Introduction
Flercellede bakteriesamfunn spille viktige roller i naturlige og menneskeskapte miljøer, og kan være gunstig eller meget skadelig. Disse flercellede kolonier er kjent som biofilm, hvor de enkelte cellene er innebygd i en egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS) matrise. EPS sterkt holde cellene til overflaten de kolonisere. De fungerer som et skjold mot mekaniske og kjemiske krefter og skape nær kontakt mellom nabocellene, tilrettelegging for mobil kommunikasjon 1. En biofilm kan sees på som et differensiert samfunn, der cellene bruker svært regulert, orkestrert prosesser for å samordne sine aktiviteter i samfunnet, samt over arter 2-5. Overgangen fra en planktoniske, frittlevende modus for vekst til en biofilm tilstand er ofte forbundet med utviklingsmessige prosesser. Et godt eksempel er de Gram-positive jord bakterien Bacillus subtilis, og derfor en helst undomesticated belastning fungerer som en robust modell organisme for å studere utviklingsstadier som fører til biofilmdannelse. I denne bakterien, bevegelige celler organisere seg i iøynefallende flercellede strukturer som utfører spesialiserte oppgaver 4. En gruppe av celler, matrise-produsenter utskille exopolysaccharides 6, den amyloidprotein TASA 7,8, og overflaten hydrofobisitet proteinet BslA 9,10; som alle deltar i sammenstillingen av EPS 11-13.
Gitt overflod av biofilm i naturlige og menneskeskapte nisjer og den antatte dødelig skade de kan forårsake, er det et stort behov for å finne måter å hindre deres dannelse. Lavmolekylære inhibitorer kan hjelpe i oppdagelsen av nye regulatoriske trasé, enzymer og strukturelle proteiner involvert i biofilmdannelse, og dermed fremme innsikt i de komplekse prosesser av flercellet samfunnet forsamlingen. Som B. subtilis er et godt studert modell for biofilmdannelse 14,15, kan det brukes til å vurdere effekten av ulike biofilm hemmere. Denne studien takler fire grunnleggende metoder som er viktige for å vurdere responsen av biofilm til små molekyl hemmere. Først, for å sikre at disse inhibitorene har en biofilm-bestemt mål, er separasjon av effekten på planktoniske vekst fra effekten på biofilmdannelse kritisk. De fleste antibakterielle midler målrette celler i sin planktoniske vekstfase, men molekyler som er rettet mot biofilm livsstil er sjeldne. I tillegg, som molekyler som ikke påvirker planktoniske vekst ikke er giftige, kan de redusere selektivt trykk som favoriserer antibiotika resistente mutanter 16. For eksempel, når biofilmer er behandlet med D-aminosyrer eller visse andre cellevegg-forstyrrende molekyler, er de enten forstyrret eller demontert, men disse inhibitorene bare mildt påvirke planktoniske vekst 12,17. I kontrast til mange antibiotika dramatisk svekke planktoniske vekst, med little eller ingen effekt på biofilmdannelse 17.
For det andre, etablere en konsistent og robust rammeverk eksperimentelt for å studere effekten av de små molekyler er avgjørende. Vi har observert at den aktive konsentrasjonsområdet av lavmolekylære inhibitorer var følsomme for pre-kulturbetingelser og til det eksperimentelle oppsettet som brukes for å studere effekten av disse lavmolekylære inhibitorer. Ulike rapporter, spesielt de som studerer B. subtilis, avslørte variasjoner i konsentrasjonsområdet ved hvilket D-aminosyrer hemmer dannelsen av pellicles - de flytende bakterielle biofilmer 12,17-19. Resultatene presentert her antyder at de følgende faktorer ta hensyn til forskjeller i den aktive konsentrasjonsområdet: pre-dyrkningsbetingelser (logaritmisk 12,17 versus sene stasjonære vekstfase 20), vekstmediet som brukes i den pre-kulturen tilstand (rik, undefined [Luria buljong, LB] versus definert [mononatriumglutamat-glycerol, MSgg]), inokuleringen forholdet og spesielt fjerning av pre-kulturmediet før inokulasjon. Temperaturen av statiske hinne vekst viste en mindre viktig rolle i aktiviteten rekkevidde av den lille molekyl-inhibitor D-leucin, et representativt D-aminosyre anvendt i denne studien.
