Introduction
communautés bactériennes multi-cellulaires jouent un rôle important dans les milieux naturels et anthropiques, et peuvent être bénéfiques ou très néfaste. Ces colonies multicellulaires sont appelées biofilms, dans lequel les cellules individuelles sont noyées dans une (EPS) de la matrice extracellulaire des substances polymères auto-produites. Les EPS adhèrent fortement les cellules à la surface qu'ils colonisent. Ils servent de bouclier contre les forces mécaniques et chimiques et de créer un contact étroit entre les cellules voisines, ce qui facilite la communication cellulaire 1. Un biofilm peut être considérée comme une communauté différenciée, où les cellules utilisent très réglementées, orchestré des processus pour coordonner leurs activités au sein de la communauté, ainsi que toutes les espèces 2-5. La transition d'un planctoniques, mode libre-vie de la croissance à un état de biofilm est souvent associée à des processus de développement. Un bon exemple est la bactérie du sol Bacillus subtilis Gram positif, et donc un undómësouche sticated sert organisme modèle robuste pour étudier les étapes du développement menant à la formation de biofilm. Dans cette bactérie, cellules mobiles s'organisent en structures multicellulaires visibles qui effectuent des tâches spécialisées 4. Un groupe de cellules, la matrice producteurs sécrètent exopolysaccharides 6, la protéine amyloïde Tasa 7,8, et la protéine de surface hydrophobe BSLA 9,10; qui tous participent à l'assemblage des EPS 11-13.
Compte tenu de l'abondance des biofilms dans des niches naturelles et anthropiques et les dommages mortels putative ils peuvent causer, il y a un besoin urgent de trouver des moyens de prévenir leur formation. Les inhibiteurs de petites molécules peuvent aider à la découverte de nouvelles voies de régulation, des enzymes et des protéines structurales impliquées dans la formation de biofilm, et promouvoir ainsi un aperçu des processus complexes de l'ensemble de la communauté multicellulaire. Comme B. subtilis est un modèle bien étudié pour la bioformation d' un film 14,15, il peut être utilisé pour évaluer les effets de divers inhibiteurs de biofilm. Cette étude aborde quatre méthodes fondamentales qui sont essentielles pour évaluer la réponse des biofilms aux inhibiteurs de petites molécules. Tout d'abord, pour s'assurer que ces inhibiteurs ont une cible spécifique de biofilm, la séparation de l'effet sur la croissance planctonique de l'effet sur la formation de biofilm est critique. La plupart des agents antibactériens cellules cibles dans leur phase de croissance planctonique, mais des molécules qui ciblent le mode de vie de biofilm sont rares. En outre, en tant que molécules qui ne touchent pas la croissance planctonique ne sont pas toxiques, ils peuvent réduire la pression sélective favorisant des mutants résistants aux antibiotiques 16. Par exemple, lorsque les biofilms sont traités avec des acides aminés D ou de certaines autres molécules de paroi interférant cellule, ils sont soit perturbés ou démontées, mais ces inhibiteurs affectent seulement légèrement 12,17 croissance planctonique. En revanche, de nombreux antibiotiques altèrent considérablement la croissance planctonique, avec little ou pas d' effet sur la formation de biofilm 17.
Deuxièmement, l'établissement d'un cadre expérimental cohérente et solide pour étudier l'effet des petites molécules est cruciale. Nous avons observé que la plage de concentration active d'inhibiteurs de petites molécules est sensible aux conditions de préculture et le dispositif expérimental utilisé pour étudier l'effet de ces inhibiteurs à petites molécules. Divers rapports, en particulier ceux qui étudient B. subtilis, a révélé des variations dans la plage de concentration à laquelle les acides D-aminés inhibent la formation de pellicules - les biofilms bactériens flottants 12,17-19. Les résultats présentés ici suggèrent que les facteurs suivants expliquent les différences dans la gamme de concentration active: les conditions de pré-culture (logarithmique 12,17 par rapport à la phase tardive stationnaire 20 croissance), le milieu de croissance utilisé dans l'état pré-culture (riche, undefined [Luria Broth, LB] par rapport défini [glutamate monosodique-glycérol, MSgg]), le rapport d'inoculation et en particulier l'élimination du milieu de pré-culture avant l'inoculation. La température de croissance pelliculaire statique a montré un rôle moins important dans le domaine d'activité de l'inhibiteur de petite molécule de D-leucine, représentant un acide D-aminé utilisé dans la présente étude.
Enfin, une fois que les biofilms sont traités avec des inhibiteurs de biofilm spécifiques, des méthodes robustes et informatives sont nécessaires pour caractériser les effets de ces inhibiteurs sur biofilm fitness. Ici, deux méthodes pour caractériser de façon indépendante l'effet des inhibiteurs de petites molécules sont décrits en détail: (1) L'effet sur des cellules individuelles au sein d'une colonie du biofilm et leur résistance aux agents antimicrobiens. Les cellules dans les biofilms sont généralement plus résistantes aux antibiotiques par rapport à des bactéries vivant librement 21-23. Bien que ce phénomène est multifactorielle, la capacité des EPS pour réduire la pénétration des antibiotiques a souvent été considérée comme une explication attrayante 24
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Protocol
1. Évaluation de l'effet des inhibiteurs de petites molécules sur Pellicle et formation de biofilms Colony
- Préparer une solution de 2 x milieu défini inducteur MSgg biofilm 25 sans que le chlorure de calcium et de fer (III) hexahydraté. Après stérilisation du filtre, ajouter le chlorure de calcium. Le milieu est prêt à être utilisé directement ou il peut être conservé à 4 ° C dans l'obscurité.
