de inoculatie.
- Om specifieke remmers die interfereren met de mechanismen van vlies formatie (figuur 1) te selecteren, uit te sluiten dat de gebruikte concentraties van invloed plankton en statische groei.
- Bepaal planktonische groei (toename van de optische dichtheid in de tijd in vloeibare kweek) op eenvoudige groeicurve door de optische dichtheid bij 600 nm per uur tot de stationaire groeifase.
- Om te bevestigen dat de gemeten troebelheid cultuur vertegenwoordigt levende cellen telt, bepalen het aantal kolonievormende eenheden (CFU)van de cellen in het plankton groeifase van een trillende cultuur na verschillende tijdstippen.
- Om het effect van kleine molecule inhibitoren over statische vlies groei, oogst cellen aan het eind van een 3-daagse incubatie beoordeeld op 23 ° C van een 24-well celcultuur goed, geïnoculeerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in secties 1,7-1,9 en het bepalen van de CFU. Voor deze controle gebruik maken van een vlies-deficiënte stam die de operons die coderen voor de extracellulaire matrix componenten ontbreekt (dwz B. subtilis Δ epsH, Δ Tasa).
Opmerking: Deze stam kan groeien onder statische omstandigheden, maar in tegenstelling tot een vlies vormende wildtype, dat deficiënt is in het drijfvermogen aan het vloeistof-luchtgrensvlak, waarbij de groei wordt bevorderd door verhoogde zuurstofniveaus 26. Zo, dit extracellulaire matrix-en vlies-deficiënte stam is een aanbevolen referentie-stam om de groei te kunnen beoordelen onder statische omstandigheden.
OPMERKING: Voor de specifieke exvoldoende van de niet-canonieke D-aminozuur D-leucine hieronder beschreven effect op plankton en statische groei bij concentraties die beperkend vlies vorming werd uitgesloten 12,17. De werkwijzen voor plankton en statische groei bepalen worden beschreven 17.
Figuur 1. Conceptueel overzicht voor de identificatie van een robuuste experimentele opstelling aan de specifieke remming van de biofilmvorming Selectiecriteria voor kleine molecule remmers die specifieke interferentie met de vorming van biofilm zonder uitgesproken effect op plankton groei aangeven beoordelen.. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
- Streak out B. subtilis uit een -80 ° C voorraad (LB culture van 10 9 cellen / ml ingevroren in 20% glycerol) om enkele kolonies isoleren op een LB-1,5% agar plaat met een steriele tip of applicator stick.
- Groei overnacht bij 30 ° C.
- Kritische stap: Voor een robuuste vlies remming door de niet-canonieke D-aminozuren zoals D-leucine, groeien een enkele kolonie uitgekozen uit de LB-1,5% agar plaat 3 ml LB-bouillon bij 37 ° C gedurende 4 uur in een schudden incubator (schudden snelheid 200 rpm). Vervang de LB bouillon met biofilm inducerende MSgg medium vóór de inoculatie door centrifugatie 1,5 ml startercultuur gedurende 4 minuten bij 6000 xg, zorgvuldig verwijderen van het supernatant en opnieuw suspenderen van de pellet in 1,5 ml MSgg medium. De rest van de kweek kan worden weggegooid.
Belangrijk: Om de robuustheid van het systeem te waarborgen, dient de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van de gewassen startercultuur tussen 0,6 en 1. - Tijdens de groei van de starter cultuur, bereiden een 12-well celcultuur multidish plaat met daG 3 ml MSgg medium zonder of met een concentratiebereik van de kleine molecule inhibitor (bijvoorbeeld 0,3, 0,5, 1 mM D-leucine 17). Om uit te sluiten randeffecten, verspreiden de locatie van de verschillende concentraties over de multidish plaat. U kunt ook gebruik maken van 24-well celcultuur multidish platen met 1,5 ml MSgg medium.
- Beënt de putjes van de 12-well celcultuur multidish plaat met 3 ul van de gewassen startercultuur (1: 1000 verdunning).
Opmerking: Een lagere verdunningsverhouding, dwz 1: 500 kan worden gebruikt. Dit vermindert de ontwikkelingstijd van de pellicles. - Groeien de pellicles bij 23 ° C onder statische omstandigheden, voor drie dagen. Mis pellicles niet bewegen tijdens deze periode, omdat het uiteindelijke oppervlak morfologie van het vlies kan beïnvloeden.
- Verwerven van foto's met een verrekijker en homogene blootstelling van de bliksem. U kunt ook een foto van de pellicles met een hoge resolutie camera. Artefacten veroorzaakt door inconsis voorkomentent licht hoeken en schaduwen, neem top-down foto's met de op een statief vaste camera en gebruik een zachte en grote lichtbron bij 45 ° van beide kanten.
