Introduction
comunità batteriche multi-cellulari giocano un ruolo significativo in ambienti naturali e antropici, e può essere utile o altamente deleterio. Queste colonie multicellulari sono noti come biofilm, in cui le singole celle sono incorporate in una matrice sostanze polimeriche extracellulari autoprodotti (EPS). L'EPS aderiscono fortemente le cellule alla superficie colonizzano. Essi servono come scudo contro le forze meccaniche e chimiche e creano stretto contatto tra cellule vicine, facilitando comunicazione cellulare 1. Un biofilm può essere visto come una comunità differenziate, in cui le cellule uso altamente regolati, orchestrato processi per coordinare le loro attività all'interno della comunità, così come tra le specie 2-5. Il passaggio da un planctoniche, modalità di vita libera di crescita a uno stato biofilm è spesso associata a processi di sviluppo. Un buon esempio è il Bacillus subtilis batterio del suolo Gram-positivi, e quindi un undómëceppo sticated serve come un modello robusto organismo per studiare le fasi di sviluppo che portano alla formazione di biofilm. In questo batterio, cellule mobili si organizzano in strutture multicellulari cospicui che svolgono mansioni specializzate 4. Un gruppo di cellule, la matrice-produttori secernono esopolisaccaridi 6, la proteina amiloide ATAS 7,8, e la proteina di superficie hydrophobicity BSLA 9,10; ognuno dei quali partecipare all'Assemblea degli EPS 11-13.
Data l'abbondanza di biofilm in nicchie naturali e antropici e il danno fatale putativo possono causare, vi è un urgente bisogno di trovare modi per prevenire la loro formazione. Gli inibitori di piccole molecole in grado di aiutare nella scoperta di nuovi percorsi normativi, enzimi e proteine strutturali coinvolte nella formazione di biofilm, e, quindi, di promuovere approfondimenti nei complessi processi di assemblaggio comunità multicellulare. Come B. subtilis è un modello ben studiato per la biofilmazione 14,15, può essere utilizzato per valutare gli effetti di vari inibitori biofilm. Questo studio affronta quattro metodi fondamentali che sono fondamentali per la valutazione della risposta dei biofilm a piccole molecole inibitrici. Innanzitutto, per garantire che questi inibitori hanno un obiettivo specifico biofilm, la separazione degli effetti sulla crescita planctonici dall'effetto sulla formazione del biofilm è critica. La maggior parte degli agenti antibatterici colpire le cellule nella loro fase di crescita planctonici, ma le molecole che hanno come target lo stile di vita biofilm sono rari. Inoltre, come le molecole che non influenzano la crescita planctonici non sono tossici, possono ridurre la pressione selettiva che favorisce i mutanti resistenti agli antibiotici 16. Per esempio, quando biofilm sono trattati con D-amminoacidi o alcune altre molecole parete cellulare interferente, o sono disturbati o smontati, ma questi inibitori riguardano solo lievemente planktonic 12,17 crescita. Al contrario, molti antibiotici alterano drammaticamente la crescita planctonici, con little o nessun effetto sulla formazione di biofilm 17.
In secondo luogo, che stabilisce un quadro sperimentale consistente e robusto per studiare l'effetto delle piccole molecole è fondamentale. Abbiamo osservato che l'intervallo di concentrazione attiva delle piccole molecole inibitrici era sensibile alle condizioni pre-coltura e alla configurazione sperimentale utilizzato per studiare l'effetto di queste piccole molecole inibitrici. Diversi rapporti, in particolare quelli che studiano B. subtilis, rivelato variazioni nell'intervallo di concentrazione in cui D-amminoacidi inibiscono la formazione di pellicole - i galleggianti biofilm batterici 12,17-19. I risultati qui presentati indicano che i seguenti fattori rappresentano differenze nella gamma di concentrazione attiva: le condizioni di pre-coltura (logaritmica 12,17 contro fase tardo-stazionaria 20 di crescita), il terreno di coltura utilizzato nella condizione di pre-cultura (ricco, indefinita [Luria Broth, LB] contro definito [glutammato monosodico-glycerol, MSgg]), il rapporto di inoculazione e soprattutto la rimozione del mezzo di precoltura prima dell'inoculo. La temperatura di crescita pellicola statica mostrato un ruolo meno importante nella gamma attività della piccola molecola inibitore D-leucina, acido rappresentante D-amino utilizzato in questo studio.
Infine, una volta che i biofilm sono trattati con inibitori biofilm specifici, metodi robusti e informativi sono necessari per caratterizzare gli effetti di questi inibitori sui biofilm fitness. Qui, due metodi per caratterizzare in modo indipendente l'effetto di piccole molecole inibitrici sono descritte in dettaglio: (1) L'effetto sulla singole celle all'interno di una colonia di biofilm e la loro resistenza agli agenti antimicrobici. Le cellule in biofilm sono in genere più resistenti agli antibiotici rispetto ai batteri a vita libera 21-23. Mentre questo fenomeno è multifattoriale, la capacità dell'EPS per ridurre la penetrazione antibiotico è spesso considerata come una spiegazione attraente 24
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Protocol
1. valutare l'effetto di piccole molecole inibitori sulla Pellicle e la formazione di biofilm Colony
- Preparare una soluzione di 2x definito medio MSgg biofilm che inducono 25 senza il cloruro di calcio e ferro (III) cloruro esaidrato. Dopo la sterilizzazione del filtro, aggiungere il cloruro di calcio. Il mezzo è pronto all'uso direttamente oppure può essere conservato a 4 ° C al buio.
