Introduction
다세포 세균 지역 사회는 자연 및 인위적 환경에서 중요한 역할을하고, 유익하거나 매우 유해 할 수 있습니다. 이러한 다세포 콜로니 개별 세포 자체 생산 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 매트릭스에 매립되는 것을 특징으로하는 바이오 필름으로서 알려져있다. 허가제 강하게들이 정착 표면에 세포를 접착. 그들은 기계적 및 화학적 힘에 대항하는 방패 역할 및 셀룰러 통신 1을 촉진, 인접 셀 사이에 긴밀한 연락을 만듭니다. 생물막은 세포가 고도로 규제 사용하십시오 차별화 된 커뮤니티로 볼 수있다, 종 2-5에서뿐만 아니라, 지역 사회 내에서 활동을 조정하는 프로세스를 조율. 생물막 상태로 성장 플랑크톤 자유 생활 모드 간의 전환은 종종 개발 프로세스와 관련된다. 좋은 예는 그람 양성 토양 박테리아 고초균 및 따라서 인 undomesticated 균주는 biofilm 형성을 유도하는 발달 단계를 연구하는 강력한 모델 생물 역할을한다. 이 박테리아에서, 운동성 세포는 전문적인 작업 4를 수행 눈에 띄는 다세포 구조로 자신을 구성 할 수 있습니다. 셀들의 하나의 그룹은 매트릭스 생산자 엑소 폴리 사카 라이드 6 분비 아밀로이드 단백질 TASA 7,8, 표면 소수성 단백질 BslA 9,10; 이는 모두는 EPS 11-13의 조립에 참여한다.
자연스럽고 인위적 틈새에 생물막의 풍부하고 일으킬 수있는 치명적인 손상 추정을 감안할 때, 그 형성을 방지하는 방법을 찾기 위해 가압 할 필요가있다. 소분자 억제제는 새로운 규제 경로, 효소 및 생물막 형성에 관여하는 구조 단백질의 발견에 도움이, 이에 다세포 커뮤니티 어셈블리의 복잡한 프로세스의 통찰을 촉진 할 수있다. B.으로 서브 틸리는 바이오 잘 연구 된 모델입니다성막 14,15, 다양한 생물막 억제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 연구는 작은 분자 억제제에 바이오 필름의 반응을 평가하기위한 중요한 4 개의 기본적인 방법을 다룹니다. 첫째,이 억제제는 생물막 특정 대상이 있는지 확인하기 위해, biofilm 형성에 미치는 영향에서 플랑크톤의 성장에 미치는 영향의 분리는 매우 중요하다. 대부분의 항균제는 플랑크톤 성장기에있는 세포를 표적으로하지만, 생물막 라이프를 대상 분자는 드물다. 플랑크톤의 성장에 영향을 미치지 않는 분자 독성이기 때문에 또한 이들은 항생제 내성 돌연변이 체 (16)를 선호 선택 압력을 감소시킬 수있다. 바이오 필름은 D 아미노산 또는 기타 특정 세포벽 간섭 분자로 처리하는 경우, 예를 들면, 그들은 어느 방해하거나 분해하지만, 이러한 억제제는 약간 플랑크톤 성장 12,17 영향을한다. 대조적으로, 많은 항생제 극적 리터와 플랑크톤 성장을 저해ittle 또는 biofilm 형성 (17)에 아무런 영향.
둘째, 작은 분자의 효과를 연구하는 일관되고 견고한 실험 프레임 워크를 확립하는 것이 중요하다. 우리는 소분자 억제제의 활성 농도 범위는 예비 배양 조건 이러한 소분자 저해제의 효과를 연구하기 위해 실험 구성에 민감한 것을 관찰 하였다. 특히이 B를 공부 각종 보고서, 부유 세균 바이오 필름 12,17-19 - 서브 틸리는 D-아미노산 펠리클의 형성을 억제하는 농도 범위의 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에 제시된 결과는 다음과 같은 요소가 활성 농도 범위의 차이를 고려하는 것이 제안 : 예비 배양 조건 (후기 정지 20 성장기 대 로그 12,17) 예비 배양 조건에서 사용 된 배양 배지는 (풍부 정의 대 정의되지 않은 [루리아 국물, LB] [글루탐산 나트륨글리세롤, MSgg), 접종 비 접종 전의 상기 배지 특히 제거. 정적 펠리클의 성장 온도는 소분자 억제제 D 류신, 본 연구에 사용 된 대표 D 아미노산의 활성 영역에서 덜 중요한 역할을 나타내었다.
마지막으로, 한 번 생물막은 특정 바이오 필름 억제제, 강력하고 유익한 방법이 생물막 피트니스 이러한 억제제의 효과를 특성화하기 위해 필요로 처리됩니다. 생물막 콜로니 및 항균제 그들의 저항 내 단일 세포 (1) 효과 : 여기서, 독립적 소분자 억제제의 효과를 특징 화하는 두 가지 방법이 상세히 설명된다. 자유 살아있는 박테리아 21-23에 비해 생물막의 셀은 전형적으로 더 많은 항생제 내성한다. 이 현상은 인성이지만, 항생제 침투를 줄이기위한 EPS의 능력은 종종 매력 설명 24 여겨졌다
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Protocol
1. 펠리클과 바이오 필름 콜로니 형성에 작은 분자 억제제의 효과 평가
- 칼슘 염화 철 (III) 클로라이드 수화물없이 정의 생물막 유도 MSgg 매체 (25)의 2 배 솔루션을 준비합니다. 여과 멸균 한 후, 염화칼슘을 추가한다. 매체는 직접적으로 사용할 준비가되거나 어둠 속에서 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 실험의 날에 1 배 MSgg 희석을 준비합니다.