Opmerking: Een alternatieve methode B. bestuderen subtilis multicellulariteit is de biofilm kolonie assay op vaste, biofilm-inducerende MSgg medium. Net als pellicles, deze test maakt het mogelijk de studie van spatiotemporele processen. Zodra het actieve bereik van kleine molecule inhibitoren wordt bepaald, kan hun effect op biofilm kolonievorming bestudeerd. - Biofilm kolonies groeien, symmetrisch spot 1,5 pl van de ongewassen voorkweek (stap 1,7) op de gedroogde MSgg 1,5% agar plaat met behulp van een sjabloon - 4 druppels per petrischaal van 8,5 cm diameter. Laat de druppels adsorberen op de plaat alvorens ze te verplaatsen.
OPMERKING: De matrijs helpt om een gelijke verdeling van de biofilm kolonies in het gebied waar de cellen worden gekweekt krijgen. Om de sjabloon te bereiden, trek de totale oppervlakte van de groei in de originele weegschaal, verdeel het op gelijke sekteors en markeer het midden. Voor een ronde petrischaal van 8,5 cm diameter, dit wijst 14 cm2 tot een biofilm kolonie. - Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende drie dagen. Gedurende deze tijd biofilm kolonies ontwikkelen en vormen een driedimensionale, gerimpelde structuur.
- Maak foto's zoals in stap 1.11.
2. Ethanol Verzet Assay
- Grow biofilms zoals beschreven in de stappen 1,1-1,7 en 1,12-1,14.
- Na 68 uur groei bij 30 ° C, snijd de biofilm kolonies in twee gelijke delen met behulp van een scheermesje en het template.
Figuur 2. Voorbeeld proefopzet de weerstand van biofilm kolonie cellen beoordeeld in sterilisatiemiddelen. (A) Sjabloon voor de gelijkmatige verdeling van biofilm kolonies in een petrischaal en snijden. (B)Top-down beelden van onbehandeld wild-type biofilm geteeld voor 68 uur op vaste, gedefinieerde biofilm-inducerende MSgg medium bij 30 ° C. De uitbreiding laat zien hoe een biofilm kolonie in twee gelijke helften kunnen worden gesneden. (C) De twee gelijke helften biofilm gelijk worden behandeld (controle, PBS) of PBS of steriliseermiddel en verwerkt zoals beschreven. Schaal bar:. 1 cm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Til elke helft van de biofilm kolonie van de agarplaat met een kleine spatel en verplaatsen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 500 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Eventueel schrapen de resterende cellen van de plaat en overbrengen naar de microcentrifugebuis ook.
OPMERKING: De tweede helft van de biofilm kolonie verschillend behandeld, afhankelijk van of het de bestrijding of de bestendigheid tegen steri testenLizing agenten. - Voor de controle, incubeer de tweede helft van de biofilm kolonie in 500 pl PBS zoals in stap 2.3. Om de weerstand te bepalen sterilisatiemiddelen, de tweede helft van de biofilm kolonie overdragen aan 500 pl 50% (v / v) ethanol.
OPMERKING: Alternatieve sterilisatiemiddelen zoals natriumhypochloriet worden gebruikt. Voor sterilisatiemiddelen gebruikt, bepalen de actieve concentratie en incubatietijd vooraf een apart experiment. - Incubeer de biofilm kolonies 10 min op de bank-top bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de biofilm kolonies gedurende 5 min bij 18.000 xg en verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 300 pl PBS.
- Ultrasone trillingen de cellen mild (amplitude 10%, puls 5 sec) met de microtip van een ultrasoonapparaat.
LET OP: De ultrasoonapparaat energie moet voldoende zijn om aparte biofilm aggregaten. Echter, soms ook weer sonicatie het lyseren. Bevestig vooraf door lichtmicroscopie dat de ultrasoonapparaat energieniet meer lyseren de cellen en alle aggregaten opgelost. - Voeg 700 pl PBS tot een eindvolume van 1 ml. Voer een seriële verdunning (tot 10 -7) in PBS en verdeel 100 ul van 3 verdunningen op een LB-1,5% agar plaat met steriele glazen kralen.
OPMERKING: De optimale verdunningen worden uitgeplaat dient te worden bepaald in een voorafgaande proef, omdat dit afhankelijk is van de hoeveelheid cellen in de biofilm kolonie van belang en de overleving van de cellen in reactie op het sterilisatiemiddel. - Incubeer de platen gedurende de nacht bij 30 ° C, tellen de CFU en bepaal CFU / ml. Van het uiteindelijke CFU / ml van elke helft biofilm kolonies Bereken het percentage overlevenden.