Til slutt, når biofilmer behandles med spesifikke biofilm-inhibitorer, robuste og informative metoder er nødvendig for å karakterisere virkningene av disse inhibitorene i biofilm kondisjon. Her er to metoder for uavhengig å karakterisere virkningen av lavmolekylære inhibitorer beskrevet i detalj: (1) Effekten på enkeltceller i løpet av en biofilm koloni og deres motstand mot antimikrobielle midler. Celler i biofilmer vanligvis er mer resistente mot antibiotika i forhold til frittlevende bakterier 21-23. Selv om dette fenomen er multifaktoriell, ble evnen til EPS for å redusere antibiotika penetrering ofte betraktet som en tiltalende forklaring 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vurdere effekten av små molekyl hemmere på pellicle og Biofilm Colony Formation
- Forbered en 2x løsning av definert biofilm-induserende MSgg medium 25 uten kalsiumklorid og jern (III) klorid heksahydrat. Etter filter sterilisering, legger kalsiumklorid. Mediet er klar til bruk direkte eller den kan lagres ved 4 ° C i mørket.
- Forbered 1x MSgg fortynning på dagen for forsøket.
- Fortynn 2x MSgg medium til 1x med sterilt destillert vann (pellicles) eller sterilt 3% varm (80 ° C) agar (biofilm) og tilsette jern (III) kloridheksahydrat til en sluttkonsentrasjon på 50 pM (pellicles) eller 250 pM ( biofilm). Legg antibiotika eller lavmolekylære inhibitorer til den ønskede konsentrasjon og bland godt. For eksempel, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM D-leucin i 30 ml for å etablere pellicles eller biofilmer, tilsett 196,6 ul av en 76,3 mM (10 mg / ml), D-leucin stamløsning.
NEITE:. Den endelige 1x MSgg preparat er beskrevet i Tabell 1. Sammenlignet med den opprinnelige oppskriften 25, mediet inneholdt 50 ug / ml treonin og jernkonsentrasjonen til å vokse biofilm kolonier på fast medium MSgg ble øket 2,5 ganger for å optimalisere rynket kolonimorfologi .
- Fortynn 2x MSgg medium til 1x med sterilt destillert vann (pellicles) eller sterilt 3% varm (80 ° C) agar (biofilm) og tilsette jern (III) kloridheksahydrat til en sluttkonsentrasjon på 50 pM (pellicles) eller 250 pM ( biofilm). Legg antibiotika eller lavmolekylære inhibitorer til den ønskede konsentrasjon og bland godt. For eksempel, for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM D-leucin i 30 ml for å etablere pellicles eller biofilmer, tilsett 196,6 ul av en 76,3 mM (10 mg / ml), D-leucin stamløsning.
- Etter størkning av agar, tørke solide MSgg platene i en biologisk hette for 30-45 min før vaksinasjonen.
- For å velge spesifikke hemmere som forstyrrer mekanismene for pellicle dannelse (figur 1), utelukke at konsentrasjonene brukt påvirke planktoniske og statisk vekst.
- Avgjøre planktoniske vekst (økning i optisk tetthet over tid i flytende kultur) i en enkel vekstkurve ved å måle den optiske tettheten ved 600 nm hver time inntil den stasjonære vekstfase.
- For å bekrefte at den målte kultur turbiditet representerer levende celletall, bestemme antall kolonidannende enheter (CFU)av celler i de planktoniske vekstfase fra en ristekultur etter flere tidspunkter.
- For å vurdere effekten av lavmolekylære inhibitorer for statisk hinne vekst, høsting celler ved slutten av en 3-dagers inkubasjon ved 23 ° C fra en 24-brønners celle-kulturbrønn, inokulert under de samme betingelser som beskrevet i avsnitt 1,7-1,9 og bestemme CFU. For denne kontrollen, kan du bruke en pellicle-mangel stamme som mangler operoner som koder for de ekstracellulære matrikskomponenter (dvs. B. subtilis Δ epsH, Δ TASA).