- Preparare la diluizione 1x MSgg il giorno dell'esperimento.
- Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicole) o agar sterile 3% calda (80 ° C) (biofilm) e aggiungere ferro (III) cloruro esaidrato ad una concentrazione finale di 50 pM (pellicole) o 250 pM ( biofilm). Aggiungere antibiotici o piccole molecole inibitrici alla concentrazione desiderata e mescolare bene. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM D-leucina in 30 ml di stabilire pellicole o biofilm, aggiungere 196,6 ml di un 76,3 mM (10 mg / ml) di soluzione D-leucina.
NOTE:. La composizione finale 1x MSgg sono descritte nella Tabella 1 Rispetto alla ricetta originale 25, il mezzo conteneva 50 ug / ml treonina e la concentrazione di ferro per crescere colonie biofilm su terreno solido MSgg stato aumentato 2.5x per ottimizzare la morfologia delle colonie rugosa .
- Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicole) o agar sterile 3% calda (80 ° C) (biofilm) e aggiungere ferro (III) cloruro esaidrato ad una concentrazione finale di 50 pM (pellicole) o 250 pM ( biofilm). Aggiungere antibiotici o piccole molecole inibitrici alla concentrazione desiderata e mescolare bene. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM D-leucina in 30 ml di stabilire pellicole o biofilm, aggiungere 196,6 ml di un 76,3 mM (10 mg / ml) di soluzione D-leucina.
- Dopo la solidificazione del agar, asciugare le piastre MSgg solidi in una cappa biologica per 30-45 minuti prima della inoculazione.
- Per selezionare inibitori specifici che interferiscono con i meccanismi di formazione pellicola (figura 1), esclude che le concentrazioni utilizzate influenzano planctonici e crescita statica.
- Determinare crescita planktonic (aumento della densità ottica nel tempo in coltura liquida) in una curva di crescita semplice misurando la densità ottica a 600 nm ogni ora fino alla fase di crescita stazionaria.
- Per confermare che la torbidità cultura misurata rappresenta conta di cellule vive, determinare il numero di unità formanti colonia (CFU)di cellule in fase di crescita planctonici da una coltura agitando dopo diversi punti temporali.
- Per valutare l'effetto di piccole molecole inibitrici sulla crescita pellicola statica, cellule raccolto alla fine di una incubazione di 3 giorni a 23 ° C da 24 pozzetti coltura cellulare e, inoculato nelle stesse condizioni come descritto nelle sezioni 1,7-1,9 e determinare la CFU. Per questo controllo, utilizzare un ceppo pellicola con deficit che manca i operoni che codificano per i componenti della matrice extracellulare (vale a dire, B. subtilis Δ epsH, Δ TASA).
NOTA: Questo ceppo è in grado di crescere in condizioni statiche, ma a differenza di un ceppo selvatico pellicle-formatura, è carente nella capacità di galleggiare all'interfaccia liquido-aria, la cui crescita è favorita a causa di un aumento dei livelli di ossigeno 26. Così, questo da matrice extracellulare e la tensione pellicola-carente è un ceppo di riferimento consigliato per valutare la crescita in condizioni statiche.
NOTA: Per la specifica exampio del non canonica D-amino acido D-leucina descritte di seguito, un effetto sulla planctonici e la crescita statica a concentrazioni che interferivano con la formazione di pellicola è stato escluso 12,17. I metodi per determinare planctonici e crescita statica sono descritte in dettaglio 17.
Figura 1. panoramica concettuale per l'identificazione di un robusto apparato sperimentale per valutare l'inibizione specifica della formazione di biofilm. I criteri di selezione per le piccole molecole inibitrici che indicano l'interferenza specifico con la formazione di biofilm, senza effetto pronunciato sulla crescita planctonici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Streak fuori B. subtilis da un C magazzino -80 ° (LB culture di 10 9 cellule / ml congelati in glicerolo al 20%) per isolare singole colonie su una piastra di agar-% 1,5 LB con una punta sterile o un bastoncino applicatore.
- Crescere notte a 30 ° C.
- PUNTO CRITICO: Per una robusta inibizione pellicola dagli acidi non canonica D-amino come D-leucina, crescere una singola colonia prelevata dal% piastra di agar-1.5 LB in 3 ml brodo LB a 37 ° C per 4 ore in un agitazione incubatore (velocità di agitazione 200 rpm). Sostituire il brodo LB con il mezzo MSgg biofilm che inducono prima inoculazione mediante centrifugazione cultura 1,5 ml di avviamento per 4 min a 6.000 xg, rimuovere con attenzione il surnatante e ri-sospensione il pellet in 1,5 ml di mezzo MSgg. Il resto della coltura può essere scartato.
Importante: Per garantire la robustezza del sistema, la densità ottica a 600 nm (OD 600) della coltura starter lavato dovrebbe essere compreso tra 0,6 e 1. - Durante la crescita della coltura starter, preparare un 12-pozzetti di coltura cellulare plate multidish contenentg 3 ml di terreno MSgg senza o con un intervallo di concentrazione della piccola molecola inibitore (ad esempio, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Per escludere effetti di bordo, distribuire la collocazione delle diverse concentrazioni di tutta la piastra multidish. In alternativa, utilizzare 24 pozzetti coltura cellulare piastre multidish contenente 1,5 ml di terreno MSgg.