OPMERKING: Indien uitgevoerd en geanalyseerd zoals beschreven, de twee helften van de controle biofilm kolonie en de onbehandelde versus-ethanol behandelde helft van de onbehandelde biofilm kolonie zulke verschillen dan 10% in aantal levensvatbare cellen werd verkregen, verifiëren de symmetrie of de weerstand van de kolonie , respectively. Als alternatief, kunnen de resultaten worden weergegeven in totaal CFU. De cel tellingen van de controle- en behandelde biofilm kolonie moet in dezelfde orde van grootte blijft. Daarentegen worden de celtellingen van de ethanol-behandelde helft van een kleine-molecule behandelde biofilm kolonie verwachting met ten minste twee orden van grootte te krijgen voor een verhoogde gevoeligheid voor de sterilisatiemiddel.
3. Biofilm Colony Monstervoorbereiding voor Scanning Electron Microscopy
- Groeien biofilm kolonies zoals beschreven in de stappen 1,1-1,7 en 1,12-1,14.
- Bereid een verse partij van 2% (v / v) glutaaraldehyde, 3% (v / v) paraformaldehyde oplossing in 100 mM natriumcacodylaat, 5 mM calciumchloride, pH 7,3. Bereid 5 ml fixeermiddel voor elke petrischaal van 8,5 cm diameter.
LET OP: Glutaraldehyd en paraformaldehyde gevaarlijk zijn. Behandel ze met veiligheidsuitrusting in een chemische kap. Gooi de oplossingen en de verontreinigde materialen om de Hazardous afval. - Voeg voorzichtig het fixeermiddel om de biofilm kolonies zonder direct afgeven bovenop de biofilms.
LET OP: Door het hydrofobe karakter van de biofilm kolonie, de koloniën langzaam los te maken van de agar en beginnen te zweven. - verzegelen voorzichtig de platen met een strook van Parafilm. Incubeer op een roterende schudder gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en vervolgens de platen overnacht overbrengen naar 4 ° C.
- De volgende dag, verwijder de vloeistof met een Pasteur pipet glas verbonden met een vacuümpomp.
- voeg 10 ml 100 mM natriumcacodylaatbuffer, 5 mM calciumchloride buffer voorzichtig naar de biofilm wassen en incubeer gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de vloeistof met het Pasteur glazen pipet uit de hoek van de plaat om te voorkomen dat schade aan de biofilm en voeg verse wasoplossing door voorzichtig pipetteren. Herhaal deze stap een keer.
- Voor het ontwateren van de biofilm koloniën, verder met de volgende stappen: 2x 5 min in DDH 2 O; 2x 20 min in 30% ethanol; 2x 20 min in 50% ethanol; 2x 20 min in 70% ethanol; 2x 20 minuten in 96% ethanol; 2x 30 min in 100% ethanol.
- Voeg 15 ml van de vloeistof voor elke petrischaal van 8,5 cm diameter bij elke stap en verwijder de vloeistof zorgvuldig na elke incubatie.
- Met twee verschillende methoden voor het drogen van de monsters uit ethanol.
- Voor drogen aan de lucht uit ethanol:
- Snijd een cellulose filterpapier (diameter van 9 cm) in kwartalen. In het kort onderdompelen een kwart in 100% ethanol, en vervolgens zorgvuldig te dragen een drijvende biofilm kolonie op het. Plaats het natte filtreerpapier in een petrischaal bekleed met een papieren filter. Dek de petrischaal en laat de biofilm koloniën droog 's nachts in een chemische kap.
- Voor kritisch punt (CP) -drying met behulp van kooldioxide (CO 2) de overgang vloeistof:
- Vul 75% van het kritische punt gedroogd machinekamer met 100% ethanol. Breng de monsters in een houder, elk monster in zijn eigen cHamber. Eventueel stuurde de biofilm met een schaar in kleine stukjes. Laat de monsters ondergedompeld in ethanol gedurende alle handelingen. Vervolgens overdracht van de houder in de kamer en sluit de kamer stevig vast.
- Koel de kamer naar 7 ° C en start roeren. Vul de kamer volledig met vloeibare CO 2. Tijdens een 7 minuten incubatietijd, laat de ethanol mengsel met CO 2. Vervolgens ontladen 25% van de oplossing.
NB: Mag niet de ruimte onder het niveau van het monster. - Herhaal stap 3.8.2.2 vier keer.
- Herhaal stap 3.8.2.2 vijfmaal met een incubatietijd van slechts 5 minuten. Ten slotte moet de ethanol volledig vervangt CO 2.