- Préparer la dilution 1x MSgg le jour de l'expérience.
- Diluer le moyen 2x MSgg à 1x avec de l'eau distillée stérile (des pellicules) ou 3% à chaud (80 ° C) agar stérile (biofilms) et ajouter du fer (III) hexahydraté à une concentration finale de 50 uM (pellicules) ou 250 uM ( biofilms). Ajouter des antibiotiques ou des inhibiteurs de petites molécules à la concentration souhaitée et bien mélanger. Par exemple, pour obtenir une concentration finale mM de D-leucine 0,5 dans 30 ml d'établir ou de pellicules biofilms, ajouter 196,6 76,3 ul d'une mM (10 mg / ml) Solution mère de D-leucine.
NONTE. La composition finale 1x MSgg est décrite dans le tableau 1 par rapport à la recette initiale 25, le milieu contenait 50 pg / ml de thréonine et de la concentration en fer à cultiver les colonies de biofilm sur un milieu de MSgg solide a été augmentée 2.5x pour optimiser la morphologie des colonies ridées .
- Diluer le moyen 2x MSgg à 1x avec de l'eau distillée stérile (des pellicules) ou 3% à chaud (80 ° C) agar stérile (biofilms) et ajouter du fer (III) hexahydraté à une concentration finale de 50 uM (pellicules) ou 250 uM ( biofilms). Ajouter des antibiotiques ou des inhibiteurs de petites molécules à la concentration souhaitée et bien mélanger. Par exemple, pour obtenir une concentration finale mM de D-leucine 0,5 dans 30 ml d'établir ou de pellicules biofilms, ajouter 196,6 76,3 ul d'une mM (10 mg / ml) Solution mère de D-leucine.
- Après solidification de la gélose, on sèche les plaques de MSgg solides dans une hotte biologique de 30 à 45 minutes avant l'inoculation.
- Pour sélectionner des inhibiteurs spécifiques qui interfèrent avec les mécanismes de formation de la pellicule (figure 1), excluent que les concentrations utilisées affectent planctoniques et la croissance statique.
- Déterminer la croissance planctoniques (augmentation de la densité optique au cours du temps en milieu liquide) dans une courbe de croissance simple en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les heures jusqu'à la phase de croissance stationnaire.
- Pour confirmer que la turbidité de la culture mesurée représente le nombre de cellules vivantes, déterminer le nombre de unités formant colonie (UFC)des cellules dans la phase de croissance planctonique à partir d'une culture sous agitation au bout de plusieurs points dans le temps.
- Pour évaluer l'effet des inhibiteurs de petites molécules sur la croissance de la pellicule statique, les cellules de récolte à la fin d'une incubation de 3 jours à 23 ° C à partir d'une culture cellulaire de 24 puits et inoculés dans les mêmes conditions que celles décrites dans les sections 1,7-1,9 et déterminer la CFU. Pour ce contrôle, utilisez une souche pelliculaire déficiente qui manque les opérons codant pour les composants de la matrice extracellulaire (ie, B. subtilis Δ EPSH, Δ TASA).
Remarque: Cette souche est capable de croître dans des conditions statiques, mais contrairement à un type sauvage pelliculaire formant, il est déficient dans la capacité de flotter à l'interface liquide-air, où la croissance est favorisée en raison des niveaux accrus d'oxygène 26. Ainsi, cette matriciel extracellulaire et la souche pelliculaire déficiente est une souche de référence recommandée pour évaluer la croissance dans des conditions statiques.
NOTE: Pour l'ex spécifiquesuffisante de la D-amino-acide D-leucine non canonique décrit ci - après, un effet sur la croissance statique planctoniques et à des concentrations qui interfèrent avec la formation pelliculaire a été écartée 12,17. Les méthodes pour déterminer planctoniques et la croissance statique sont décrites en détail 17.
Figure 1. Vue d'ensemble conceptuel pour l'identification d'un dispositif expérimental robuste pour évaluer l'inhibition spécifique de la formation de biofilm. Les critères de sélection pour les inhibiteurs de petites molécules qui indiquent l' interférence spécifique avec la formation de biofilm sans effet prononcé sur la croissance planctonique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Streak sur B. subtilis à partir d' un -80 ° C stock (LB culture de 10 9 cellules / ml congelés dans 20% de glycérol) pour isoler des colonies isolées sur une plaque de gélose%-1,5 LB avec une pointe stérile ou bâton applicateur.
- Cultivez une nuit à 30 ° C.
- ÉTAPE CRITIQUE: Pour une pellicule solide inhibition par les acides non-canonique D-amino tels que D-leucine, grandir une seule colonie prélevée du% plaque de gélose-1,5 LB dans 3 ml de bouillon LB à 37 ° C pendant 4 heures dans un secouant incubateur (vitesse d'agitation de 200 tours par minute). Remplacer le bouillon LB avec du milieu MSgg biofilm induisant avant l'inoculation par centrifugation culture 1,5 ml de démarrage pendant 4 min à 6000 xg, enlevant soigneusement le surnageant et remise en suspension du culot dans 1,5 ml de milieu MSgg. Le reste de la culture peut être mis au rebut.
Important: Afin d' assurer la robustesse du système, la densité optique à 600 nm (DO 600) de la culture de départ lavé doit être compris entre 0,6 et 1. - Au cours de la croissance de la culture starter, préparer un 12 puits de culture cellulaire plaque multiple à containing 3 ml de milieu MSgg sans ou avec une gamme de concentrations de l'inhibiteur à petite molécule (par exemple, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucine , 17). Pour exclure les effets de bord, distribuer l'emplacement des différentes concentrations sur la plaque multiple à. Vous pouvez également utiliser de culture cellulaire 24 puits plaques Multidish contenant 1,5 ml de milieu MSgg.