- Inoculare pozzetti della coltura cellulare piastra multidish 12 pozzetti con 3 ml di coltura starter lavato (1: 1.000 diluizione).
NOTA: Un rapporto di diluizione inferiore, cioè, 1: 500 può essere utilizzato. Questo riduce il tempo di sviluppo delle pellicole. - Grow le pellicole a 23 ° C in condizioni statiche per tre giorni. Non spostare le pellicole durante questo tempo, in quanto può influenzare la morfologia superficiale finale della pellicola.
- Acquisire le immagini con un'esposizione binoculare e omogeneo di fulmini. In alternativa, fare una foto delle pellicole con una fotocamera ad alta risoluzione. Per evitare artefatti causati da inconsisangoli di luce tenda e ombre, scattare foto top-down con la telecamera fissa su un treppiede e utilizzare una fonte di luce morbida e grande a 45 ° da entrambi i lati.
NOTA: Un metodo alternativo per studiare B. subtilis pluricellularità è il saggio colonia di biofilm su, terreno solido biofilm che inducono MSgg. Come pellicole, questo test permette lo studio dei processi spazio-temporali. Una volta che la gamma attiva delle piccole molecole inibitrici è determinata, il loro effetto sulla formazione di biofilm colonia può essere studiato. - Per crescere colonie biofilm, simmetricamente individuare 1,5 ml di non lavato precoltura (Passo 1.7) sul MSgg 1,5% agar essiccato con l'aiuto di un modello - 4 gocce per Petri di 8,5 cm di diametro. Lasciate che le gocce adsorbono alla piastra prima di muoversi.
NOTA: Il modello consente di ottenere una distribuzione uniforme delle colonie biofilm all'interno della zona dove si coltivano le cellule. Per preparare il modello, disegnare l'area totale della crescita su scale originali, dividerlo alla parità di settaors e marcare il centro. Per un giro Petri di 8,5 cm di diametro, questo assegna 14 centimetri 2 di una colonia biofilm. - Incubare le piastre a 30 ° C per tre giorni. Durante questo tempo, colonie biofilm sviluppano e formano un tridimensionale, struttura rugosa.
- Scattare foto come al punto 1.11.
2. Etanolo Resistenza Assay
- Crescere biofilm come descritto ai punti 1,1-1,7 e 1.12-1.14.
- Dopo 68 h di crescita a 30 ° C, tagliare le colonie biofilm in due parti uguali con l'aiuto di una lama di rasoio e il modello.
Figura 2. Esempio disegno sperimentale per valutare la resistenza delle cellule biofilm colonie di agenti sterilizzanti. (A) Template utilizzato per la distribuzione uniforme delle colonie biofilm attraverso una piastra di Petri e per il taglio. (B)immagini top-down non trattati wild-type biofilm coltivate per 68 h su terreno solido, definito biofilm che inducono MSgg a 30 ° C. L'ingrandimento mostra come una colonia biofilm può essere tagliato in due metà uguali. (C) Le due metà uguali biofilm sono trattati allo stesso modo (il controllo, PBS) o sia con PBS o agente sterilizzante e trattati come descritto. Bar Scala:. 1 cm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Sollevare attentamente ciascuna metà della colonia biofilm dalla piastra di agar con una piccola spatola e spostarlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 500 ml di tampone fosfato salino (PBS). Se necessario, raschiare le cellule rimanenti dalla piastra e trasferirli provetta pure.
NOTA: La seconda metà della colonia biofilm viene trattato differentemente, a seconda che esso è il controllo o per testare la resistenza alla steriAgenti Lizing. - Per il controllo, incubare la seconda metà della colonia biofilm in 500 microlitri di PBS come al punto 2.3. Per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti, trasferire la seconda metà della colonia biofilm a 500 microlitri 50% (v / v) etanolo.
NOTA: sterilizzazione alternativo agenti come ipoclorito di sodio possono essere usati. Per tutti gli agenti sterilizzanti utilizzati, determinare il tempo di concentrazione e incubazione attiva in un esperimento preliminare. - Incubare le colonie biofilm per 10 min sul banco a temperatura ambiente.
- Centrifugare le colonie biofilm per 5 min a 18.000 xg e rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta. Aggiungere 300 ml di PBS.
- Sonicare cellule leggermente (ampiezza 10%, impulso 5 sec) con lo micropunte di un sonicatore.
NOTA: L'energia sonicazione deve essere sufficiente ad aggregati biofilm separati. Tuttavia, troppo dura sonicazione può lisi delle cellule. Confermare in anticipo al microscopio ottico che l'energia sonicazioneutilizzati non lisare le cellule e che tutti gli aggregati sono dissolti. - Aggiungere 700 microlitri di PBS fino ad un volume finale di 1 ml. Eseguire una diluizione seriale (a 10 -7) in PBS e diffondere 100 ml di 3 diluizioni su una piastra di agar-% 1,5 LB utilizzando microsfere di vetro sterili.
NOTA: Le diluizioni ottimali per essere placcato dovrebbe essere determinata in un esperimento preliminare, in quanto dipende dalla quantità di cellule nella colonia biofilm di interesse e il tasso di sopravvivenza delle cellule in risposta all'agente sterilizzante. - Incubare le piastre notte a 30 ° C, contare il CFU e determinare CFU / ml. Dalla finale CFU / ml di ciascuna delle colonie mezzo biofilm, calcolare la percentuale di sopravvissuti.