NB: Denne stamme er i stand til å vokse under statiske betingelser, men i motsetning til en hinne-dannende villtype, er det mangelfull i evnen til å flyte til væske-luftgrensesnittet, hvor veksten er foretrukket på grunn av økte oksygennivå 26. Således, denne ekstracellulære matrise og hinne-manglende stamme er en anbefalt referansestamme for å vurdere veksten under statiske betingelser.
MERK: For spesifikkrikelig av den ikke-kanonisk D-aminosyre D-leucin som er beskrevet nedenfor, en effekt på planktoniske og statisk vekst ved konsentrasjoner som interfererte med hinne dannelse ble utelukket 12,17. Metodene for å bestemme planktoniske og statisk vekst er beskrevet i detalj 17.
Figur 1. Konseptuell oversikt for identifisering av en robust eksperimentelle oppsettet for å vurdere den spesifikke hemmingen av biofilmdannelse. Utvalgskriteriene for små molekyl hemmere som indikerer spesifikke inngrep i biofilmdannelse uten tydelig effekt på planktoniske vekst. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
- Streak ut B. subtilis fra en -80 ° C lager (LB Culture av 10 9 celler / ml frosset i 20% glyserol) for å isolere enkeltkolonier på en LB-1,5% agar-plate med en steril spiss eller applikator pinne.
- Vokse over natten ved 30 ° C.
- Kritisk trinn: For en robust hinne hemning av den ikke-kanonisk D-aminosyrer så som D-leucin, vokser en enkelt koloni plukket fra LB-1,5% agar plate i 3 ml LB-næringsløsning ved 37 ° C i 4 timer i en risteinkubator (ristehastigheten 200 rpm). Sett på LB-næringsløsning med biofilm-induserende MSgg medium før inokulering ved sentrifugering av 1,5 ml starterkultur i 4 minutter ved 6000 xg, forsiktig fjerning av supernatanten og re-suspendering av pelleten i 1,5 ml MSgg medium. Resten av kulturen kan kastes.
Viktig: For å sikre robustheten av systemet, skal den optiske tetthet ved 600 nm (OD 600) av den vaskede startkulturen være mellom 0,6 og 1. - Under veksten av startkulturen fremstille en 12-brønners celle-kulturplaten som in multidishg 3 ml MSgg medium uten eller med et konsentrasjonsområde av den lille molekyl-inhibitor (for eksempel 0,3, 0,5, 1 mM D-leucin 17). For å utelukke kanteffekter, fordele plassering av de forskjellige konsentrasjoner over multidish platen. Alternativt kan du bruke 24-brønns cellekultur multidish plater som inneholder 1,5 ml MSgg medium.
- Inokulere brønnene i 12-brønners celle-kultur multidish plate med 3 ul av den vaskede startkulturen (1: 1000 fortynning).
MERK: En lavere fortynningsforholdet, dvs. 1: 500 kan brukes. Dette reduserer utviklingstiden av pellicles. - Vokse pellicles ved 23 ° C under statiske betingelser i tre dager. Ikke flytt pellicles løpet av denne tiden, så det kan påvirke den endelige overflaten morfologi hinne.
- Acquire bilder med en kikkert og homogen eksponering av lyn. Alternativt kan du ta et bilde av pellicles med et kamera med høy oppløsning. For å unngå gjenstander som skyldes inconsistelt lys vinkler og skygger, ta topp-ned bilder med kameraet festet på et stativ og bruke en myk og stor lyskilde 45 ° fra begge sider.