- Inoculer des puits de la plaque de culture cellulaire à 12 puits boîte multiple avec 3 ul de la culture de départ lavée (1: 1000 dilution).
REMARQUE: un taux de dilution plus faible, à savoir 1: 500 peut être utilisé. Ceci diminue le temps de développement des pellicules. - Cultiver les pellicules à 23 ° C dans des conditions statiques pendant trois jours. Ne déplacez pas les pellicules pendant ce temps, car il peut affecter la morphologie de la surface finale de la pellicule.
- Acquérir des photos avec une exposition binoculaire et homogène de la foudre. Vous pouvez également prendre une photo des pellicules avec une caméra à haute résolution. Pour éviter les artefacts causés par inconsisles angles et les ombres de lumière tente, de prendre des photos de haut en bas avec la caméra fixée sur un trépied et d'utiliser une source de lumière douce et grande à 45 ° des deux côtés.
NOTE: Une autre méthode pour étudier B. subtilis multicellularité est le biofilm colonie test sur solide, moyenne MSgg biofilm induisant. Comme pellicules, ce test permet l'étude des processus spatio-temporels. Une fois que la plage active d'inhibiteurs de petites molécules est déterminée, leur effet sur la formation de biofilm de colonies peut être étudiée. - Pour faire pousser des colonies de biofilms, repérer symétriquement 1,5 pl de la pré-culture non lavés (étape 1.7) sur le MSgg 1,5% plaque de gélose séchée à l'aide d'un modèle - 4 gouttes par boîte de Pétri de 8,5 cm de diamètre. Laissez les gouttes adsorber à la plaque avant de les déplacer.
NOTE: Le modèle permet d'obtenir une répartition égale des colonies de biofilms dans la zone où les cellules sont cultivées. Pour préparer le modèle, dessiner la superficie totale de la croissance à l'échelle d'origine, diviser à l'égalité de secteeurs et marquer le centre. Pour un plat rond Petri de 8,5 cm de diamètre, ce affecte 14 cm 2 à une colonie de biofilm. - Incuber les plaques à 30 ° C pendant trois jours. Pendant ce temps, les colonies se développent biofilm et forment trois dimensions, la structure plissée.
- Prenez des photos comme à l'étape 1.11.
2. Ethanol Résistance Assay
- Cultivez biofilms comme décrit dans les étapes 1,1-1,7 et 1.12-1.14.
- Après 68 h de croissance à 30 ° C, couper les colonies de biofilms en deux parties égales avec l'aide d'une lame de rasoir et le modèle.
Figure 2. Exemple de conception expérimentale pour évaluer la résistance des cellules biofilm de colonies aux agents stérilisants. (A) Modèle utilisé pour la distribution égale des colonies de biofilms dans une boîte de Pétri et pour la coupe. (B)images Top-down de non traitées de type sauvage biofilm cultivées pendant 68 h sur solide, un milieu défini biofilm induisant MSgg à 30 ° C. L'élargissement montre comment une colonie de biofilm peut être coupé en deux moitiés égales. (C) Les deux moitiés de biofilm égales sont traitées de manière égale (contrôle, PBS) ou soit avec PBS ou agent stérilisant et traité comme décrit. Barre d'échelle:. 1 cm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Soulevez délicatement chaque moitié de la colonie de biofilm de la plaque de gélose avec une petite spatule et le déplacer vers un tube de 1,5 ml contenant 500 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Si nécessaire, gratter les cellules restantes de la plaque et de les transférer dans le tube à centrifuger ainsi.
Remarque: la seconde moitié de la colonie du biofilm sont traitées différemment, selon que ce soit la commande ou pour tester la résistance à stériagents Lizing. - Pour le contrôle, incuber la seconde moitié de la colonie de biofilm dans 500 ul de PBS comme dans l'étape 2.3. Pour évaluer la résistance aux agents stérilisants, transférer la deuxième moitié de la colonie du biofilm de 500 ul de 50% (v / v) d'éthanol.
NOTE: Variante de stérilisation des agents tels que l'hypochlorite de sodium peuvent être utilisés. Pour tous les agents stérilisants utilisés, déterminer la concentration et la durée d'incubation active dans un essai préliminaire. - Incuber les colonies de biofilms pendant 10 minutes sur la paillasse à température ambiante.
- Centrifuger les colonies de biofilms pendant 5 min à 18000 xg et retirer délicatement le surnageant avec une pipette. Ajouter 300 ul de PBS.
- Soniquer les cellules légèrement (amplitude de 10%, pouls 5 sec) avec la micropointe d'un sonicateur.
NOTE: L'énergie de sonication doit être suffisante pour les agrégats de biofilm séparés. Cependant, sonication trop sévère peut lyser les cellules. Confirmer à l'avance par microscopie optique que l'énergie de sonicationutilisés ne lyser pas les cellules et que tous les agrégats sont dissous. - Ajouter 700 ul de PBS dans un volume final de 1 ml. Effectuer une dilution en série (à 10 -7) dans du PBS et 100 ul de s'étendre 3 dilutions% sur une plaque de gélose LB-1,5 en utilisant des billes de verre stériles.
REMARQUE: Les dilutions optimales à plaquer doit être déterminée dans un essai préliminaire, car cela dépend de la quantité de cellules dans la colonie du biofilm d'intérêt et le taux de survie des cellules en réponse à l'agent de stérilisation. - Incuber les plaques pendant une nuit à 30 ° C, comptez le CFU et déterminer CFU / ml. De la finale UFC / ml de chaque demi-colonies de biofilms, calculer le pourcentage de survivants.