NOTA: Quando eseguito e analizzato come descritto, le due metà della colonia di controllo biofilm e trattata contro etanolo trattata la metà della colonia biofilm greggia dovrebbe produrre differenze inferiori al 10% della conta delle cellule vitali, verificando la simmetria o la resistenza della colonia , faucibusctively. In alternativa, i risultati possono essere rappresentati in totale CFU. I conteggi di cellule di controllo e non trattato colonia biofilm dovrebbero rimanere nello stesso ordine di grandezza. Al contrario, i conteggi cellulari del mezzo etanolo trattata di una piccola molecola biofilm colonia trattati dovrebbero scendere da un minimo di due ordini di grandezza la rivendicazione per una maggiore sensibilità all'agente sterilizzante.
3. biofilm Colony Preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione
- Crescere colonie biofilm come descritto nei passaggi 1,1-1,7 e 1.12-1.14.
- Preparare una serie fresca di 2% (v / v) glutaraldeide, 3% (v / v) di paraformaldeide in 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone di cloruro di calcio, pH 7.3. Preparare 5 ml di fissativo per ogni capsula di Petri di 8,5 cm di diametro.
ATTENZIONE: glutaraldeide e paraformaldeide sono pericolosi. li maneggiare con dispositivi di sicurezza all'interno di una cappa chimica. Eliminare le soluzioni ed i materiali contaminati al hazrifiuti ardous. - Aggiungere con cautela il fissativo alle colonie biofilm, senza l'erogazione direttamente sulla parte superiore dei biofilm.
NOTA: A causa del carattere idrofobico della colonia biofilm, le colonie staccano lentamente dalla agar ed iniziano a galleggiare. - sigillare accuratamente le piastre con una striscia di Parafilm. Incubare su un agitatore rotante per 2 ore a temperatura ambiente e successivamente trasferire le piastre a 4 ° C per una notte.
- Il giorno successivo, rimuovere con cautela il liquido con una pipetta Pasteur di vetro collegato ad una pompa a vuoto.
- Aggiungere con cautela 10 ml 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone cloruro di calcio per lavare il biofilm e incubare per 5 min. Rimuovere delicatamente il liquido con la pipetta Pasteur di vetro da un angolo del piatto per evitare di danneggiare il biofilm e aggiungere la soluzione di lavaggio fresca delicatamente pipettando. Ripetere questa operazione una sola volta.
- Per la disidratazione delle colonie biofilm, procedere con le seguenti operazioni: 2 x 5 min in DDH 2 O; 2x 20 min a 30% di etanolo; 2x 20 min in etanolo al 50%; 2x 20 min in etanolo al 70%; 2x 20 min in etanolo al 96%; 2x 30 min a 100% di etanolo.
- Aggiungere 15 ml di liquido per ogni piatto Petri di 8,5 cm di diametro in ogni passo e rimuovere il liquido accuratamente dopo ogni incubazione.
- Utilizzare uno dei due metodi differenti per asciugare i campioni da etanolo.
- Per l'aria di essiccazione da etanolo:
- Tagliare un filtro di carta di cellulosa (diametro di 9 cm) in quarti. Brevemente immergere un quarto in 100% di etanolo, e poi trasferire con cura uno galleggiante biofilm colonia su di esso. Mettere la carta da filtro bagnata in una capsula di Petri foderato con carta da filtro. Coprire la piastra di Petri e lasciare che le colonie biofilm asciugare per una notte in una cappa chimica.
- Per punto critico (CP) -Essiccazione utilizzando anidride carbonica (CO 2) come fluido di transizione:
- Riempire il 75% della camera di critica macchina a punti di asciugatura con etanolo al 100%. Trasferire i campioni in un supporto, ogni campione nel proprio cHamber. Se necessario, tagliare il biofilm con le forbici in piccoli pezzi. Lasciare i campioni immersi in etanolo durante tutte le manipolazioni. Quindi, trasferire il supporto nella camera e chiudere la camera ermeticamente.
- Raffreddare la camera al 7 ° C e iniziare a mescolare. Riempire la camera completamente con CO 2 liquida. Nel corso di un periodo di incubazione 7 min, lasciare che la miscela di etanolo con la CO 2. Poi, scarico 25% della soluzione.
NOTA: Non svuotare la camera di sotto del livello del campione. - Ripetere il punto 3.8.2.2 quattro volte.
- Ripetere il punto 3.8.2.2 cinque volte con un tempo di incubazione di soli 5 min. Infine, l'etanolo dovrebbe essere completamente sostituita da CO 2.
- Durante l'ultimo giro, vuoto solo il 5% della camera. Spegnere l'agitazione e il raffreddamento. Avviare riscaldamento della camera a 42 ° C. Ad una temperatura di 31,1 ° C e una pressione di 73,9 bar, il liquido CO 2 raggiunge il suo punto critico, lo stato in cui il ph gassosaase ha la stessa densità della fase liquida del solvente 27. Quando la temperatura raggiunge 42 ° C, incubare per 10 min. A 42 ° C, la CO 2 nella camera esiste come gas supercritico.
NOTA: controllare costantemente la pressione della camera. La pressione non deve superare i 120 bar a 42 ° C. - Iniziare a rilasciare lentamente il gas con riscaldamento continuo. Ciò mantiene i campioni nella fase CO 2 -Gas e impedisce la deformazione della morfologia campione attraverso la tensione superficiale del liquido. Impostare il misuratore di portata a 5 l / h per la messa a punto la valvola di dosaggio che controlla il misuratore di portata. Attendere fino al rilascio del tutto la pressione nella camera. Ora aprire la camera e rimuovere i campioni con cautela dal supporto.