- (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다.
아니TE는 :. 최종 1X MSgg 조성물은 표 1에 설명되어있는 원래의 레시피 (25)에 비해, 배지를 50㎍ / 트레오닌 mL 및 고체 MSgg 매체에 생물막 콜로니를 성장 철 농도가 주름 콜로니 형태를 최적화하기 위해 2.5 배 증가 하였다 포함 .
- (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다.
- 한천의 고화 후, 접종 전에 30-45 분간 생물학적 후드 고체 MSgg 판을 건조.
- 박막 형성 (그림 1)의 메커니즘을 방해 특정 억제제를 선택하려면, 사용 농도는 플랑크톤 및 정적 성장에 영향을 미치는 것을 배제.
- 고정 성장 단계까지 600 nm에서 매 시간마다 광학 밀도를 측정하여 단순 성장 곡선에서 플랑크톤 성장 (액체 배양 시간에 따른 광학 밀도의 증가)를 결정합니다.
- (CFU)를 측정 배양 탁도 생균 수를 나타내는 것을 확인 집락 형성 단위의 수를 결정하기 위해여러 시점 이후 진탕 배양에서 플랑크톤 성장 단계에서 세포.
- 또한, 동일한 조건에서 접종 섹션 1.7-1.9에서 설명한 바와 같이 24 웰 세포 배양 물에서 23 ℃에서 3 일간 배양 한 끝에 고정 펠리클 성장 수확 세포 소분자 억제제의 효과를 평가 그리고 CFU를 결정한다. 이 컨트롤의 경우, 세포 외 기질 구성 요소에 대한 코딩하는 오페론이 부족 펠리클 결핍 균주를 사용하여 (즉, B. 서브 틸리 Δ epsH, Δ TASA).
주 :이 균주는 정적 조건에서 성장시킬 수 있지만 펠리클 형성 야생형 달리 그 성장이 증가 된 산소 농도 26 호의 액체 - 공기 계면에 부유 할 수있는 능력의 부족이다. 따라서,이 세포 외 매트릭스 - 및 펠리클 결핍 균주는 정적 조건에서 성장을 평가하는 추천 기준 균주이다.
주 : 특정 예를 들어비표준 D-D 아미노산 류신이 충분한 펠리클 형성 12,17 배제 된 간섭 농도 아래 플랑크톤 정적 성장에 영향을 설명했다. 플랑크톤 및 정적 성장을 결정하는 방법을 상세하게도 17에서 설명된다.
그림 1. 강력한 실험 장치의 식별을위한 개념적 개요 biofilm 형성의 구체적인 억제를 평가하기 위해. 플랑크톤 성장에 뚜렷한 효과없이 생물막 형성 특정 간섭을 나타내는 작은 분자 억제제에 대한 선택 기준을. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
- B. 밖으로 행진 -80 ° C 형 재고 서브 틸리 스 (LB의 cultu20 % 글리세롤에 얼의 재 109 세포 / ㎖)을 멸균 팁 또는 스틱 어플리케이터와 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 단일 콜로니를 분리한다.
- 30 ℃에서 하룻밤 성장.
- CRITICAL STEP : 예 D 류신과 같은 비표준 D - 아미노산에 의해 견고 펠리클 저해 단일 콜로니는 4 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ LB 배지에서 LB-1.5 % 한천 플레이트에서 고른 성장 인큐베이터를 흔들어 (속도 200 rpm으로 진탕). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 1.5 ml의 MSgg 매체에 펠렛을 다시 중단, 6,000 XG에서 4 분 동안 1.5 ml의 스타터 문화를 원심 분리하여 접종 이전에 생물막 유도 MSgg 매체와 LB 배지를 교체합니다. 문화의 나머지는 폐기 될 수있다.
중요 : 시스템의 안정성을 보장하기 위해, 세척 스타터 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도가 0.6과 1 사이 여야합니다. - 스타터 문화의 성장하는 동안, 12 웰 세포 배양 multidish 판 containin을 준비이없는 또는 작은 분자 억제제 (예, 0.3, 0.5, 1 mM의 D 류신 17)의 농도 범위 MSgg 배지 3 ㎖ g. 가장자리 효과를 배제하기 위해, multidish 접시에 걸쳐 서로 다른 농도의 위치를 배포 할 수 있습니다. 또한, MSgg 매체의 1.5 ml에 포함 된 24 웰 세포 배양 multidish 플레이트를 사용합니다.
- (1,000 희석 1) 세척 스타터 문화의 3 μL와 12 웰 세포 배양 multidish 판의 우물을 접종한다.
주 : 낮은 희석 비율, 즉, 1 : 500이 사용될 수있다. 이 펠리클의 개발 시간을 감소시킨다. - 사흘 동안 정적 상태에서 23 ° C에서 펠리클 성장. 이 펠리클의 최종 표면 형상에 영향을 미칠 수 있기 때문에,이 시간 동안 펠리클을 움직이지 않는다.