- Tijdens de laatste ronde, lege slechts 5% van de kamer. Schakel de roeren en de koeling. Start verwarmen van de kamer naar 42 ° C. Bij een temperatuur van 31,1 ° C en een druk van 73,9 bar, de vloeibare CO 2 zijn kritische punt, de toestand bereikt waarin het gasvormige phase heeft dezelfde dichtheid als de vloeistoffase van het oplosmiddel 27. Wanneer de temperatuur 42 ° C bereikt, incubeer 10 min. Bij 42 ° C, de CO2 in de kamer voorkomt als superkritisch gas.
LET OP: Controleer voortdurend de druk van de kamer. De druk mag niet hoger zijn dan 120 bar bij 42 ° C. - Start om het gas langzaam los met doorlopende verwarming. Dit houdt de bemonsteringen in het CO 2-gas fase en voorkomt de vervorming van het monster morfologie door de vloeistof oppervlaktespanning. Stel de flowmeter tot 5 l / uur door fijnafstelling doseerklep regelen van de stroommeter. Wacht tot de al de druk in de kamer wordt vrijgegeven. Open nu de kamer en verwijder voorzichtig de monsters uit de houder.
- Voor drogen aan de lucht uit ethanol:
- Coat een elektronenmicroscopie stomp met carbon tape. Met behulp van een pincet, zorgvuldig overdracht van de biofilm kolonies op de stomp. Sluit elke kolonie aan de stomp door toevoeging van een dunne brug uit autobon tape, wat cruciaal is voor lading eliminatie in de elektronenbundel. In dit stadium omgaan met de biofilm kolonies voorzichtig aangezien zij zeer kwetsbaar. Bewaar de monsters in een exsiccator gedurende ten minste 24 uur of totdat onderzoek.
- De dag van het onderzoek met de elektronenmicroscoop, sputter-coaten van de biofilm koloniën gedurende 2 minuten in een 60 ° hoek in een goud-palladium-sputter coater. Herhaal deze stap twee keer en draai de monsters van 120 ° in tussen. Eind, sputter-coat monster eenmaal gedurende 3 min van bovenaf. De 20 nm dunne laag goud-palladium verbetert de geleidbaarheid en verhoogt het contrast van het monster voor de beeldvorming in de SEM.
- Bewaar de monsters in een exsiccator tot de rehydratatie van het monster 28 mogelijk is totdat beeldvorming met een rasterelektronenmicroscoop 29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vlies test is een methode om de sterk gereguleerd en dynamische processen te bestuderen B. subtilis multicellulariteit. Daarnaast wordt het vlies assay geschikt voor een reeks van ofwel pre-startersvoorwaarden of klein molecuul concentraties getest in een enkele celkweek multidish plaat in één experiment. Echter, B. subtilis pellicule formatie is gevoelig voor de voorkweek omstandigheden (bijvoorbeeld groeimedium van de voorkweek en groeifase), de inoculatie verhouding en het verwijderen van de pre-kweekmedium. We hebben daarom eerst gescreend op een experimentele opstelling die ons toeliet om vlies remming door D-leucine te reproduceren. Onze resultaten tonen aan dat reproduceerbare vlies remming door D-leucine kan worden verkregen wanneer de cellen vooraf gekweekt in undefined, rijk LB medium tot een mid-logaritmische groeifase (enkele kolonie in 3 ml LB bij 37 ° C gedurende 4 uur onder schudden ), afgecentrifugeerd en geresuspendeerd in gedefinieerde MSgg medium voordat een 1: 1000 inoculation (Figuur 3A). Wanneer de cellen in MSgg medium werden gekweekt tot de midden-logaritmische groeifase (enkele kolonie in 1 ml LB gedurende 2 uur, opnieuw verdund 1: 100 tot 3 ml MSgg, en gedurende 5 uur bij 37 ° C onder schudden bij 200 min), verwijdering van de pre-kweekmedium had geen effect op D-leucine activiteit. Cellen gekweekt tot de stationaire groeifase (enkele kolonie in 1 ml LB gedurende 2 uur, opnieuw verdund 1: 100 tot 3 ml MSgg, en gedurende maximaal 20 uur in een wals bij kamertemperatuur) en gewassen met MSgg medium voordat inenting waren minder gevoelig. Dit kan echter verhoging van weerstand tegen het vlies inhibitie effect van D-leucine als gevolg van de hogere celdichtheid van de pre-kweek, waardoor de inoculatie ratio. De inoculatie verhouding van de voorkweek de statische groei MSgg medium, dat wil zeggen 1: 500 of 1: 1000, beïnvloed het activiteitsgebied van D-leucine en het tijdstip van ontwikkeling vlies (figuur 3B). Pellicle remming door D-leucine plaatsgevondenbij verschillende groeitemperaturen (23 ° C en 30 ° C, Figuur 3C). Belangrijk, terwijl de gevoeligheid van cellen voor D-leucine afhankelijk van de pre-kweekomstandigheden, de reproduceerbaarheid van de verschijnselen bij verschillende temperaturen toont dat vlies remming door het kleine molecuul D-leucine robuuste kenmerken.