- Per l'aria di essiccazione da etanolo:
- Coat un microscopio elettronico a stub con nastro di carbonio. Con l'aiuto di pinzette, trasferire accuratamente le colonie biofilm sul stub. Collegare ogni colonia allo stub con l'aggiunta di un sottile ponte da autonastro bon, che è cruciale per l'eliminazione carica sotto il fascio di elettroni. In questa fase, gestire le colonie biofilm con cura in quanto sono molto fragili. Conservare i campioni in un essiccatore per almeno 24 ore o fino esame.
- Il giorno dell'esame con il microscopio elettronico a scansione, le colonie biofilm per 2 minuti per polverizzazione catodica-coat in un angolo di 60 ° in un oro-palladio polverizzazione-dispositivo a induzione. Ripetere questa operazione due volte e ruotare i campioni di 120 ° in mezzo. Alla fine, i campioni sputter-coat volta per 3 min dall'alto. Il sottile strato di 20 nm di oro-palladio migliora la conducibilità e migliora il contrasto del campione per l'imaging SEM.
- Conservare i campioni in un essiccatore per evitare la reidratazione del campione 28 fino l'imaging con un microscopio elettronico a scansione 29,30.
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Representative Results
Il saggio pellicle è un metodo per studiare i processi altamente regolamentati e dinamici di B. subtilis pluricellularità. Oltre a questo, il saggio pellicle è adatto per testare una serie di condizioni sia di pre-avviamento o concentrazioni molecola di piccole dimensioni in un piatto multidish singola cella-cultura in un esperimento. Tuttavia, B. subtilis formazione pellicle è sensibile alle condizioni pre-coltura (ad esempio, crescita media del pre-coltura e la sua fase di crescita), il rapporto di inoculazione e la rimozione del mezzo di precoltura. Abbiamo quindi prima a screening per un apparato sperimentale che ci ha permesso di riprodurre l'inibizione pellicola da D-leucina. I nostri risultati mostrano che l'inibizione pellicola riproducibile da D-leucina può essere ottenuta se le cellule sono pre-coltivate in indefinita, ricco terreno LB una fase di crescita medio logaritmica (singola colonia in 3 ml LB a 37 ° C per 4 ore con agitazione ), centrifugati e risospesi in mezzo MSgg definito prima di un 1: 1.000 inoculation (Figura 3A). Quando le cellule sono state coltivate in terreno MSgg alla metà logaritmica fase di crescita (singola colonia in 1 ml LB per 2 ore, ri-diluito 1: 100 a 3 ml MSgg, e coltivate per 5 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm), la rimozione del mezzo di precoltura non ha avuto effetto sull'attività D-leucina. Cellule coltivate per la fase di crescita stazionaria (singola colonia in 1 ml LB per 2 ore, ri-diluiti 1: 100 a 3 ml MSgg, e coltivate per fino a 20 ore in un rullo a temperatura ambiente) e lavati in mezzo MSgg prima inoculazione erano meno sensibili. Tuttavia, questo aumento della resistenza verso l'effetto di inibizione pellicola di D-leucina potrebbe essere dovuto alla maggiore densità cellulare di pre-coltura, aumentando il rapporto di inoculazione. Il rapporto inoculazione del pre-coltura per la crescita statica in mezzo MSgg, cioè, 1: 500 o 1: 1.000, influenzata la gamma di attività di D-leucina e il tempo di sviluppo pellicola (Figura 3B). l'inibizione Pellicle da D-leucina si è verificatoa temperature di crescita diverse (23 ° C e 30 ° C, figura 3C). È importante sottolineare che, mentre la sensibilità delle cellule di D-leucina dipende dalle condizioni di pre-coltura, la riproducibilità dei fenomeni a diverse temperature dimostra che l'inibizione pellicola dalla piccola molecola D-leucina ha caratteristiche robuste.
. Figura 3. Risultati dell'esempio che mostrano gli effetti delle diverse condizioni pre-coltura su inibizione pellicola da D-leucina Diversi parametri devono essere valutati per ottenere un robusto apparato sperimentale, tra cui: la rimozione (A) di contaminanti dalla crescita pre-cultura mezzo (non lavato rispetto lavato), crescita media del pre-coltura (ricca, medio definito LB o definiti biofilm che inducono medio MSgg), e stato di crescita della precoltura (logaritmico rispetto fase di crescita stazionaria), (B) Rapporto di inoculo (1: 1.000 contro 1: 500) del pre-coltura nel mezzo di crescita pellicle finale, e (C) temperatura di crescita (23 ° C rispetto a 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610 cellule sono state coltivate in mezzo indicato (LB o MSgg) per 4 ore a 37 ° C oa temperatura ambiente per tutta la notte (o / n) con agitazione, e medio pre-coltura è stato sostituito da MSgg se indicato (lavate o non-lavato). Infine, la coltura starter è stato inoculato 1: 1.000, se non diversamente indicato e pellicole sono state coltivate in condizioni statiche a 23 ° C per tre giorni. fotografie top-down sono state acquisite con una macchina fotografica. Bene diametro è di 22 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Dopo l'identificazione di condizioni pre-coltura e un apparato sperimentale che ha permesso per una serie di attività riproducibile di D-leucina sulla formazione pellicola (pre-coltura cresciuta in LB ad una fase di crescita medio logaritmico, lavati in MSgg, diluito 1: 1000 e cresciuto a 23 ° C per tre giorni), l'effetto è stato testato per la sua robustezza. A tal fine, l'attività di D-leucina sulla formazione pellicola è stata valutata in vari media MSgg modificato (Figura 4). La gamma di attività di D-leucina nell'inibizione pellicola era coerente nei cinque mezzi testati, e dimostra che l'effetto di D-leucina sulla formazione pellicle è robusto. Una tendenza simile è stata osservata con D-tirosina, in cui l'inibizione pellicle nella concentrazione gamma fino a 2 mM era coerente in diversi mezzi modificato MSgg (concentrazione di ferro inferiore e la sostituzione della fonte di azoto con cloruro di ammonio o fonte di carbonio con glucosio, dati non mostrato).