- 번개의 양안 및 균일 한 노출 사진을 획득. 대안 적으로, 고해상도 카메라와 펠리클의 사진을 촬영. inconsis에 의한 유물을 방지하려면텐트 빛의 각도와 그림자, 삼각대에 고정 된 카메라로 위에서 아래로 사진을 찍고 양쪽에서 45 °에서 부드럽고 큰 광원을 사용합니다.
참고 : B를 공부하는 다른 방법 서브 틸리 다세포 고체, 바이오 필름 유도 MSgg 매체에 생물막 식민지 분석이다. 펠리클과 마찬가지로,이 분석은 시공간 과정의 연구를 할 수 있습니다. 소분자 저해제의 유효 범위가 결정되면, 생물막 콜로니 형성에 미치는 영향을 연구 할 수있다. - 8.5 cm 직경의 페트리 접시 당 4 방울 - 생물막 식민지를 성장, 대칭 씻지 사전 문화의 1.5 μL 템플릿의 도움으로 건조 MSgg 1.5 % 한천 플레이트에 (단계 1.7) 자리. 방울 그들을 이동하기 전에 판에 흡착 할 수 있습니다.
참고 : 템플릿은 세포가 재배되는 지역 내 바이오 필름 식민지의 동일한 분포를 얻을 수 있습니다. 템플릿을 준비하려면, 원래 규모에서 성장의 전체 면적을 그릴 동일한 종파로 분할ORS과 중앙을 표시합니다. 8.5 cm 직경의 원형 페트리 접시의 경우,이 14 cm 2 일 생물막 식민지를 지정합니다. - 사흘 동안 30 ° C에서 접시를 품어. 이 시간 동안, 생물막 콜로니 개발 입체 주름 구조를 형성한다.
- 단계 1.11에서와 같이 사진을 촬영합니다.
2. 에탄올 저항 분석
- 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 성장.
- 30 ° C에서 성장의 68 시간 후, 면도날과 템플릿의 도움으로 동일한 두 부분으로 생물막 식민지를 잘라.
도 2 실시 예 살균제에 생물막 콜로니 셀의 저항을 평가하기위한 실험 설계. 페트리 접시에 걸쳐 생물막 콜로니 동일한 분배 절단에 사용되는 (A) 템플릿. (B)처리되지 않은 야생형 생물막의 하향식 이미지는 30 ℃에서 고체, 정의 생물막 유도 MSgg 매체에 68 시간 동안 성장. 확대는 생물막 식민지 두 개의 동일한 절반으로 절단하는 방법을 보여줍니다. (C)은 두 개의 동일한 생물막 절반은 동일하게 (제어, PBS)을 치료 또는 PBS 또는 살균제 중 하나와 설명에 따라 처리됩니다. 스케일 바 :. 1cm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 조심스럽게 작은 주걱 한천 플레이트에서 콜로니 생물막의 각각의 절반을 올려 인산 완충 용액 (PBS) 500 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 이동합니다. 필요하다면, 플레이트에 남아있는 세포를 긁어 아니라 마이크로 원심 튜브로 옮긴다.
주 : 생물막 콜로니 후반전, 차분 처리는 제어 여부에 따라 또는 steri에 대한 내성을 테스트하는 것이다LIZING 에이전트. - 제어의 경우, 단계 2.3에서와 같이 500 ㎕의 PBS에서 생물막 식민지의 두 번째 절반을 품어. , 멸균 제에 대한 내성을 평가하는 500 ㎕의 50 % (v / v)의 에탄올 생물막 콜로니의 후반을 전송한다.
참고 : 예컨대 차아 염소산 나트륨 등의 대안의 살균제를 사용할 수있다. 사용 된 모든 살균 에이전트의 경우, 예비 실험의 활성 농도 및 배양 시간을 결정합니다. - 실온에서 벤치 탑에서 10 분 동안 생물막 콜로니 부화.
- 18,000 XG에서 5 분 동안 생물막 식민지를 원심 분리기 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다. PBS 300 μl를 추가합니다.
- 소니 케이의 마이크로 팁과 세포 온화 (진폭 10 %, 펄스 5 초) sonicate하세요.
주 : 초음파 에너지가 별도의 생물막 집계에 충분해야한다. 그러나, 지나치게 강한 초음파가 세포 용균있다. 광학 현미경 초음파 에너지에 의해 사전에 확인세포를 용균하지 않습니다 사용하고 모든 집계 용해됩니다. - 1 ML의 최종 볼륨 PBS 700 μl를 추가합니다. PBS (10 -7) 일련의 희석을 수행하고 멸균 유리 비드를 사용하여 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 3 희석액 100 ㎕를 확산.
주 :이 살균제에 응답 관심 및 세포 생존율의 생물막 콜로니 세포의 양에 따라, 상기 최적의 희석은 도금 될는 예비 실험에서 결정되어야한다. - 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품어 CFU를 계산하고 CFU에게 / ㎖를 결정한다. 각 반 생물막 식민지의 최종 CFU / ㎖에서 생존자의 비율을 계산합니다.
주 : 실시 분석 한 바와 같이 대칭 또는 콜로니의 저항 값을 확인하는 제어 생물막 콜로니의 반쪽과 생존 세포 수의 10 % 이하의 차이를 산출한다 미처리 생물막 콜로니 에탄올 처리 절반 대 비 처리 , respectively. 대안 적으로, 결과는 전체 CFU로 표현 될 수있다. 제어 및 미처리 생물막 집락의 세포 수는 동일한 정도의 크기로 유지한다. 반대로, 작은 분자 처리 생물막 콜로니의 에탄올 처리 절반의 세포 수는 살균제로 증가 된 감도 항에 2 차의 크기를 최소로 감소 할 것으로 예상된다.