. Figuur 3. Voorbeeld resultaten die de effecten van verschillende voorkweek voorwaarden vlies remming door D-leucine vertonen verschillende parameters moeten worden beoordeeld om een gedegen experimentele opstelling te verkrijgen, inclusief: (A) het verwijderen van verontreinigingen uit de voorcultuur groei medium (versus niet gewassen gewassen), groeimedium van de voorkweek (rijk, ongedefinieerd medium LB of gedefinieerd biofilm-inducerende MSgg medium) en groeitoestand van de voorkweek (logaritmische versus stationaire groeifase), (B) inoculatie ratio (1: 1000 versus 1: 500) van de voorkweek in het uiteindelijke vlies groeimedium en (C) kweektemperatuur (23 ° C versus 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 cellen werden gekweekt in de aangegeven (LB of MSgg) gedurende 4 uur bij 37 ° C of bij kamertemperatuur gedurende de nacht (o / n) onder schudden medium en pre-kweekmedium werd vervangen door MSgg indien aangegeven (gewassen of niet-gewassen). Tenslotte werd de startercultuur geïnoculeerd 1: 1000 tenzij anders aangegeven en pellicles werden onder statische omstandigheden gekweekt bij 23 ° C gedurende drie dagen. Top-down foto's werden verworven met een camera. Wel een diameter van 22 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na de identificatie van pre-kweekomstandigheden en een experimentele opstelling die manier konden voor een reproduceerbare activiteit reeks Dleucine op vliesje formatie (pre-kweek in LB tot een mid-logaritmische groeifase in MSgg gewassen, verdund 1: 1000 en gegroeid bij 23 ° C gedurende drie dagen), het effect werd getest op robuustheid. Daartoe de activiteit van D-leucine op vlies vorming werd beoordeeld in verschillende gemodificeerde MSgg media (figuur 4). Het activiteitsgebied van D-leucine in vlies remming was consistent in de vijf geteste media, en laat zien dat het effect van D-leucine op vlies vorming robuust. Een soortgelijke trend werd waargenomen met D-tyrosine, waarbij vliesje remming in het concentratiebereik tot 2 uM was consistent in verscheidene gemodificeerde MSgg media (lagere ijzerconcentratie en vervanging van de stikstofbron met ammoniumchloride of koolstofbron met glucose, gegevens niet getoond).
Figuur 4. Gevoeligheid voor D-leucine optreedt inverschillende groeimedia. Getoond worden top-down foto's van B. subtilis NCIB 3610 pellicles, gekweekt onder statische condities bij 23 ° C in duidelijk biofilm inducerende MSgg medium of verschillende gemodificeerde MSgg media (koolstofbron 0,5% glucose; stikstofbron 0,5% (NH4) 2 SO4; hoog ijzergehalte 250 uM FeCl3, lage glycerol 0,125% glycerol) gedurende drie dagen, met uitzondering van de alternatieve stikstofbron medium (waar de pellicles werden gedurende vijf dagen) ofwel zonder of met D-leucine op aangegeven concentraties. Starterculturen werden gedurende 4 uur bij 37 ° C onder schudden in undefined, rijk LB medium. Vóór de inoculatie werden de cellen gewassen door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in de overeenkomstige vlies groeimedium. De starter kweek werd verdund 1: 1000, de put een diameter van 22 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een alternatieve methode B. bestuderen subtilis multicellulariteit is de biofilm kolonie assay op vast MSgg medium. Net als pellicles, deze test maakt het mogelijk de studie van spatiotemporele processen. Zodra het actieve bereik van kleine molecule inhibitoren bepaald in het vlies systeem, kan hun effect op biofilm kolonievorming bestudeerd. In deze studie werden biofilm kolonies gebruikt om het effect van D-leucine op de weerstand van biofilm kolonies sterilisatiemiddelen beoordelen, omdat biofilm kolonies minder kwetsbaar en het effen achtergrond zijn ze gemakkelijker te manipuleren. Wanneer biofilm kolonies behandeld met D-leucine worden blootgesteld aan 50% ethanol gedurende 10 min, daalt het percentage van overlevende cellen drastisch vergeleken met de onbehandelde fractie (Figuur 5). Deze werkwijze kan verder worden ontwikkeld om de effecten van andere kleine molecule inhibitoren en hun effect op de bestandheid tegen bactericide middelen beoordelen (sterilasse agenten of antibiotica).