MERK: En alternativ metode for å studere B. subtilis multicellularity er biofilmen kolonien analysen på solid, biofilm-induserende MSgg medium. Som pellicles, gjør denne analysen studiet av tid og rom prosesser. Når det aktive området lavmolekylære inhibitorer er bestemt, kan deres virkning på biofilm kolonidannelse skal studeres. - For å vokse biofilm kolonier, symmetrisk øye på 1,5 mL av den uvaskede pre-kultur (trinn 1.7) på det tørkede MSgg 1,5% agar plate ved hjelp av en mal - 4 dråper pr Petri-skål med 8,5 cm diameter. La dråpene adsorberes til platen før flytte dem.
MERK: Malen bidrar til å få en lik fordeling av biofilm koloniene innenfor området hvor cellene er dyrket. For å forberede malen, tegne det totale arealet av veksten på originale skalaer, dele den til lik sektORS og markere sentrum. For en runde petriskål på 8,5 cm diameter, tildeler denne 14 cm 2 til en biofilm koloni. - Platene inkuberes ved 30 ° C i tre dager. I løpet av denne tiden, biofilm kolonier utvikle og danne en tre-dimensjonal, rynket struktur.
- Ta bilder som i trinn 1.11.
2. Etanol Resistance analysen
- Grow biofilm som beskrevet i trinn 1,1-1,7 og 1.12-1.14.
- Etter 68 timers vekst ved 30 ° C, kuttet biofilm koloniene i to like deler ved hjelp av et barberblad og malen.
Figur 2. Eksempel eksperimentell design for å vurdere motstanden av biofilm koloni celler til steriliseringsmidler. (A) Mal anvendes for lik fordeling av biofilm kolonier over en petriskål og for skjæring. (B)Topp-ned bilder av ubehandlet villtype biofilm dyrket i 68 timer på solid, definert biofilm-induserende MSgg medium ved 30 ° C. Utvidelsen viser hvordan en biofilm koloni kan bli kuttet i to like deler. (C) De to like halvdeler biofilm blir behandlet likt (kontroll, PBS) eller med enten PBS eller steriliserende middel og behandlet som beskrevet. Skala:. 1 cm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Løft forsiktig hver halvdel av biofilm koloni fra agar-plate med en liten spatel og flytte den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 500 ul av fosfatbufret saltvann (PBS). Om nødvendig kan skrape de gjenværende cellene fra platen og overføre dem til mikrosentrifugerør i tillegg.
NB: Den andre halvdelen av biofilmen kolonien er behandlet forskjellig, avhengig av om det er kontroll eller for å teste motstanden mot klorLizing agenter. - For kontrollen, inkubere den andre halvdel av biofilm kolonien i 500 ul PBS som i trinn 2.3. For å vurdere motstand mot steriliseringsmidler, overføre andre halvdel av biofilm kolonien til 500 mL 50% (v / v) etanol.
MERK: Alternativt steriliserende midler slik som natriumhypokloritt kan anvendes. For alle steriliseringsmidler anvendes, bestemme aktiv konsentrasjon og inkubasjonstid i et innledende eksperiment. - Inkuber biofilm koloniene i 10 minutter på en benk-topp ved romtemperatur.
- Sentrifuger biofilm koloniene i 5 min ved 18 000 xg og fjern supernatanten forsiktig med en pipette. Tilsett 300 ul PBS.
- Sonicate cellene mildt (amplitude 10%, puls 5 sek) med mikrotip av en ultralyd.
MERK: ultralyd energi må være tilstrekkelig til å skille biofilm aggregater. Imidlertid kan for harde lydbehandling lysere cellene. Bekrefte på forhånd ved lysmikroskopi at sonication energibrukes, ikke lysere cellene, og at alle aggregater blir oppløst. - Legg 700 ul av PBS til et sluttvolum på 1 ml. Utføre en seriell fortynning (til 10 -7) i PBS og spre 100 ul av 3 fortynninger på LB-1,5% agar plate ved hjelp av sterile glasskuler.
Merk: De optimale fortynninger som skal bli belagt bør bestemmes i et innledende forsøk, da dette avhenger av mengden av celler i biofilm koloni av interesse og overlevelse av cellene i respons til steriliseringsmiddelet. - Platene inkuberes over natten ved 30 ° C, telle CFU og bestemme CFU / ml. Fra den endelige CFU / ml av hver halvbiofilm koloniene, beregne prosentandelen av overlevende.