주사 전자 현미경 3. 바이오 필름 식민지 샘플 준비
- 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 식민지를 성장.
- 2 % (v / v)의 글루 타르 알데히드, 100mM의 3 % 나트륨 cacodylate의 (v / v)의 파라 포름 알데히드 용액을, 5 mM의 염화 칼슘 완충액, pH가 7.3의 신선한 배치를 준비한다. 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 정착액 5 ㎖를 준비합니다.
주의 : 글루 타르 알데히드 및 파라 포름 알데히드는 유해하다. 화학 후드 내부에 안전 장비로 처리합니다. HAZ의 솔루션과 오염 물질을 폐기농사 폐기물. - 조심스럽게 바이오 필름 위에 직접 분배하지 않고, 생물막 식민지에 정착을 추가합니다.
참고 : 생물막 식민지의 소수성 특성으로 인해, 식민지 천천히 한천에서 분리하고 떠 시작합니다. - 조심스럽게 파라 필름의 스트립 판을 밀봉. 실온에서 2 시간 동안 회전 진탕 기에서 인큐베이션하고이어서 밤새 39 ° C로 플레이트를 옮긴다.
- 다음 날, 조심스럽게 진공 펌프에 연결 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다.
- 조심스럽게 바이오 필름을 씻고 5 분 동안 배양 10 ml의 100 mM의 나트륨 cacodylate, 5 mM의 염화칼슘 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 바이오 필름의 손상을 방지하고 부드러운 피펫으로 신선한 세척 솔루션을 추가 할 판의 모서리에서 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다. 일단이 단계를 반복합니다.
- 생물막 콜로니 탈수 다음 단계로 진행 DDH 2 O 2 배에 5 분; 3 배 20 분0 % 에탄올; 배 20 분 50 %의 에탄올; 배 20 분 70 %의 에탄올; 배 20 분 96 %의 에탄올; 2 × 100 % 에탄올에서 30 분.
- 각 단계에서 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 액체의 15 ML을 추가하고주의 깊게 각 배양 후 액체를 제거합니다.
- 에탄올에서 샘플을 건조하기위한 두 가지 방법 중 하나를 사용합니다.
- 에탄올 항공 건조의 경우 :
- 분기 셀룰로오스 여과지 (직경 9cm의)을 잘랐다. 간단히 100 % 에탄올에 1/4 잠수함, 다음 조심스럽게에 하나의 부동 생물막 식민지를 전송합니다. 여과지 줄 지어 페트리 접시에 젖은 필터 용지를 넣습니다. 페트리 접시를 덮고 생물막 식민지에게 화학 후드에서 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.
- 전이 유체로서 이산화탄소 (CO 2)를 사용 -drying 임계점 (CP)의 경우 :
- 100 % 에탄올 임계점 건조기 챔버의 75 %를 채운다. 자신의 C에, 홀더에 각각의 샘플을 샘플로 이동hamber. 필요한 경우, 작은 조각으로 가위로 바이오 필름을 잘라. 모든 취급시 에탄올에 빠져들 샘플을 남겨주세요. 그 후, 챔버로 홀더를 전송하고 단단히 챔버를 닫습니다.
- 7 ° C까지 챔버를 냉각 교반 시작합니다. 액체 CO 2와 완전히 챔버를 입력합니다. 7 분 인큐베이션 시간 동안 CO 2와 에탄올 혼합하자. 이어서, 용액을 25 % 방출.
주 : 샘플의 수준 아래의 실을 버리지 말 것. - 단계를 반복 3.8.2.2 네 번.
- 단계를 반복 3.8.2.2 5 분의 배양 시간에 다섯 번. 마지막으로 에탄올을 완전히 CO 2로 대체한다.
- 챔버의 마지막 라운드, 빈 5 % 중. 교반 및 냉각을 끕니다. 42 ° C에 실을 가열 시작합니다. 31.1 ° C의 온도 및 73.9 bar의 압력에서, 액체 CO 2 임계점의 상태에 도달 여기서 기체 산도ASE는 용매 (27)의 액상과 동일한 밀도를 갖는다. 온도가 42 ° C에 도달하면, 10 분 동안 배양한다. 42 ° C에서, 챔버 내의 이산화탄소는 초 임계 기체로서 존재한다.
주 : 끊임없이 챔버의 압력을 확인합니다. 압력은 42 ° C에서 120 줄을 초과하지 않아야합니다. - 천천히 연속 난방 가스를 방출하기 시작합니다. 이것은 CO 2 - 가스 단계에서 샘플을 유지하고, 액체의 표면 장력을 통해 시료의 형태의 변형을 방지한다. 미세 조정하여 유량계를 제어하는 계량 밸브를 5 리터 / h에 유량계를 설정합니다. 챔버 내의 모든 압력이 해제 될 때까지 기다립니다. 이제 챔버를 열고 홀더에서 조심스럽게 샘플을 제거합니다.
- 에탄올 항공 건조의 경우 :
- 코트 카본 테이프 전자 현미경 토막. 핀셋의 도움으로 조심스럽게 그루터기에 바이오 필름의 식민지를 전송합니다. 차에서 얇은 다리를 추가하여 스텁 각 식민지 연결전자 빔에서 충전 제거를위한 중요 봉 테이프. 그들은 매우 깨지기 쉬운만큼이 단계에서주의하여 생물막 식민지를 처리합니다. 최소 24 시간 동안 또는 시험 때까지 데시 케이 터에서 샘플을 저장합니다.