Figura 4. Sensibilità di D-leucina verifica invari mezzi di crescita. Vengono mostrati fotografie top-down di B. subtilis NCIB 3610 pellicole, cresciuti in condizioni statiche a 23 ° C in definito, medio MSgg biofilm che inducono o in diversi media MSgg modificato (fonte di carbonio 0,5% di glucosio; fonte di azoto 0,5% (NH 4) 2 SO 4; ferro alta 250 micron FeCl 3; partire glicerolo 0,125% glicerolo) per tre giorni, tranne per il mezzo fonte di azoto alternativa (dove le pellicole sono state coltivate per cinque giorni) sia con o senza D-leucina a concentrazioni indicate. colture starter sono state coltivate per 4 ore a 37 ° C con agitazione in indefinita, ricco terreno LB. Prima di inoculazione, le cellule sono state lavate per centrifugazione e risospese in mezzo di crescita pellicle corrispondente. La cultura antipasto era diluito 1: 1.000, il diametro pozzo è di 22 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un metodo alternativo per studiare B. subtilis pluricellularità è il saggio colonia di biofilm su terreno solido MSgg. Come pellicole, questo test permette lo studio dei processi spazio-temporali. Una volta che la gamma attiva delle piccole molecole inibitrici è determinato nel sistema pellicle, il loro effetto sulla formazione di biofilm colonia può essere studiato. In questo studio, colonie biofilm sono stati usati per valutare l'effetto di D-leucina sulla resistenza di colonie biofilm agli agenti sterilizzanti, perché colonie biofilm sono meno fragili e sullo sfondo solido, sono più facili da manipolare. Quando le colonie biofilm trattati con D-leucina sono esposti al 50% di etanolo per 10 min, la percentuale di cellule sopravvissute scende drasticamente rispetto alla frazione non trattato (figura 5). Questo metodo può essere ulteriormente sviluppato per valutare gli effetti di altri inibitori piccole molecole e il loro effetto sulla resistenza agli agenti battericidi (sterilagenti izing o antibiotici).
Figura 5. risultati esempio di non trattata o trattata resistenza biofilm colonia nei confronti di un agente sterilizzante. Colonie biofilm di B. subtilis NCIB 3610 sono stati coltivati su un solido, media definita per 68 ore a 30 ° C, con o senza 0,5 mM D-leucina. Dopo il taglio colonie in due metà uguali, una metà è stata trattata con PBS (controllo interno) e l'altra metà con il 50% di etanolo o PBS (controllo). Dopo sonicazione lieve, diluizioni seriali, placcatura e conteggio delle unità formanti colonia, la percentuale di sopravvissuti rispetto al controllo interno è stato calcolato. Vengono riportati i risultati di tre esperimenti indipendenti con le medie dei due (A) o tre (B, C) replica e loro deviazioni standard. Cliccate qui to vedere una versione più grande di questa figura.
Microscopia elettronica a scansione (SEM) è un potente strumento che può essere utilizzato per mettere a fuoco su architettura spaziale di rughe biofilm colonie, l'abbondanza e la localizzazione delle EPS e singola morfologia cellulare 31. immagini SEM richiede campioni che possono essere esposte sotto vuoto spinto. Per studiare i campioni in condizioni di alto vuoto, tutte le molecole d'acqua di massa devono essere rimossi e, quindi, l'imaging SEM richiede l'disidratazione del campione prima di imaging. In alternativa, i campioni possono essere esposte in condizioni di basso vuoto nella modalità bagnato dalla scansione ambientale microscopia elettronica (ESEM), dove il campione viene delicatamente idratato essiccato nella camera microscopio. Per valutare gli effetti di piccole molecole inibitrici sull'architettura biofilm colonia, l'EPS organizzazione e morfologia cellulare, tre differenti tipi di disidratazione campione sono stati confrontati: essiccazione al microscopio sotto mo bagnatocondizioni de (ESEM), essiccato all'aria da un punto solvente o critica (CP) secchi utilizzando anidride carbonica come fluido di transizione. In greggia e D-leucina-trattata B. potrebbero essere osservate colonie biofilm subtilis diverse fasi di idratazione a seconda del metodo utilizzato. Imaging in condizioni di basso vuoto in modalità bagnata dal ESEM conservato lo stato molto naturale della colonia biofilm. Tuttavia, le informazioni sulla singola morfologia cellulare e EPS abbondanza e l'architettura era scarso, come l'EPS erano ancora completamente idratata e le cellule sono state incorporate nelle EPS (dati non riportati). In termini di disidratazione, CP-essiccazione è stata la procedura più rigorosa. Rimosso strutturalmente più molecole di acqua legate e sfusi dal tessuto, che rappresentano una perdita di volume del 30-70%, a seconda del tessuto 32. Al contrario, essiccazione all'aria conservato le molecole di acqua legate. Un tessuto embrionale per esempio perso 18% del suo volume dopo essiccazione all'aria dall'etanolo solvente volatile e il 59% dopo CP-essiccamento 32 (Figura 