MERK: Når utført og analysert som beskrevet, de to halvdelene av styre biofilm kolonien og den ubehandlede versus etanol-behandlede halvdel av den ubehandlede biofilm kolonien bør gi forskjeller under 10% i levedyktige celletall, som bekrefter symmetri eller motstanden av kolonien , respectively. Alternativt kan resultatene være representert i total CFU. Celle tellinger av kontroll og ubehandlede biofilm koloni bør forbli i den samme størrelsesorden. I motsetning til dette blir de celletellinger av etanol-behandlede halvdel av et lite molekyl-behandlede biofilm koloni forventet å falle med minst to størrelsesordener i krav for en øket følsomhet for steriliseringsmiddelet.
3. Biofilm Colony Prøvepreparering for Scanning elektronmikroskopi
- Grow biofilm kolonier som beskrevet i trinn 1,1-1,7 og 1.12-1.14.
- Fremstille en ny ladning med 2% (v / v) glutaraldehyd, 3% (v / v) paraformaldehyd oppløsning i 100 mM natriumkakodylat, 5 mM kalsiumklorid, pH 7,3. Forbered 5 ml fiksativ for hver petriskål på 8,5 cm diameter.
FORSIKTIG: glutaraldehyd og paraformaldehyde er farlig. Håndtere dem med sikkerhetsutstyr inne i en kjemisk hette. Kast løsninger og forurensede materialer til hazfarlig avfall. - legge nøye fiksativ til biofilm kolonier, uten utlevering direkte på toppen av biofilm.
MERK: På grunn av den hydrofobe karakter av biofilm koloni, koloniene sakte løsner fra agar og begynner å flyte. - Nøye forsegle platene med en strimmel parafilm. Inkuber på en rotasjonsrister i 2 timer ved romtemperatur og deretter overføre platene til 4 ° C over natten.
- Den neste dag, forsiktig fjerne væske med en Pasteur-pipette glass som er koblet til en vakuumpumpe.
- Tilsett forsiktig 10 ml 100 mM natriumkakodylat, 5 mM kalsiumklorid buffer for å vaske biofilmen og inkuberes i 5 min. Fjern forsiktig væsken med Pasteur glass pipette fra hjørnet av platen for å unngå skade på biofilm og tilsett frisk vaskeløsning ved forsiktig pipettering. Gjenta dette trinnet en gang.
- For dehydrering av biofilm kolonier, fortsetter du med følgende trinn: 2x 5 min i DDH 2 O; 2x 20 min i tre0% etanol; 2 x 20 min i 50% etanol; 2 x 20 min i 70% etanol; 2 x 20 min i 96% etanol; 2x 30 min i 100% etanol.
- Tilsett 15 ml væske for hver petriskål med en diameter på 8,5 cm i hvert trinn og fjerne væsken omhyggelig etter hver inkubasjon.
- Benytte en av to forskjellige metoder for tørking av prøvene fra etanol.
- For lufttørking fra etanol:
- Skjær en cellulosefilterpapir (diameter på 9 cm) i kvartalene. I korthet senk ett kvartal på 100% etanol, og deretter forsiktig overføre en flytende biofilm koloni på den. Sette den våte filterpapir i en Petriskål utforet med et filterpapir. Dekk til petriskål og la biofilm kolonier tørke over natten i en kjemisk hette.
- For kritisk punkt (CP) -drying bruker karbondioksid (CO 2) som overgangen væske:
- Fylle 75% av det kritiske punkt tørkemaskin kammer med 100% etanol. Overfør prøvene inn i en holder, hver prøve inn i sin egen cHamber. Om nødvendig, kutt biofilm med saks i mindre biter. La prøvene neddykket i etanol under all håndtering. Deretter overfører holderen inn i kammeret og lukker kammeret tett.
- Avkjøl kammer til 7 ° C og begynner å omrøring. Fylle kammeret helt med flytende CO2. I løpet av en 7 minutters inkubasjon tid, la etanol blandes med CO 2. Deretter, slippes ut 25% av oppløsningen.