- 주사 전자 현미경 검사의 날은, 금, 팔라듐 스퍼터 코터에서 60 °의 각도에서 2 분간 생물막 콜로니 - 스퍼터 코팅. 두 번이 단계를 반복 사이에 120 °로 샘플을 돌립니다. 마지막에, 스퍼터 코팅 샘플을 일단 위로부터 3 분. 금 - 팔라듐 20 nm의 얇은 층은 도전성을 향상시키고 SEM의 영상에 대한 샘플의 콘트라스트를 향상시킨다.
- 주 사형 전자 현미경 (29, 30)로 촬상 할 때까지 샘플 (28)의 재수 않도록 데시 케이 터에서 샘플을 저장한다.
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Representative Results
펠리클 분석은 B의 높은 규제 및 동적 프로세스를 연구하는 하나의 방법이다 서브 틸리 다세포. 이 외에, 펠리클 분석 한 실험에서 단일 세포 배양 multidish 접시에 미리 시동 조건 또는 소분자 어느 농도의 범위를 테스트하는 데에 적합하다. 그러나, B. 서브 틸리 펠리클 형성은 예비 배양 조건에 민감하다 (예를 들어, 예비 - 배양의 성장 배지 및 성장 단계) 접종 비와 미리 배양 배지의 제거. 우리는 따라서 먼저 우리가 D-류신에 의한 페리 클 억제를 재현 할 수 실험 설정에 대한 검사. 우리의 결과는 세포 진탕 4 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ LB의 중간 대수 증식기 (단일 콜로니로 정의 풍부한 LB 배지에서 사전 배양 한 경우 D 류신 의해 재현 펠리클 억제를 얻을 수 있음을 보여 ), 스핀 다운하여 (1)에 사전 정의 MSgg 배지에 재현 탁 : 1000 inoculat이온 (그림 3A). 200에서 진탕하면서 37 ℃에서 100 3 ㎖ MSgg하고, 5 시간 동안 성장 : 세포를 2 시간 동안 1 ㎖의 LB에 중간 대수 증식기 (단일 콜로니로 MSgg 배지에서 배양했을 때, 1 다시 희석 ) RPM은 예비 - 배양 배지를 제거하여 D 류신 활성에 영향을주지 않았다. 고정 성장 단계로 성장 세포 (2 시간 동안 1 ㎖의 LB 단일 콜로니 1 다시 희석 : 100 ㎖ MSgg 3, 실온에서 롤러에서 20 시간 동안 성장) 이전에 MSgg 매체 세정 접종은 덜 민감했다. 그러나, D 류신의 펠리클 억제 효과 향해 저항이 증가 접종 비율을 증가 예비 - 배양의 높은 세포 밀도에 기인 될 수있다. 즉 MSgg 매체 정적 성장을 예비 배양 접종 비율은 1 : 500 또는 1 : 1,000, D 류신의 활성 영역과 펠리클 현상시 (도 3b)에 영향을 주었다. D 류신 의해 펠리클 억제 발생한다른 성장 온도 (23 ° C, 30 ° C, 그림 3C)에서. D 류신에 세포의 민감도가 예비 - 배양 조건에 따라 다르지만 중요한 것은, 서로 다른 온도에서 현상의 재현성이 소분자 D 류신 의해 펠리클 억제 강력한 기능을 가지고 있음을 보여준다.
. 예비 배양 성장과 오염 물질 (A)를 제거 : D 류신 의해 펠리클 억제 다양한 예비 - 배양 조건의 효과를 보여주는도 3 예의 결과는 여러 가지 파라미터를 포함하는 견고한 실험 구성을 획득하기 위해 평가 될 필요 (세정에 비해 세정시) 배지는 예비 - 배양의 성장 배지 (풍부 정의 LB 배지 또는 정의 생물막 유도 MSgg 매체) ((고정 성장기 대 대수) 및 예비 - 배양의 성장 상태를최종 펠리클 성장 배지로 미리 배양 500) 및 (C)의 성장 온도 (30 ℃ 대 23 ℃) B. : B) 접종 비율 (1 : 1000 대 1이다. 서브 틸리 NCIB 3610 세포를 37 ℃ 또는 실내 밤새 온도 (O / N) 진탕에서 4 시간 동안 (LB 또는 MSgg) 지시 된 배지에서 성장시키고, 표시하면 전 배양액 MSgg로 대체 하였다 (세정 또는 )하지 않은 세척 하였다. 마지막으로, 스타터 문화는 1 접종 : 별도의 언급과 펠리클은 사흘 동안 23 ° C에서 정적 조건에서 성장시켰다 1,000하지 않을 경우. 하향식 사진은 카메라로 획득했다. 잘 직경 22 mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
예비 - 배양 조건의 식별 및 D의 활성 재현 범위 허용 실험 설정이 완료되면효과는 그것의 견고성을 테스트했다 : 박막 형성에 류신 (1,000 사흘 동안 23 ° C에서 성장 MSgg 세척 중간 대수 성장 단계에 LB에서 성장 사전 문화, 1 희석). 이를 위해 펠리클에 형성 D 류신의 활성은 다양한 변형 MSgg 매체 (도 4)에서 평가 하였다. 펠리클 저해 D 류신의 활성 범위 테스트 다섯 미디어 일관성이며, 펠리클 형성에 D 류신의 효과가 강력한 것으로 나타낸다. 유사한 경향은 농도 펠리클 억제가 2 μM 여러 변형 MSgg 용지 (낮은 철 농도 및 암모늄 클로라이드 또는 글루코스와 탄소원 데이터되지와 질소원 여분의 일치 하였다 범위 D-티로신으로 관찰 참조).