6A) . Colonie biofilm che erano disidratati con etanolo e CP-essiccati conservati anche la loro struttura tridimensionale, e l'EPS è apparso come una ragnatela (Figura 6C). Nei campioni di aria essiccata e CP-essiccato, gli effetti della piccola molecola inibitore D-leucina sull'architettura biofilm colonia singola morfologia cellulare e EPS struttura erano evidenti (Figura 6B e D). Le colonie biofilm coltivate in presenza di D-leucina erano più piccole e le rughe erano meno pronunciati. Le cellule D-leucina-trattate sono state allungate, un fenotipo che è observ ati in cellule trattate con molecole parete cellulare di targeting 33. Inoltre, le cellule sono state chiaramente meno coperti con l'EPS e non strettamente collegati ai loro celle confinanti con i EPS come si vede nelle colonie biofilm non trattati. I risultati presentati mostrano che entrambi i metodi di biofilm colonia disidratazione, essiccato all'aria da etanolo o CP-asciugati con anidride carbonica come fluido di transizione dare informazioni preziose sugli effetti di piccole molecole sulla singola morfologia cellulare, così come l'abbondanza EPS e l'architettura.
Figura 6. Le piccole molecole possono cambiare la scala grande e piccola dell'architettura biofilm colonia. Biofilm colonie di B. subtilis NCIB 3610 adulto (A e D) in assenza o (B e D) in presenza di 0,5 mM D-leucina per 72 ore a 30 ° Csu terreno solido MSgg stati fissata come descritto nel protocollo ed essiccato da etanolo come segue: (A e B) aria secca e (C e D) CP-essiccato usando anidride carbonica come fluido di transizione. Vengono mostrati dall'alto verso il basso le immagini binoculare delle colonie biofilm (sinistra, pannelli superiori), dall'alto verso il basso le fotografie delle colonie biofilm secchi montato su mozziconi di microscopia elettronica prima di oro-palladio rivestimento (sinistra, pannelli inferiori), a basso e ad alto ingrandimento le immagini acquisite da SEM per mostrare l'architettura 3D delle rughe biofilm colonie o la singola morfologia cellulare organizzazione / EPS. Scala barre da sinistra a destra:. 5 mm, 100 micron, 2 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| 1.925 mM | pentolaassium fosfato monobasico |
| 3.075 mM | potassio fosfato bibasico |
| 100 mM | 3- (-morpholino N) propanosulfonico, pH 7,1 |
| 2 mm | cloruro di magnesio esaidrato |
| 700 micron | cloruro di calcio anidro |
| 50 mM un | di ferro (III) cloruro esaidrato |
| 125 micron B | |
| 1 pM | cloruro di zinco anidro |
| 2 micron | cloridrato di tiamina |
| 50 mg / ml | triptofano |
| 50 mg / ml | fenilalanina |
| 50 mg / ml | treonina |
| 0,5% (v / v) | glicerolo anidro |
| 0.5% (w / v) | sali monosodico acido L-glutammico idrato |
| una per il saggio pellicola; b per il saggio di biofilm | |
Tabella 1. Composizione finale 1x MSgg utilizzato in questo studio.
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Discussion
Bacillus subtilis forme robuste e altamente strutturati biofilm sia a liquido (pellicole) e su terreno solido (colonie). Quindi, serve come organismo modello ideale per caratterizzare la modalità d'azione degli inibitori specifici biofilm. Il supporto solido, cellule formano strutture multicellulari con caratteristiche distintive che non sono evidenti in pellicole, come rughe irradiano dal centro verso il bordo. Così, pellicole e le colonie sono sistemi complementari per lo studio B. subtilis pluricellularità.
L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un B. sistema modello subtilis per biofilm (pellicole e colonie) inibizione. Diversi passaggi sono fondamentali per la riproducibilità del saggio biofilm disturbo. Un primo passo critico è per confermare che l'effetto sulla formazione del biofilm non è dovuto ad una tossicità generale per batteri cresciuti nello stile di vita planctonico. Questo può essere considerato confrontando l'effetto di una data concentrazione di comemolecola inibitore centro commerciale sulla inibizione biofilm rispetto all'effetto di questa molecola sulla crescita planctonici. Un effetto drammaticamente forte sullo sviluppo biofilm può garantire l'identificazione di meccanismi dell'obiettivo che sono specificamente importante per lo sviluppo del biofilm. Inoltre, lo studio qui descritto dimostra l'importanza delle condizioni pre-coltura per lo sviluppo di pellicole e la loro sensibilità a piccole molecole. Prima che caratterizza l'effetto di piccole molecole, condizioni sperimentali riproducibili e robuste (ad esempio, la crescita della temperatura pellicola e mancanza di sensibilità alla composizione media) per testare i loro effetti devono essere definite. Per trovare queste condizioni, i mezzi della condizione pre-cultura, devono essere considerati fase di crescita dei mezzi di comunicazione pre-coltura, la rimozione dei supporti pre-cultura, temperatura di crescita e di sviluppo.