MERK: Ikke tøm kammeret under nivået av prøven. - Gjenta trinn 3.8.2.2 fire ganger.
- Gjenta trinn 3.8.2.2 fem ganger med en inkubasjonstid på 5 min bare. Endelig bør etanolen bli fullstendig erstattet av CO 2.
- Under den siste runden, tom bare 5% av kammeret. Slå av omrøring og kjøling. Begynne oppvarming av kammeret til 42 ° C. Ved en temperatur på 31,1 ° C og et trykk på 73,9 bar, når den flytende CO2 sitt kritiske punkt, jo tilstand hvor den gassformige phase har den samme densitet som den flytende fase av oppløsningsmidlet 27. Når temperaturen når 42 ° C, inkuber i 10 min. Ved 42 ° C, CO 2 i kammeret eksisterer som superkritisk gass.
MERK: Stadig sjekke trykket i kammeret. Trykket bør ikke overstige 120 bar ved 42 ° C. - Begynn å sakte slipper gassen med kontinuerlig oppvarming. Dette holder prøvene i CO 2-gass fase og hindrer deformasjon av prøven morfologi gjennom væskeoverflatespenning. Sett strømningsmåleren til 5 liter / time ved å finjustere doseringsventilen styrer målere. Vent inntil alt trykket i kammeret frigjøres. Nå åpner kammeret og ta prøvene nøye fra holderen.
- For lufttørking fra etanol:
- Coat et elektron mikros spire med karbon tape. Med hjelp av pinsett, nøye overføre biofilm kolonier på stubben. Koble hver koloni til stubben ved å legge en tynn bro fra bilbon båndet, noe som er avgjørende for ladning eliminering under elektronstrålen. På dette stadiet, håndtere biofilm kolonier med omsorg som de er svært skjør. Oppbevar prøvene i en eksikator i minst 24 timer eller inntil undersøkelse.
- Den eksamensdagen med scanning elektronmikroskop, frese-coat biofilm kolonier for 2 min i en 60 ° vinkel i en gull-palladium frese-coater. Gjenta dette trinnet to ganger og roter prøvene ved 120 ° i mellom. På slutten, frese-coat prøvene en gang i 3 minutter fra toppen. Den 20 nm tynt lag av gull-palladium forbedrer ledningsevne og forbedrer kontrasten i utvalget for bildebehandling i SEM.
- Oppbevar prøvene i en eksikator for å unngå utvanning av prøven 28 før avbilding med et scanning elektronmikroskop 29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pellicle analysen er en metode for å studere strengt regulerte og dynamiske prosesser av B. subtilis multicellularity. I tillegg til dette er pellicle analyse egnet for å teste en rekke av enten pre-startforhold eller små molekyl-konsentrasjoner i en enkelt celle-kultur multidish plate i ett eksperiment. Imidlertid B. subtilis pellicle formasjonen er følsom for pre-dyrkingsbetingelsene (for eksempel vekstmedium av pre-kulturen og dens vekstfase), inokuleringen forholdet og fjerningen av den pre-kulturmediet. Vi vil derfor først vist for et eksperimentelt oppsett som tillater oss å gjengi pellicle hemming av D-leucin. Våre resultater viser at reproduserbare hinne inhibering av D-leucin kan oppnås dersom cellene er pre-dyrket i udefinert, rik LB-medium til en midt-logaritmisk vekstfase (enkelt koloni i 3 ml LB ved 37 ° C i 4 timer med risting ), spunnet ned og re-suspendert i definerte MSgg medium før en 1: 1000 inoculation (figur 3A). Når cellene ble dyrket i MSgg medium til den midt-logaritmiske vekstfase (enkelt koloni i 1 ml LB i 2 timer, re-fortynnet 1: 100 til 3 ml MSgg, og dyrket i 5 timer ved 37 ° C med risting ved 200 rpm), ble fjerning av pre-kulturmedium ikke har en effekt på D-leucin-aktivitet. Celler dyrket til stasjonær vekstfase (enkelt koloni i 1 ml LB i 2 timer, re-fortynnet 1: 100 til 3 ml MSgg, og dyrkes for opp til 20 timer i en valse ved værelsestemperatur) og vasket i MSgg medium før vaksinasjonen var mindre sensitive. Imidlertid kan denne økningen i motstand mot pellicle inhibering effekten av D-leucin være på grunn av høyere celletetthet av pre-kulturen, noe som øker inokulering forholdet. Inokulering Forholdet mellom pre-kulturen til den statiske vekst i MSgg medium, dvs. 1: 500 eller 1: 1000, påvirket aktiviteten serie av D-leucin og tiden for pellicle utvikling (figur 3B). Pellicle hemming av D-leucin skjeddeved forskjellige veksttemperaturer (23 ° C og 30 ° C, figur 3C). Viktigere, mens følsomheten av celler til D-leucin avhenger av pre-dyrkningsforhold, reproduserbarheten av de fenomener ved forskjellige temperaturer viser at hinne inhibering av den lille molekyl D-leucin har robuste egenskaper.