D-류신에 그림 4. 감도 발생다양한 성장 미디어. 표시됨은 B의 탑 다운 사진이다 정의 생물막 유도 MSgg 매체 또는 상이한 변성 MSgg 매체 (탄소원 0.5 % 글루코스 23 ° C에서 정적 조건 하에서 성장 틸리 NCIB 3610 펠리클; 질소원 0.5 % (NH4) 2SO4, 철분 250 μM 50ml을 상기 펠리클없이 또는 표시된 농도에서 D-류신과 중) 5 일 동안 배양 하였다 대안 질소원 매체 (을 제외하고 3 일 동안 낮은 글리세롤 0.125 % 글리세롤). 스타터 문화는 정의, 풍부한 LB 배지에서 진탕 37 ° C에서 4 시간 동안 배양 하였다. 접종 이전에, 세포를 원심 분리에 의해 세척하고, 해당 펠리클 성장 배지에 재현 탁. 스타터 문화 1 희석 : 1,000, 잘 직경 22 mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 방법은 B. 공부 서브 틸리 다세포 고체 MSgg 매체에 생물막 식민지 분석이다. 펠리클과 마찬가지로,이 분석은 시공간 과정의 연구를 할 수 있습니다. 소분자 저해제의 유효 범위는 펠리클 시스템에서 결정되면, 생물막 콜로니 형성에 미치는 영향을 연구 할 수있다. 생물막 콜로니 덜 연약하고, 고체 배경 그들이 조작하기 쉽기 때문에 본 연구에서 생물막 콜로니, 살균제에 생물막 콜로니 저항 D 류신의 효과를 평가하기 위해 사용되었다. D 류신 처리 생물막 콜로니를 10 분 동안 50 % 에탄올에 노출되는 경우, 생존 세포의 비율이 극적으로 미처리 부분 (도 5)에 비해 방울. 이 방법은 다른 소분자 저해제의 효과 및 살균 제제에 대한 내성에 미치는 영향을 평가하기 위해 더 개발 될 수있다 (steril델링 제 또는 항생제).
살균 에이전트에 대한 치료 또는 치료 생물막 식민지 저항의 그림 5. 예 결과. B.의 바이오 필름 식민지 서브 틸리 NCIB 3610 또는 0.5 mM의 D 류신 않고, 30 ° C에서 68 시간 동안 고체, 한정 배지에서 배양 하였다. 두 개의 동일한 반쪽 콜로니를 절단 한 후, 반은 PBS (내부 대조군) 50 % 에탄올 또는 PBS (대조군)와 함께, 나머지 절반으로 처리 하였다. 온화한 초음파 시리얼 희석 도금 및 집락 형성 단위의 계산 후, 내부 대조군과 비교 생존자의 비율을 산출 하였다. 이 (A) 또는 세 (B, C)에 복제 및 표준 편차의 평균 세 개의 독립적 실험의 결과를 보이고있는 바와 같다. 여기를 클릭하세요 t오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
주사 전자 현미경 (SEM)은 생물막 콜로니 주름, 풍부 및 EPS 국산화 단일 세포 형태 (31)의 상기 공간 구조에 집중하기 위해 사용될 수있는 강력한 도구이다. SEM 영상은 높은 진공 상태에서 이미징 될 수있는 샘플이 필요합니다. 고 진공 조건에서 샘플을 조사하기 위해, 모든 벌크 물 분자를 제거해야하고, 따라서, SEM 영상은 촬상에 앞서 샘플의 탈수 반응을 필요로한다. 대안 적으로, 샘플은 수화 된 샘플을 부드럽게 현미경 챔버에서 건조 환경 주사 전자 현미경 (ESEM)에 의한 습식 모드에서 저 진공 조건에서 영상화 될 수있다. 생물막 콜로니 아키텍처는 EPS 조직 및 세포 형태의 소분자 억제제의 효과를 평가하기 위해, 샘플 탈수 세 가지 유형의 비교 하였다 : 습식 MO 현미경 하에서 건조드 상태 (ESEM)는 공기 - 건조 용매 또는 임계점 (CP)로부터의 전이 유체로서 이산화탄소를 사용 -dried. 미처리 및 D 류신 처리에서 B. 사용 된 방법에 따라 서브 틸리 생물막 콜로니 다른 수화 스테이지를 관찰 할 수있다. ESEM에 의해 젖은 모드에서 저 진공 상태에서 이미지는 생물막 식민지의 매우 자연 상태를 보존. 그러나, 하나의 세포 형태와 EPS 풍부 및 구조에 대한 정보가 EPS가 아직 완전히 수화 있었던 것에 부족한이고 셀이 EPS에 삽입 하였다 (데이터는 보이지 않음). 탈수 반응의 측면에서, CP-건조 가장 엄격한 순서였다. 그것은 조직 (32)에 따라 30-70 %의 용적 손실에 대한 회계, 조직에서 가장 구조적으로 결합 된 대량의 물 분자를 제거했습니다. 대조적으로, 공기 건조 바운드 물 분자를 유지. 예를 들어 배아 조직 휘발성 용매 에탄올 공기 건조 후의 부피의 18 %를 잃고 59 % CP 건조 후 32 (도 6A) . 에탄올과 함께 탈수 생물막 콜로니 또한 CP는 건조 자신의 입체 구조를 보존하고, EPS는 거미줄 (그림 6C)처럼 보였다. 공기 건조 및 CP 건조 샘플에서 생물막 콜로니 아키텍처 소분자 억제제 D 류신의 효과는, 단일 세포 형태 및 EPS 구조 겉보기 (도 6B 및 D)였다. D-류신의 존재 성장 생물막의 식민지가 작았하고 주름이 덜 뚜렷했다. 디 - 류신 - 처리 된 세포는 obse 인 표현형을 연장 한세포벽 타겟팅 분자 (33)로 처리 한 세포에서 rved. 또한, 세포는 명확히 덜 EPS 덮었다 단단히 미처리 생물막 콜로니에서 볼 때 EPS 통해 자신의 이웃하는 셀에 연결되지. 제시된 결과는 전이 유체를 단일 세포 형태의 소분자의 효과에 유용한 통찰을 제공으로 생물막 콜로니 탈수 두 방법, 공기 - 건조 에탄올로부터뿐만 아니라 EPS 풍부에 이산화탄소를 이용한 CP 건조 보여 건축.