REMARQUE: Quand elle est réalisée et analysé comme décrit, les deux moitiés de la colonie de contrôle du biofilm et non traitée par rapport à la moitié de l'éthanol traité par de la colonie du biofilm non traitée devrait donner des différences inférieures à 10% du nombre de cellules viables, en vérifiant la symétrie ou la résistance de la colonie , respectively. Sinon, les résultats peuvent être représentés au total CFU. Les comptages de cellules de contrôle et des colonies de biofilm non traitées doivent rester dans le même ordre de grandeur. En revanche, le nombre de cellules de la moitié de l'éthanol-traitée d'une petite colonie biofilm molécule traités devraient baisser par un minimum de deux ordres de grandeur à la revendication d'une sensibilité accrue à l'agent de stérilisation.
3. biofilm Colony Préparation d'échantillons pour microscopie électronique à balayage
- Cultivez colonies biofilm comme décrit dans les étapes 1,1-1,7 et 1.12-1.14.
- Préparer un nouveau lot de 2% (v / v) de glutaraldéhyde, 3% (v / v) d'une solution de paraformaldehyde dans du cacodylate de sodium 100 mM, un tampon de chlorure de calcium 5 mM, pH 7,3. Préparer 5 ml de fixateur pour chaque boîte de Pétri de 8,5 cm de diamètre.
ATTENTION: Glutaraldéhyde et paraformaldéhyde sont dangereux. Manipulez-les avec l'équipement de sécurité à l'intérieur d'une hotte chimique. Jeter les solutions et les matériaux contaminés à l'hazdéchets ardous. - Ajouter délicatement le fixateur dans les colonies de biofilms, sans distribuer directement sur les biofilms.
NOTE: En raison du caractère hydrophobe de la colonie du biofilm, les colonies se détachent lentement de l'agar-agar et commencent à flotter. - Sceller soigneusement les plaques avec une bande de Parafilm. Incuber sur un agitateur rotatif pendant 2 heures à température ambiante, et transférer ensuite les plaques à 4 ° C pendant une nuit.
- Le lendemain, retirez avec précaution le liquide avec une pipette en verre Pasteur relié à une pompe à vide.
- ajouter avec précaution 10 ml de 100 mM de cacodylate de sodium, tampon de chlorure de calcium 5 mM à laver le biofilm et laisser incuber pendant 5 min. Retirez délicatement le liquide avec la pipette en verre Pasteur du coin de la plaque pour éviter d'endommager le biofilm et ajouter la solution de lavage frais par pipetage doux. Répétez cette étape une fois.
- Pour la déshydratation des colonies de biofilms, procéder aux étapes suivantes: 2x 5 min dans ddH 2 O; 2x 20 min à 3d'éthanol de 0%; 2 x 20 minutes dans 50% d'éthanol; 2 x 20 minutes dans 70% d'éthanol; 2 x 20 min dans 96% d'éthanol; 2x 30 min à 100% d'éthanol.
- Ajouter 15 ml de liquide pour chaque boîte de Pétri de 8,5 cm de diamètre dans chaque étape et enlever le liquide soigneusement après chaque incubation.
- Utilisez l'une des deux méthodes différentes pour sécher les échantillons à partir d'éthanol.
- Pour séchage à l'air à partir d'éthanol:
- Coupez un papier filtre de cellulose (diamètre de 9 cm) en quarts. immergez brièvement un quart dans 100% d'éthanol, puis transférer soigneusement une colonie flottante biofilm sur elle. Placez le papier filtre humide dans une boîte de Pétri garni d'un papier filtre. Couvrir la boîte de Pétri et laisser les colonies de biofilms sécher pendant la nuit dans une hotte chimique.
- Pour le point critique (CP) -Séchage en utilisant du dioxyde de carbone (CO 2) comme fluide de transition:
- Remplir 75% de la chambre de la machine de séchage au point critique avec 100% d'éthanol. Transférer les échantillons dans un support, chaque échantillon dans son propre chambre. Si nécessaire, couper le biofilm avec des ciseaux en petits morceaux. Laissez les échantillons immergés dans de l'éthanol pendant toute la manipulation. Ensuite, transférer le support dans la chambre et fermer la chambre hermétiquement.
- Refroidir la chambre à 7 ° C et commencer l'agitation. Remplir la chambre complètement avec CO 2 liquide. Au cours d' une période d'incubation de 7 minutes, laisser le mélange d'éthanol avec du CO 2. Ensuite, décharger 25% de la solution.
REMARQUE: Ne pas vider la chambre au-dessous du niveau de l'échantillon. - Répétez l'étape 3.8.2.2 quatre fois.
- Répétez l'étape 3.8.2.2 cinq fois avec un temps d'incubation de 5 minutes seulement. Enfin, l'éthanol doit être complètement remplacé par CO 2.
- Au cours de la dernière ronde, vide seulement 5% de la chambre. Éteignez l'agitation et le refroidissement. Commencer à chauffer la chambre à 42 ° C. A une température de 31,1 ° C et une pression de 73,9 bars, le CO 2 liquide atteint son point critique, l'état où le ph gazeuxase a la même densité que la phase liquide du solvant 27. Une fois que la température atteint 42 ° C, incuber pendant 10 min. À 42 ° C, le CO 2 dans la chambre existe en tant que gaz supercritique.