Figuur 5. Voorbeeld resultaten van onbehandeld of behandeld biofilm kolonie verzet tegen sterilisatiestoffen. Biofilm kolonies van B. subtilis NCIB 3610 werden gekweekt op vast gedefinieerd medium gedurende 68 uur bij 30 ° C met of zonder 0,5 mM D-leucine. Na het snijden van de kolonies in twee gelijke helften, werd de helft behandeld met PBS (interne controle) en de andere helft met 50% ethanol of PBS (controle). Na mild sonicatie, seriële verdunning platen en het tellen van de kolonievormende eenheden, werd het percentage overlevenden in vergelijking met de interne controle berekend. Getoond worden de resultaten van drie onafhankelijke experimenten met de gemiddelden van twee (A) of drie (B, C) repliceert en hun standaardafwijkingen. Klik hier to bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om zich te concentreren op de ruimtelijke structuur van biofilm kolonie rimpels, de overvloed en lokalisatie van de EPS en één celmorfologie 31. SEM beeldvorming vereist monsters die onder hoog vacuüm kan worden afgebeeld. Monsters onder vacuum onderzoeken alle bulk watermoleculen worden verwijderd, en derhalve SEM beeldvorming vereist de dehydratatie van het monster voor beeldvorming. Als alternatief kunnen monsters worden afgebeeld onder laag vacuüm in de natte modus door environmental scanning elektronenmicroscoop (ESEM), waarbij het gehydrateerde monster voorzichtig in de microscoop kamer wordt gedroogd. Om de effecten van kleine molecule inhibitoren op biofilm kolonie architectuur, de EPS organisatie en celmorfologie te bepalen werden drie verschillende typen monster uitdroging vergelijking: drogen in de microscoop bij natte mode omstandigheden (ESEM), lucht gedroogd uit een oplosmiddel of kritisch punt (CP) -gedroogd behulp van kooldioxide als de overgang vloeistof. In onbehandelde en D-leucine behandelde B. subtilis biofilm kolonies verschillende stadia hydratatie volgens de methode kon worden waargenomen. Imaging onder lage vacuüm in de natte modus door ESEM behouden de natuurlijke staat van de biofilm kolonie. Uit informatie over enkele celmorfologie en EPS overvloed en architectuur schaars, omdat de EPS nog steeds volledig gehydrateerd en de cellen ingebed in de EPS (gegevens niet getoond). In termen van uitdroging, CP-drogende was de meest stringente procedure. Het verwijderd meest structureel gebonden en bulk watermoleculen uit het weefsel, goed voor een volumeverlies van 30-70%, afhankelijk van het weefsel 32. In contrast, drogen aan de lucht bewaard de gebonden watermoleculen. Een embryonaal weefsel bijvoorbeeld verloor 18% van zijn volume na drogen aan de lucht van het vluchtige oplosmiddel ethanol en 59% na CP-drogen 32 (Figuur 6A) . Biofilm kolonies die gedehydrateerd met ethanol en werden CP-gedroogde ook behouden hun drie-dimensionale structuur, en de EPS zag eruit als een spinnenweb (figuur 6C). In de lucht gedroogd en CP-gedroogde monsters, het effect van de kleine molecule inhibitor D-leucine op de biofilm kolonie architectuur, de cel morfologie en structuur EPS blijken duidelijk (figuur 6B en D). De biofilm kolonies gekweekt in aanwezigheid van D-leucine waren kleiner en de rimpels minder uitgesproken. De D-leucine-behandelde cellen werden uitgerekt, een fenotype dat observed in cellen behandeld met celwand-targeting moleculen 33. Bovendien werden de cellen duidelijk minder bedekt met de EPS en niet nauw verbonden met hun naburige cellen via EPS gezien in de onbehandelde biofilm kolonies. De gepresenteerde resultaten tonen aan dat beide methoden van biofilm kolonie uitdroging, luchtgedroogde uit ethanol of CP-gedroogd met kooldioxide als de overgang fluïdum geven waardevolle inzichten over het effect van kleine moleculen op de cel morfologie, alsmede op de EPS overvloed en architectuur.