Una sfida importante, una volta che viene trovato un inibitore specifico per la formazione di biofilm, è quello di trovare quantitativae metodi qualitativi che caratterizzano gli effetti di queste piccole molecole inibitrici sullo sviluppo biofilm e resistenza. Qui, due metodologie importanti sono descritti in dettaglio che può essere utilizzato per valutare gli effetti di tali inibitori. Innanzitutto, si introduce un metodo quantitativo semplice che può riproducibile sondare la resistenza dei trattati rispetto biofilm colonie non trattate a battericidi, come l'etanolo. Risultati rappresentativi sono mostrati per la sensibilità di colonie biofilm D-leucina-trattata per 50% di etanolo. Tuttavia, questo saggio può essere facilmente modificato utilizzando diversi agenti sterilizzanti o antibiotici. In secondo luogo, un metodo SEM è descritto in dettaglio che consente l'esame alta risoluzione dei cambiamenti nella colonia biofilm causato dalla piccola molecola inibitore in diversi livelli complementari: la struttura generale, l'organizzazione e l'abbondanza della matrice EPS e dei suoi componenti, e morfologie unicellulari in tutto il biofilm. Notiamo che i due metodi di dehydration (aria di essiccazione dal 100% di etanolo o CP-essiccazione utilizzando anidride carbonica come fluido di transizione) può essere utilizzato altrettanto durante la preparazione del campione SEM di una colonia biofilm. È importante sottolineare che la fissazione successo del campione biofilm si basa principalmente sulla idrofobicità della colonia biofilm. Questo idrofobicità è una caratteristica intrinseca di B. biofilm subtilis dovuti allo strato superficiale idrofoba 10,34.
Diversi approcci sono stati utilizzati in precedenza per lo studio di montaggio e lo sviluppo del biofilm con B. subtilis come organismo modello 35. Un certo numero di studi indipendenti hanno dimostrato gli effetti di composizione dei media sullo sviluppo di biofilm 36-38. Finora tuttavia, una valutazione sistematica degli effetti di composizione media sulla inibizione biofilm è stato, al meglio delle nostre conoscenze, carente. Questo studio dimostra che mentre l'inibizione pellicola di B. subtilis da piccole molecole è sensibile al pre-coltura condizioni, è Unaffected dagli effetti della temperatura e composizione media, e quindi utile per schermi sistematici di piccole molecole inibitrici. Inoltre, abbiamo stabilito un metodo semplice, riproducibile e quantitativa per valutare la resistenza dei non trattati o piccole molecole inibitori trattati colonie biofilm agli agenti antibatterici, attualmente manca nel modello di biofilm organismo B. subtilis.
B. subtilis biofilm in combinazione con i giornalisti fluorescenti possono essere presi ulteriormente per cercare piccole molecole inibitrici che l'obiettivo sia un passo evolutivo specifico della formazione di biofilm o di una specifica sottopopolazione di cellule all'interno del biofilm. I metodi qui descritto non forniscono la risoluzione di singola cellula, in termini di espressione genica all'interno del biofilm. Metodi per l'analisi di espressione genica EPS matrice all'interno di B. biofilm subtilis a livello di singola cellula sono stati stabiliti con successo 39.
biofilm batterici sono di Crucial significato in ambienti agricoli, industriali e clinici. In un contesto agricolo, la capacità di formare biofilm aumenta la colonizzazione pianta ospite di numerosi impianti patogeni 40, e in un contesto clinico, biofilm sono intrinsecamente resistenti agli agenti antimicrobici 21 e sono al centro di molte infezioni batteriche persistenti e croniche. Inoltre, è ora riconosciuto che biofilm hanno enormi implicazioni di costo per l'industria quanto sono estremamente difficili da rimuovere e controllo 41. Pertanto, lo sviluppo di un quadro sperimentale per lo studio degli inibitori biofilm microbici offrirà notevoli agricola 42,43, 21,44 clinici e tecnologici 45-47 progressi.
I metodi attuali sono limitate a B. subtilis. Incoraggiamo seguendo le idee quantitativi e qualitativi descritti per studiare gli inibitori piccole molecole specifiche per biofilm in altre specie. Inoltre , Questo studio si riferisce ad un esempio specifico per l'inibizione biofilm da D-leucina, su diversi inibitori specifici biofilm pubblicato in precedenza 17. È importante sottolineare che, D-leucina è stato già caratterizzato come una molecola anti-biofilm nel patogeno per le piante Xanthomonas citri 48, presentando le possibili analogie tra la colonizzazione delle piante e la formazione di biofilm. La formazione di biofilm (pellicola e la formazione di colonie rugosa) è comune anche in agenti patogeni umani (per esempio, Pseudomonas aeruginosa 49-51 e uropatogeni Escherichia coli 52,53). I metodi descritti possono essere ulteriormente sviluppati per la ricerca di farmaci specifici che inibiscono la formazione di biofilm e riducono la resistenza biofilm mediata agli agenti antimicrobici nella ricerca clinica. Nel complesso, i metodi descritti qui possono essere utilizzati come base per sviluppare concetti quantitativi e qualitativi per studiare gli inibitori piccole molecole specifiche per biofilm in altre specie.
nt "> In sintesi, mettiamo a disposizione uno strumento di dialogo semplice e utile che dimostra i potenziali punti di forza e le insidie nell'utilizzo di B. subtilis per studiare gli inibitori biofilm.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
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