REMARQUE: vérifier en permanence la pression de la chambre. La pression ne doit pas dépasser 120 bar à 42 ° C. - Commencer à libérer lentement le gaz avec chauffage continu. Cela permet de maintenir les échantillons dans la phase de CO 2 gazeux et empêche la déformation de l'échantillon à travers la morphologie de la tension superficielle du liquide. Réglez le débitmètre à 5 L / h par un réglage fin de la valve doseuse contrôlant le débitmètre. Attendez que la toute la pression dans la chambre est libérée. Maintenant, ouvrez la chambre et retirer soigneusement les échantillons du support.
- Pour séchage à l'air à partir d'éthanol:
- Manteau d'un microscope électronique stub avec du ruban de carbone. Avec l'aide de pinces, transférer soigneusement les colonies de biofilm sur le moignon. Connectez chaque colonie à la souche en ajoutant un mince pont de la voiturebande bon, ce qui est crucial pour l'élimination de la charge sous le faisceau d'électrons. A ce stade, gérer les colonies de biofilms avec précaution car ils sont très fragiles. Conserver les échantillons dans un dessiccateur pendant au moins 24 heures ou jusqu'à ce que l'examen.
- Le jour de l'examen au microscope électronique à balayage, par pulvérisation cathodique enrober les colonies de biofilm pendant 2 min dans un angle de 60 ° dans un or-palladium par pulvérisation cathodique coucheuse. Répéter cette étape deux fois et faire tourner les échantillons de 120 ° entre les deux. A la fin, par pulvérisation enrober les échantillons une fois pendant 3 minutes à partir du haut. 20 nm, la couche mince d'or-palladium permet d'améliorer la conductivité et améliore le contraste de l'échantillon pour l'imagerie dans la MEB.
- Stocker les échantillons dans un dessiccateur afin d' éviter la réhydratation de l'échantillon 28 jusqu'à formation d' image avec un microscope électronique à balayage , 29,30.
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Representative Results
Le dosage de la pellicule est une méthode pour étudier les processus hautement réglementés et dynamiques de B. multicellularité subtilis. En outre, le dosage de la pellicule est adapté pour tester une gamme de conditions soit pré-démarrage ou des concentrations de petites molécules dans une plaque multiple à la culture cellulaire unique dans une expérience. Cependant, B. la formation pelliculaire subtilis est sensible aux conditions de pré-culture (par exemple, le milieu de croissance de la pré-culture et de sa phase de croissance), le rapport d'inoculation et l'élimination du milieu de pré-culture. Nous avons donc d'abord examinées pour une installation expérimentale qui nous a permis de reproduire pelliculaire inhibition par D-leucine. Nos résultats montrent que reproductible pelliculaire d'inhibition par le D-leucine peut être obtenu si les cellules sont pré-cultivées dans indéfini milieu LB riche en une phase de croissance mi-logarithmique (une seule colonie dans 3 ml de LB à 37 ° C pendant 4 heures tout en agitant ), centrifugées et remises en suspension dans un milieu défini MSgg avant d'un mélange 1: 1 000 inoculation (figure 3A). Lorsque les cellules ont été cultivées dans du milieu MSgg au-logarithmique à mi phase de croissance (une seule colonie dans 1 ml de LB pendant 2 heures, re-dilué 1: 100 à 3 ml MSgg, et cultivées pendant 5 heures à 37 ° C sous agitation à 200 rpm), le retrait du milieu de pré-culture n'a pas eu d'effet sur l'activité de la D-leucine. Les cellules cultivées jusqu'à la phase de croissance stationnaire (colonie unique dans 1 ml de LB pendant 2 heures, re-dilué 1: 100 à 3 ml MSgg et cultivées pendant jusqu'à 20 heures dans un rouleau à la température ambiante) et lavées dans un milieu MSgg avant la inoculation étaient moins sensibles. Cependant, cette augmentation de la résistance à l'égard de l'effet d'inhibition de la pellicule de D-leucine peut être dû à la densité cellulaire plus élevée de la pré-culture, ce qui augmente le taux d'inoculation. Le rapport d'inoculation de la culture préalable à la croissance dans un milieu statique MSgg, à savoir 1: 500 ou 1: 1000, influencé la gamme d'activité de la D-leucine et la durée du développement pelliculaire (figure 3B). Pellicle inhibition par D-leucine a eu lieuà différentes températures de croissance (23 ° C et 30 ° C, figure 3C). Fait important, alors que la sensibilité des cellules à la D-leucine est fonction des conditions de pré-culture, la reproductibilité des phénomènes à différentes températures, montre que l'inhibition pelliculaire par la petite molécule de D-leucine a des caractéristiques robustes.