그림 6. 작은 분자는 생물막 식민지 아키텍처의 크고 작은 규모를 변경할 수 있습니다. B.의 바이오 필름의 식민지를 서브 틸리 NCIB 30 ° C에서 72 시간 동안 0.5 mM의 D 류신의 존재 유무 (3610)에서 성장 (A 및 D) 또는 (B 및 D)다음으로 에탄올에서 프로토콜에 기술되고 건조 솔리드 MSgg 매체 상에 고정화 하였다 : (A 및 B) 공기 - 건조시키고, (C 및 D) CP 건조 전이 유체로서 이산화탄소를 사용. 전 (왼쪽 아래 패널) 금 - 팔라듐 코팅, 저 높은 배율로 전자 현미경 스텁에 장착 위에서 아래로 건조 된 생물막 식민지의 사진을 위에서 아래 생물막 식민지의 양안 이미지 (왼쪽, 상단 패널)이다 도시 SEM에 의해 획득 된 영상은 생물막 식민지 주름이나 단일 세포 형태 / EPS 조직의 3 차원 구조를 표시합니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 스케일 바 :. 5mm, 100 μm의 2 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1.925 밀리미터 | 냄비assium 인산 염기 |
| 3.075 밀리미터 | 칼륨 인산 |
| 100 밀리미터 | 3- (N의 -morpholino) 프로판 술폰산, pH가 7.1 |
| 2 밀리미터 | 염화 마그네슘 수화물 |
| 700 μM | 염화칼슘, 무수 |
| 50 μM | 철 (III) 클로라이드 수화물 |
| 125 μM의 B | |
| 1 μM | 염화 아연, 무수 |
| 2 μM | 티아민 염산염 |
| 50 μg의 / ㎖ | 트립토판 |
| 50 μg의 / ㎖ | 페닐알라닌 |
| 50 μg의 / ㎖ | 트레오닌 |
| 0.5 % (v / v)의 | 글리세롤 무수 |
| 0.5 % (W / V) | L 글루탐산 모노 나트륨 염 수화물 |
| 페리 클 분석을 위해, 생물막 분석을위한 B | |
표 1. 본 연구에 사용 된 최종 1 배 MSgg 조성입니다.
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Discussion
바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형태 강력하고 고도로 구조화 된 생물막 모두 액체 (펠리클)와 고체 배지에 (식민지). 따라서, 특정 바이오 필름 저해제의 작용 모드를 특성화하는 이상적인 모델 생물로서 기능한다. 고체 배지에서 세포 가장자리에 중심에서 방사 주름 등 펠리클에서 알 수없는 고유 한 특징을 가진 다세포 구조를 형성한다. 따라서, 펠리클과 식민지 B.을 연구 보완 시스템은 서브 틸리 다세포.
이 연구의 목적은 B. 개발하는 바이오 필름 (펠리클과 식민지) 억제를위한 서브 틸리 모델 시스템입니다. 몇 가지 단계는 생물막 방해 논문의 재현성을 위해 중요하다. 첫 번째 중요한 단계는 biofilm 형성에 미치는 영향으로 인해 플랑크톤 생활에서 자란 박테리아에 대한 일반적인 독성이 아니라고 확인하는 것입니다. 이는 등의 소정의 농도의 효과를 비교하여 고려 될 수있다플랑크톤 성장이 분자의 영향으로 상대적으로 생물막 억제에 상가 분자 억제제. 생물막 개발에 극적 효과가 강한 생물막의 개발이 특히 중요 목표기구의 식별을 보장 할 수있다. 또한, 본원에 기재된 연구가 펠리클의 개발과 소형 분자들은 감도에 대한 예비 - 배양 조건의 중요성을 보여준다. 그들의 효과를 테스트하는 소분자 재현성 견고한 실험 조건 (예를 들면, 박막 성장 온도와 미디어 조성물의 감도 부족)의 영향을 특성화하기 전에 정의되어야한다. 이러한 조건을 찾기 위해, 예비 - 배양 조건의 매체는 전 배양 전 배양 배지 제거, 성장 온도 및 성장 매체의 성장 단계가 고려되어야한다.