Figuur 6. Kleine moleculen kunnen de grote en kleine schaal van de biofilm kolonie architectuur te veranderen. Biofilm kolonies van B. subtilis NCIB 3610 gegroeid (A en D) in de aan- of (B en D) in aanwezigheid van 0,5 mM D-leucine gedurende 72 uur bij 30 ° CMSgg op vast medium werden gefixeerd zoals beschreven in het protocol en gedroogd uit ethanol als volgt: (A en B) aan de lucht gedroogd en (C en D)-CP gedroogd met kooldioxide als de overgang fluïdum. Getoond worden top down verrekijker beelden van de biofilm kolonies (links, bovenste panelen), top-down foto's van de gedroogde biofilm kolonies gemonteerd op elektronenmicroscopie stubs voorafgaand aan goud-palladium-coating (links, onderste panelen), lage en hoge vergrotingsfactor beelden die door SEM om de 3D-architectuur van de biofilm kolonie rimpels of de enkele cel morfologie / EPS organisatie. Schaal bars van links naar rechts:. 5 mm, 100 urn, 2 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1,925 mM | potassium monobase |
| 3,075 mM | dibasisch kaliumfosfaat |
| 100 mM | 3- (N -morpholino) propaansulfonzuur, pH 7,1 |
| 2 mM | magnesiumchloride hexahydraat |
| 700 uM | calciumchloride watervrij |
| 50 uM een | ijzer (III) chloride hexahydraat |
| 125 uM b | |
| 1 uM | watervrij zinkchloride |
| 2 uM | thiaminechloorhydraat |
| 50 ug / ml | tryptofaan |
| 50 ug / ml | fenylalanine |
| 50 ug / ml | threonine |
| 0,5% (v / v) | glycerol watervrij |
| 0,5% (w / v) | L-glutaminezuur mononatrium zouten hydraat |
| een voor het huidje test; b voor biofilm assay | |
Tabel 1. Uiteindelijke 1x MSgg samenstelling gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacillus subtilis vormen robuust en zeer gestructureerd biofilms zowel in vloeibare (pellicles) en op vast medium (kolonies). Daarom dient het als een ideaal model organisme met het werkingsmechanisme van bepaalde biofilminhibitoren karakteriseren. Op vaste media, cellen vormen meercellige structuren met onderscheidende kenmerken die niet duidelijk in pellicles, zoals rimpels straalt van het centrum naar de rand. Zo pellicles en kolonies zijn complementair systemen om B. te studeren subtilis multicellulariteit.
Het doel van deze studie is om een B. ontwikkelen subtilis modelsysteem voor biofilm (pellicles en kolonies) remming. Verschillende stappen zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid van de biofilm verstoring essay. Een eerste belangrijke stap is om te bevestigen dat het effect op biofilmvorming is niet het gevolg van algemene toxiciteit voor bacteriën gekweekt in het planktonische levensstijl. Dit kan door het vergelijken van het effect van een gegeven concentratie als beschouwdmall molecule inhibitor van de relatieve biofilmremmers het effect van het molecuul op plankton groei. Een aanzienlijk sterkere invloed op biofilm ontwikkeling kan zorgen voor de identificatie van target mechanismen die specifiek belang voor de ontwikkeling van biofilms. Verder is de hierin beschreven onderzoek blijkt het belang van de pre-kweekomstandigheden de ontwikkeling van pellicles en hun gevoeligheid voor kleine moleculen. Voordat het karakteriseren van het effect van kleine moleculen, reproduceerbaar en robuust experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld vlies groeitemperatuur en ongevoeligheid voor de mediumsamenstelling) om hun effect te testen moeten worden gedefinieerd. Om dergelijke voorwaarden vinden, de media van de voorkweek toestand groeifase van de voorkweek, pre-kweekmedium verwijderd, groeitemperatuur en groeimedia worden overwogen.
Een grote uitdaging, zodra een specifieke remmer voor biofilmvorming wordt gevonden, is kwantitatief te vindenen kwalitatieve methoden die de effecten van deze kleine moleculen remmers op biofilm ontwikkeling en weerstand karakteriseren. Hier zijn twee belangrijke werkwijzen beschreven die kunnen worden gebruikt om de effecten van deze inhibitoren te beoordelen. Eerst introduceren we een eenvoudige kwantitatieve methode die reproduceerbaar de weerstand van behandelde versus onbehandelde kolonie biofilms te bactericiden, zoals ethanol sonde. Representatieve resultaten worden getoond voor de gevoeligheid van D-leucine behandelde biofilm kolonies tot 50% ethanol. Echter, dit essay eenvoudig worden aangepast door verschillende sterilisatiemiddelen of antibiotica. Ten tweede is een SEM werkwijze beschreven die hoge resolutie behandeling van de veranderingen in de biofilm kolonie veroorzaakt door de kleine molecule inhibitor in verschillende complementerende niveaus laat de algemene structuur, organisatie en overvloed van de EPS matrix en de componenten, en de eencellige morfologie gehele biofilm. Wij constateren dat twee methoden van dehydration (luchtdrogende van 100% ethanol of CP-droging met kooldioxide als de overgang vloeistof) ook kan worden gebruikt tijdens de SEM monsterbereiding van een biofilm kolonie. Vooral de succesvolle bevestiging van de biofilm monster grotendeels op de hydrofobiciteit van de biofilm kolonie. Dit hydrofobiciteit is een intrinsiek kenmerk van B. subtilis biofilms door de hydrofobe oppervlaktelaag 10,34.