. Figure 3. Exemples de résultats qui montrent les effets de diverses conditions de pré-culture sur pellicule inhibition par D-leucine Plusieurs paramètres doivent être évalués pour obtenir une configuration expérimentale robuste, y compris: (A) l' élimination des contaminants de la croissance pré-culture moyen (non lavé par rapport lavé), moyenne de la pré-culture de croissance (, milieu LB undefined riche ou défini biofilm induisant moyen MSgg), et de l'état de la pré-culture de croissance (logarithmique contre phase stationnaire de croissance), (B) Taux d'inoculation (1: 1000 par rapport à 1: 500) de la pré-culture dans le milieu final de croissance pelliculaire, et (C) la température de croissance (23 ° C contre 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 cellules ont été cultivées dans le milieu indiqué (LB ou MSgg) pendant 4 heures à 37 ° C ou à la température ambiante pendant la nuit (o / n) avec agitation, et milieu de pré-culture a été remplacé par MSgg si indiqué (lavés ou non lavés). Enfin, la culture starter a été inoculé 1: 1000 sauf indication contraire et les pellicules ont été cultivées dans des conditions statiques à 23 ° C pendant trois jours. photographies descendantes ont été acquises avec une caméra. Eh bien le diamètre est de 22 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Après l'identification des conditions de pré-culture et un dispositif expérimental qui a permis une gamme d'activité reproductible de D-leucine sur la formation pelliculaire (pré-culture cultivée dans du milieu LB à une phase de croissance mi-logarithmique, lavées dans MSgg, dilué à 1: 1000 et cultivées à 23 ° C pendant trois jours), l'effet a été testé pour sa robustesse. A cet effet, l'activité de la D-leucine sur la formation pelliculaire a été évaluée dans divers milieux MSgg modifiée (figure 4). La plage d'activité de la D-leucine dans l'inhibition de la pellicule était constante dans les cinq milieux testés, et montre que l'effet du D-leucine sur la formation de la pellicule est robuste. Une tendance similaire a été observée avec la D-tyrosine, où l'inhibition de la pellicule dans la gamme de concentration allant jusqu'à 2 pm était cohérente dans plusieurs milieux modifiés MSgg (concentration en fer inférieure et le remplacement de la source d'azote avec du chlorure d'ammonium ou la source de carbone avec du glucose, des données non représenté).
La sensibilité à la figure 4. D-leucine se produit dansdivers milieux de croissance. Montré sont des photographies de haut en bas de B. subtilis NCIB 3610 pellicules, cultivées dans des conditions statiques à 23 ° C dans un sens, le milieu MSgg biofilm induisant ou dans différents milieux MSgg modifié (source de carbone , 0,5% de glucose, une source d'azote 0,5% de (NH 4) 2 SO 4; teneur élevée en fer de 250 pM FeCl 3, faible glycérol 0,125% de glycerol) pendant trois jours, sauf pour le moyen de source d'azote alternatif (où les pellicules ont été cultivées pendant cinq jours) , soit sans soit avec la D-leucine , à des concentrations indiquées. Cultures de départ ont été cultivées pendant 4 heures à 37 ° C avec agitation dans undefined, milieu riche LB. Avant l'inoculation, les cellules ont été lavées par centrifugation et remises en suspension dans le milieu de croissance de la pellicule correspondante. La culture de départ a été dilué à 1: 1000, le diamètre du puits est de 22 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Une autre méthode consiste à étudier B. subtilis multicellularité est le biofilm colonie essai sur un milieu de MSgg solide. Comme pellicules, ce test permet l'étude des processus spatio-temporels. Une fois que la plage active d'inhibiteurs de petites molécules est déterminé dans le système pelliculaire, leur effet sur la formation de biofilm de colonies peut être étudiée. Dans cette étude, les colonies biofilm ont été utilisés pour évaluer l'effet du D-leucine sur la résistance des colonies biofilm à des agents stérilisants, parce que les colonies de biofilms sont moins fragiles et sur le fond solide, ils sont plus faciles à manipuler. Lorsque les colonies de biofilms traitées avec la D-leucine sont exposés à 50% d' éthanol pendant 10 min, le pourcentage de cellules survivantes diminue considérablement par rapport à la fraction non traitée (figure 5). Cette méthode peut être développée pour évaluer les effets d'autres inhibiteurs de petites molécules et de leur effet sur la résistance aux agents bactéricides (sterilagents ou des antibiotiques izing).
Figure 5. Exemple de résultats de résistance biofilm colonie non traitées ou traitées contre un agent stérilisant. Colonies biofilms de B. subtilis NCIB 3610 ont été cultivées sur des bases solides, un milieu défini pour 68 heures à 30 ° C, avec ou sans mM D-leucine 0,5. Après avoir coupé les colonies en deux moitiés égales, une moitié a été traitée avec du PBS (témoin interne) et l'autre moitié avec 50% d'éthanol ou du PBS (contrôle). Après sonication douce, la dilution en série, le placage et le comptage des unités formant des colonies, le pourcentage des survivants par rapport au contrôle interne a été calculé. Sont représentés les résultats de trois expériences indépendantes avec les moyennes de deux (A) ou trois (B, C) se réplique et leurs écarts - types. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.