. Figur 3. Eksempel resultater som viser effekten av ulike pre-dyrkningsforhold på pellicle hemming av D-leucin flere parametere som skal vurderes for å oppnå en robust eksperimentelle oppsettet, inkludert: (A) fjerning av forurensninger fra pre-kulturen vekst medium (ikke vasket versus vasket), vekstmedium av pre-kultur (rik, udefinert LB-medium eller definert biofilm-induserende MSgg medium), og vekst tilstand av pre-kultur (logaritmisk kontra stasjonær vekstfase), (B) inokulering forhold (1: 1000 i forhold 1: 500) av pre-kulturen i den endelige pellicle vekstmedium, og (C) veksttemperatur (23 ° C mot 30 ° C) B.. subtilis NCIB 3610-celler ble dyrket i det medium som er angitt (LB eller MSgg) i 4 timer ved 37 ° C eller ved værelsestemperatur over natten (o / n) med risting, og pre-kulturmedium ble erstattet med MSgg hvis indikert (vasket eller ikke-vasket). Til slutt ble startkulturen ble inokulert 1: 1000 hvis ikke annet er angitt, og pellicles ble dyrket under statiske betingelser ved 23 ° C i tre dager. Top-down bildene ble kjøpt med et kamera. Vel diameter er 22 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter identifisering av pre-dyrkningsforhold og et eksperimentelt oppsett som er tillatt for en reproduserbar aktivitet rekke D-leucin på pellicle formasjon (pre-kultur dyrket i LB til en midt-logaritmisk vekstfase, vasket i MSgg, fortynnet 1: 1000 og dyrket ved 23 ° C i tre dager), ble effekten ble testet for sin robusthet. For dette formål ble aktiviteten av D-leucin på hinne dannelsen undersøkt i forskjellige modifiserte MSgg media (figur 4). Aktiviteten serie av D-leucin i hinne inhibering var konsistent i de fem testede medier, og viser at effekten av D-leucin på hinne dannelsen er robust. En lignende tendens ble observert med D-tyrosin, hvor hinne hemning i konsentrasjonen variere opptil 2 pM var konsistent i flere modifiserte MSgg media (lavere jernkonsentrasjon og utskifting av nitrogenkilden med ammoniumklorid eller karbonkilden med glukose, data ikke vist).