Verschillende benaderingen werden vroeger gebruikt om biofilm assemblage en ontwikkeling te bestuderen met B. subtilis als modelorganisme 35. Een aantal onafhankelijke studies tonen het effect van mediumsamenstelling op biofilm ontwikkeling 36-38. Tot nu toe echter een systematische evaluatie van de effecten van media samenstelling op biofilm remming was, om het beste van onze kennis, ontbreekt. Deze studie toont aan dat terwijl vlies remming van B. subtilis door kleine moleculen gevoelig vooraf kweekomstandigheden, is unaffected door temperatuurinvloeden en mediumsamenstelling, en dus bruikbaar voor systematische schermen van kleine molecule inhibitoren. Ook hebben we een eenvoudige, reproduceerbare en kwantitatieve methode om de weerstand van onbehandeld of klein molecuul-remmers behandelde biofilm kolonies antibacteriële geneesmiddelen te beoordelen, momenteel ontbreekt in de biofilm modelorganisme B. subtilis.
B. subtilis biofilms in combinatie met fluorescerende reporters kan worden voortgezet om te zoeken naar remmers van kleine moleculen die ofwel een bepaald ontwikkelingsstap biofilmvorming of een specifieke subpopulatie van cellen in de biofilm targeten. De hierin beschreven werkwijzen bieden geen enkele resolutiecel qua genexpressie in de biofilm. Methoden voor EPS matrix genexpressie analyse binnen B. subtilis biofilms op de enkele cel niveau werden met succes 39 opgericht.
Bacteriële biofilms zijn crucial betekenis in de landbouw, industrie en klinische settings. In een agrarische context, het vermogen tot het vormen van biofilms verhoogt de plantengastheer kolonisatie van verschillende plantenpathogenen 40, en in een klinische context, biofilms zijn intrinsiek resistent tegen antimicrobiële agentia en 21 vormen de kern van vele hardnekkige en chronische bacteriële infecties. Bovendien wordt nu erkend dat biofilms hebben enorme financiële gevolgen voor de industrie omdat ze zeer moeilijk te verwijderen en regelen 41. Daarom is de ontwikkeling van een experimenteel raamwerk voor de studie van microbiële biofilm inhibitoren significant agrarische 42,43, 21,44 klinische en technologische vooruitgang 45-47 verschaffen.
De huidige methoden zijn beperkt tot B. subtilis. We moedigen na de beschreven kwantitatieve en kwalitatieve concepten biofilm-specifieke kleine molecule inhibitoren te bestuderen in andere soorten ook. Daarnaast Deze studie heeft betrekking op een specifiek voorbeeld voor biofilm remming door D-leucine, uit verschillende specifieke biofilminhibitoren eerder 17 gepubliceerd. Belangrijk is dat D-leucine al gekarakteriseerd als anti-biofilm molecuul in de plant pathogeen Xanthomonas citri 48, enkele mogelijke overeenkomsten tussen plant kolonisatie en biofilmvorming. Biofilmvorming (vlies en rugose kolonievorming) is ook gebruikelijk in humane pathogenen (bijvoorbeeld Pseudomonas aeruginosa 49-51 en uropathogene Escherichia coli 52,53). De beschreven methoden kunnen verder worden ontwikkeld om te zoeken naar specifieke geneesmiddelen die de vorming van biofilm te remmen en te verminderen-biofilm gemedieerde resistentie tegen antimicrobiële stoffen in klinisch onderzoek. Algemeen, kan de hier beschreven werkwijzen worden gebruikt als basis voor kwantitatieve en kwalitatieve concepten biofilm-specifieke remmers van kleine moleculen te bestuderen in andere soorten ook.
nt "> Kortom, bieden wij een eenvoudige en handige tool-box die een goede illustratie van het potentieel sterke punten en valkuilen bij het gebruik van B. subtilis om biofilminhibitoren bestuderen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