La microscopie électronique à balayage (MEB) est un outil puissant qui peut être utilisé pour se concentrer sur l'architecture spatiale des rides biofilm des colonies, l'abondance et la localisation des EPS et de la morphologie de la cellule unique 31. l'imagerie SEM nécessite des échantillons qui peut être imagée sous vide poussé. Pour étudier des échantillons dans des conditions de vide élevé, toutes les molécules d'eau en vrac doivent être enlevés, et par conséquent, l'imagerie SEM nécessite la déshydratation de l'échantillon avant l'imagerie. En variante, les échantillons peuvent être imagés dans des conditions de faible dépression dans le mode par voie humide par microscopie électronique à balayage environnemental (ESEM), où l'échantillon hydraté est séché doucement dans la chambre de microscope. Pour évaluer les effets des inhibiteurs de petites molécules sur l'architecture biofilm de la colonie, l'organisation des EPS et la morphologie des cellules, trois types d'échantillons déshydratation différents ont été comparés: le séchage au microscope sous mo humidede conditions (ESEM), séché à l'air d'un point (CP) solvant ou critique -séchée en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition. Dans non traitée et la D-leucine traité B. subtilis colonies de biofilms différentes des étapes d'hydratation selon la méthode utilisée pourraient être observées. Imaging dans des conditions de faible dépression dans le mode humide par ESEM conservé l'état très naturel de la colonie de biofilm. Cependant, des informations sur la morphologie cellulaire unique et de l'abondance des EPS et de l'architecture était rare, que les EPS étaient encore complètement hydraté et les cellules ont été intégrés dans les EPS (données non présentées). En termes de déshydratation, CP-séchage est la procédure la plus stricte. Il a éliminé plus structurellement des molécules d'eau liées ou en vrac à partir du tissu, ce qui représente une perte de 30 à 70% en volume, en fonction du tissu 32. En revanche, l'air de séchage a conservé les molécules d'eau liées. Un tissu embryonnaire par exemple perdu 18% de son volume après séchage à l' air de l'éthanol solvant volatil et 59% après CP-séchage 32 (figure 6A) . Colonies biofilm qui ont été déshydratés avec de l' éthanol et CP-séchées également conservé leur structure tridimensionnelle et les EPS sont apparus comme une toile d'araignée (Figure 6C). Dans les échantillons séchés à l'air et CP-séchés, les effets de l'inhibiteur à petites molécules de D-leucine , de l'architecture du biofilm de colonies, la structure de la morphologie cellulaire et le BPA unique étaient apparentes (figure 6B et D). Les colonies de biofilms cultivés en présence de D-leucine étaient plus petites et les rides sont moins prononcées. Les cellules D-leucine ont été traitées de forme allongée, un phénotype qui est observed dans les cellules traitées avec des molécules ciblant la paroi cellulaire 33. En outre, les cellules ont été nettement moins couverts avec les EPS et non étroitement liés à leurs cellules voisines via les EPS comme on le voit dans les colonies de biofilms non traitées. Les résultats présentés montrent que les procédés de biofilm colonie déshydratation, séché à l'air à partir d'éthanol ou CP-séchées en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition donnent des indications précieuses sur l'effet de petites molécules sur la morphologie cellulaire unique, ainsi que sur l'abondance EPS et de l'architecture.
Figure 6. Les petites molécules peuvent changer la grande et petite échelle de l'architecture biofilm de la colonie. Colonies biofilms de B. subtilis NCIB 3610 adulte (A et D) en absence ou (B et D) en présence de mM D-leucine 0,5 pendant 72 heures à 30 ° Csur un milieu solide MSgg ont une fixation tel que décrit dans le protocole et séché dans de l' éthanol de la manière suivante: (A et B) et séché à l' air (C et D) CP séché en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition. Montré sont de haut en bas des images binoculaires des colonies de biofilms (gauche, panneaux supérieurs), de haut en bas des photographies des colonies de biofilms séchées monté sur électrons moignons de microscopie avant or-palladium-revêtement (gauche, panneaux inférieurs), à faible et à fort grossissement images acquises par SEM pour montrer l'architecture 3D des rides biofilm des colonies ou le / EPS seule organisation de la morphologie des cellules. Les barres d'échelle de gauche à droite:. 5 mm, 100 pm, 2 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 1.925 mM | potassium dihydrogénophosphate |
| 3.075 mM | de phosphate de potassium dibasique |
| 100 mM | 3- (N - morpholino) propanesulfonique acide, à pH 7,1 |
| 2 mM | chlorure de magnésium hexahydraté |
| 700 pM | chlorure de calcium anhydre |
| 50 uM d' un | fer (III) hexahydraté |
| 125 uM b | |
| 1 pm | le chlorure de zinc anhydre |
| 2 pm | le chlorhydrate de thiamine |
| 50 pg / ml | tryptophane |
| 50 pg / ml | phénylalanine |
| 50 pg / ml | thréonine |
| 0,5% (v / v) | glycérol anhydre |
| 0,5% (p / v) | les sels monosodiques d'acide L-glutamique hydrate |
| un pour le dosage de la pellicule, b pour le dosage d' un biofilm | |
Tableau 1. Composition finale 1x MSgg utilisée dans cette étude.
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Discussion
Biofilms de Bacillus subtilis formes robustes et très structurés dans les deux liquides (pellicules) et sur un milieu solide (colonies). Par conséquent, il sert d'organisme modèle idéal pour caractériser le mode d'action des inhibiteurs de biofilm spécifiques. Sur un support solide, les cellules forment une structure multicellulaire présentant des caractéristiques distinctives qui ne sont pas évidents dans des pellicules, telles que les rides rayonnant à partir du centre vers le bord. Ainsi, les pellicules et les colonies sont des systèmes complémentaires pour étudier B. multicellularité subtilis.
Le but de cette étude est de développer un B. subtilis système modèle pour biofilm (pellicules et des colonies) d' inhibition. Plusieurs étapes sont essentielles pour la reproductibilité de l'essai biofilm de perturbation. Une première étape critique est de confirmer que l'effet sur la formation de biofilm est pas due à une toxicité générale à des bactéries cultivées dans le mode de vie planctonique. Ceci peut être considéré en comparant l'effet d'une concentration donnée en tant queun inhibiteur de molécule centre sur le biofilm inhibition par rapport à l'effet de cette molécule sur la croissance planctonique. Un effet considérablement plus fort sur le développement du biofilm peut assurer l'identification des mécanismes de cibles qui sont particulièrement importantes pour le développement de biofilms. En outre, l'étude décrite ici démontre l'importance des conditions de pré-culture pour le développement de pellicules et de leur sensibilité à de petites molécules. Avant de caractériser l'effet de petites molécules, des conditions expérimentales reproductibles et robustes (par exemple, la température de croissance de la pellicule et le manque de sensibilité à la composition des médias) pour tester leurs effets devraient être définis. Pour trouver de telles conditions, les médias de l'état pré-culture, de la phase des médias pré-culture, pré-culture enlèvement de médias, la température de croissance et de croissance la croissance devrait être envisagée.