바이오 필름 형성을위한 특정 억제제가 발견되면 주요 과제는 양적 찾는 것이다생물막 개발 및 내성 이러한 소분자 저해제의 효과를 특징 질적 방법. 여기서, 두 가지 중요한 방법은 억제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다 상세히 설명된다. 첫째, 우리는 재현성 에탄올과 같은 살균제로 처리되지 않은 식민지 바이오 필름, 대 치료의 저항을 조사 할 수있는 간단한 정량 방법을 소개합니다. 대표 결과 50 % 에탄올에 D-류신 처리 생물막 식민지의 감도 표시됩니다. 그러나,이 논문은 쉽게 다른 살균제 나 항생 물질을 사용하여 변형 될 수있다. 둘째, SEM 방법은 고해상도 여러 보충 수준의 작은 분자 억제제에 의한 바이오 필름 콜로니의 변화 시험 있도록 상세히 설명한다 : 전체 구조, 조직 및 EPS 행렬의 풍부함과 성분 및 생물막 걸쳐 단일 셀 모폴로지. 우리는 dehydrati의 두 가지 방법을주의(전이 유체로서 이산화탄소를 사용하여 100 % 에탄올 또는 CP 건조 공기에서 건조)의 생물막 콜로니의 SEM 샘플 제조 동안 동일하게 사용할 수있다. 중요한 바이오 필름 샘플의 성공적인 정착은 크게 바이오 필름 식민지의 소수성에 의존한다. 이 소수성는 B의 고유 한 특성입니다 소수성 표면층 10,34 인해 서브 틸리 생물막.
여러 가지 접근 방법은 B.와 생물막 조립 및 개발을 연구하기 위해 이전에 사용되었다 모델 생물 35 서브 틸리 스. 독립적 인 연구들이 바이오 필름 개발 36-38에 미디어 조성물의 효과를 보여 주었다. 지금까지하지만, 생물막 억제에 미디어 조성물의 효과의 체계적인 평가 부족, 우리가 아는 한,이었다. 이 연구는 보여 그 동안 B의 페리 클 억제 작은 분자에 의해 서브 틸리 조건 - 문화 사전에 민감, 그것은 UNA입니다온도 및 미디어 조성, 작은 분자 억제제의 체계적인 화면에 대한 따라서 유용의 영향에 의해 ffected. 또한, 우리는 현재 생물막 모델 생물 B. 결여 항균제로 치료 또는 소분자 억제제 처리 생물막 콜로니의 저항을 평가하기 위해, 간단하고 재현 가능한 정량 방법을 확립 서브 틸리 스.
형광 리포터와 함께 B. 서브 틸리 생물막이 바이오 필름 형성의 특정 발달 단계 또는 생물막 내의 세포의 특정 서브 인구를 대상 소분자 억제제 검색 더 수행 할 수있다. 본원에 기재된 방법은 생물막 내의 유전자 발현의 관점에서 단일 세포 분석을 제공하지 않는다. B. 내의 EPS 매트릭스 유전자 발현 분석 방법 단일 세포 수준에서 서브 틸리 생물막 (39)가 성공적으로 확립되었다.
세균 바이오 필름은 crucia의입니다농업 산업 및 임상 설정에서 리터의 의미. 농업 맥락에서, 생물막을 형성 할 수있는 능력은 수많은 식물의 식물 호스트 식민지 40 병원균 및 임상 상황에서, 바이오 필름은 항균제 (21)에 본질적으로 저항력이 많은 영구와 만성 세균 감염의 핵심이다 증가한다. 또한, 지금은 제거하기가 매우 어렵고 (41)를 제어로 바이오 필름은 업계에 큰 비용 의미를 가지고 있음을 인정한다. 따라서, 미생물 생물막 억제제의 연구를 위해 실험적인 프레임 워크를 개발하는 것은, 농업 42,43 중요한 21,44 임상 적, 기술적 45-47 발전을 제공 할 것입니다.
현재의 방법은 B. 제한됩니다 서브 틸리 스. 우리는뿐만 아니라 다른 종의 바이오 필름 고유의 작은 분자 억제제를 공부 설명 양적, 질적 개념을 다음 바랍니다. 게다가 본 연구는 D-류신에 의한 생물막 억제에 대한 구체적인 예에 관한 몇 가지 특정 생물막 억제제에서 이전에 17 일 발표했다. 중요한 것은, D-류신은 이미 식물 식민지 및 biofilm 형성 사이의 가능한 유사성을 제시, 식물 병원균 크 산토 모나스 citri 48 항 생물막 분자 특징했다. 바이오 필름 형성 (펠리클과 주름이 콜로니 형성)도 일반적인 인간의 병원체 (예, 녹농균 및 49-51 uropathogenic 대장균 52, 53). 설명 된 방법은 바이오 필름 형성을 억제 및 임상 연구에서 항 미생물제에 생물막 매개 저항을 저감 특정 약물을 검색하도록 더 개발 될 수있다. 전반적으로, 여기에 기재된 방법은 다른 종에서 생물막 특정 소분자 억제제 공부 양적 및 질적 개념을 개발하는 기초로서 이용 될 수있다.
NT는 "> 요약하면, 우리는 생물막 억제제를 연구 B. 서브 틸리 스를 사용하여 잠재적 인 장점과 함정을 보여줍니다 간단하고 유용한 도구 상자를 제공합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
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