Un défi majeur, une fois un inhibiteur spécifique pour la formation de biofilm se trouve, est de trouver quantitativeet des méthodes qualitatives qui caractérisent les effets de ces inhibiteurs de petites molécules sur le développement d'un biofilm et la résistance. Ici, deux méthodes importantes sont décrites en détail qui peuvent être utilisés pour évaluer les effets de ces inhibiteurs. Tout d'abord, nous introduisons une méthode quantitative simple qui peut sonder de manière reproductible la résistance des traités contre les biofilms des colonies non traitées à bactéricides, tels que l'éthanol. Des résultats représentatifs sont illustrés pour la sensibilité des colonies de biofilms D-leucine-traitée à 50% d'éthanol. Cependant, cet essai peut être facilement modifié en utilisant différents agents stérilisants ou des antibiotiques. Deuxièmement, une méthode SEM est décrite en détail qui permet à haute résolution examen des changements dans la colonie de biofilm causée par l'inhibiteur de petite molécule dans plusieurs niveaux complémentaires: la structure globale, l'organisation et l'abondance de la matrice des EPS et de ses composants, et la morphologies unicellulaires à travers le biofilm. Nous notons que les deux méthodes de dehydratile (séchage à l'air de 100% d'éthanol ou CP-séchage en utilisant du dioxyde de carbone comme fluide de transition) peut également être utilisé lors de la préparation de l'échantillon au MEB d'une colonie du biofilm. Surtout la fixation réussie de l'échantillon de film biologique repose en grande partie sur le caractère hydrophobe de la colonie du biofilm. Cette hydrophobie est une caractéristique intrinsèque de B. biofilms subtilis due à la couche de surface hydrophobe 10,34.
Plusieurs approches ont été utilisées précédemment pour étudier l' assemblage et le développement biofilm avec B. subtilis comme organisme modèle 35. Un certain nombre d'études indépendantes ont démontré les effets de la composition des médias sur le développement du biofilm 36-38. Jusqu'à présent, cependant, une évaluation systématique des effets de la composition des médias sur l'inhibition de biofilm était, au mieux de notre connaissance, manque. Cette étude démontre que tandis que l' inhibition de la pellicule de B. subtilis par de petites molécules est sensible aux conditions de culture pré, il est unaffected par les effets de la température et de la composition des milieux, et donc utile pour les écrans systématiques des inhibiteurs de petites molécules. En outre, nous avons établi une méthode simple, reproductible et quantitative pour évaluer la résistance des molécules non traitées ou petites colonies de biofilms inhibiteur traité à des agents antibactériens, qui fait actuellement défaut dans le modèle de biofilm organisme B. subtilis.
B. biofilms subtilis en combinaison avec des journalistes fluorescentes peuvent être prises à la suite de rechercher des inhibiteurs de petites molécules qui ciblent soit une étape spécifique du développement de la formation de biofilm ou d' une sous-population spécifique de cellules dans le biofilm. Les procédés décrits ici ne fournissent pas la résolution de la cellule unique en termes d'expression de gènes au sein du biofilm. Méthodes d'analyse de l' expression du gène EPS matrice au sein de B. biofilms subtilis au niveau de la cellule unique ont été établis avec succès 39.
Les biofilms bactériens sont de Crucial 'importance dans les milieux agricoles, industriels et cliniques. Dans un contexte agricole, la capacité à former des biofilms augmente la colonisation de la plante hôte de nombreux agents pathogènes des plantes 40, et dans un contexte clinique, les biofilms sont intrinsèquement résistants aux agents antimicrobiens 21 et sont au cœur de nombreuses infections bactériennes persistantes et chroniques. En outre, il est maintenant reconnu que les biofilms ont d' énormes répercussions sur les coûts pour l' industrie car ils sont extrêmement difficiles à éliminer et contrôler 41. Ainsi, l' élaboration d' un cadre expérimental pour l'étude des inhibiteurs de biofilms microbiens fournira d' importants agricoles 42,43, 21,44 cliniques et technologiques 45-47 progrès.
Les méthodes actuelles sont limitées à B. subtilis. Nous encourageons en suivant les concepts quantitatifs et qualitatifs décrits pour étudier les inhibiteurs de petites molécules spécifiques biofilm dans d'autres espèces. en outre , Cette étude se rapporte à un exemple spécifique pour biofilm inhibition par D-leucine, de plusieurs inhibiteurs de biofilm spécifique publié précédemment 17. Surtout, D-leucine était déjà caractérisée comme une molécule anti-biofilm dans le pathogène végétal Xanthomonas citri 48, présentant des similitudes possibles entre la colonisation des plantes et la formation de biofilm. La formation du biofilm (pelliculaire et la formation de colonies rugose) est également fréquente chez les agents pathogènes humains (par exemple, Pseudomonas aeruginosa 49-51 et Escherichia coli uropathogènes 52,53). Les méthodes décrites peuvent être développés à la recherche de médicaments spécifiques qui inhibent la formation de biofilm et réduisent la résistance du biofilm médiée aux agents antimicrobiens dans la recherche clinique. Dans l'ensemble, les méthodes décrites ici peuvent être utilisées comme base pour développer des concepts quantitatifs et qualitatifs pour étudier les inhibiteurs de petites molécules spécifiques biofilm dans d'autres espèces.
nt "> En résumé, nous fournissons une boîte à outil simple et utile qui démontre les forces et les pièges potentiels dans l' utilisation de B. subtilis pour étudier les inhibiteurs de biofilm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
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