Figur 4. Følsomhet for D-leucin forekommer iulike vekstmedier. Vist er topp-ned fotografier av B. subtilis NCIB 3610 pellicles, dyrket under statiske betingelser ved 23 ° C i definert, biofilm-induserende MSgg medium eller i forskjellige modifiserte MSgg media (karbonkilde 0,5% glukose, nitrogenkilde 0,5% (NH 4) 2SO 4, høye jern 250 pM FeCl3, lav glyserol 0,125% glycerol) i tre dager, med unntak av den alternative nitrogenkilde medium (der pellicles ble dyrket i fem dager) enten uten eller med D-leucin ved konsentrasjoner som indikert. Startkulturer ble dyrket i 4 timer ved 37 ° C med risting i udefinert, rik LB medium. Før inokulering ble cellene vasket ved sentrifugering og resuspenderes i den tilsvarende hinne vekstmedium. Starteren kultur ble fortynnet 1: 1000, er det vel diameter 22 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En alternativ metode for å studere B. subtilis multicellularity er biofilmen kolonien analysen på solid MSgg medium. Som pellicles, gjør denne analysen studiet av tid og rom prosesser. Når det aktive området lavmolekylære inhibitorer bestemmes i den hinne-system, kan deres virkning på biofilm kolonidannelse skal studeres. I denne studien ble biofilm kolonier brukt til å vurdere effekten av D-leucin på motstanden av biofilm kolonier til steriliseringsmidler, fordi biofilm kolonier er mindre skjør og på den faste bakgrunn, de er lettere å manipulere. Når biofilm kolonier som ble behandlet med D-leucin er utsatt for 50% etanol i 10 minutter, synker prosentandelen av overlevende celler dramatisk sammenlignet med den ubehandlede fraksjon (figur 5). kan utvikles denne metoden videre for å vurdere effekten av andre lite molekyl hemmere og deres effekt på motstanden mot bakteriedrepende midler (sterilizing midler eller antibiotika).
Figur 5. Eksempel resultatene av ubehandlet eller behandlet biofilm koloni motstand mot en steriliseringsmiddel. Biofilm kolonier av B. subtilis NCIB 3610 ble dyrket på fast, definert medium for 68 timer ved 30 ° C, med eller uten 0,5 mM D-leucin. Etter kutting koloniene i to like halvdeler, ble halvparten ble behandlet med PBS (internkontrollen) og den andre halvparten med 50% etanol eller PBS (kontroll). Etter mild ultralydbehandling, seriefortynning, plating og telling av de kolonidannende enheter, ble prosentandelen av overlevende sammenlignet med den interne kontrollen beregnet. Vist er resultatet av tre uavhengige eksperimenter med gjennomsnitt av to (A) eller tre (B, C) replikerer og deres standardavvik. Vennligst klikk her to vise en større versjon av dette tallet.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) er et kraftig verktøy som kan brukes til å fokusere på den romlige arkitektur biofilm koloni rynker, overflod og lokalisering av EPS og enkelt celle morfologi 31. SEM avbildning krever prøver som kan avbildes under høyvakuum. For å undersøke prøvene under høyvakuum forhold, alle massevannmolekyler har som skal fjernes, og derfor krever SEM avbildning dehydrering av prøven før avbildning. Alternativt kan prøvene bli fotografert under lave vakuumbetingelser i den våte modus ved miljø scanning elektronmikroskopi (ESEM), hvor det hydrerte prøven forsiktig tørket i mikroskopet kammeret. For å evaluere effekten av lavmolekylære inhibitorer for biofilm koloni arkitektur, EPS organisering og cellemorfologi, ble tre forskjellige prøve dehydrering forhold: tørking i mikroskop i henhold til våt mode forhold (ESEM), lufttørket fra et oppløsningsmiddel eller kritisk punkt (CP) -tørket ved bruk av karbondioksid som overgangen fluid. I ubehandlet og D-leucin-behandlede B. subtilis biofilm kolonier ulike hydration turer i henhold til metoden som brukes kunne observeres. Imaging under lave vakuumbetingelser i våt modus ved ESEM satte en meget naturlig tilstand av biofilm kolonien. Imidlertid informasjon om enkelt cellemorfologi og EPS overflod og arkitektur var knappe, som EPS var fremdeles fullstendig hydratisert, og cellene ble innleiret i EPS (data ikke vist). I form av dehydrering, CP-tørking var den strengeste prosedyren. Det fjernet mest strukturelt bundet og massevannmolekyler fra vevet, og står for et volumtap på 30-70%, avhengig av vevet 32. I motsetning til lufttørking bevart bundne vannmolekyler. En embryonisk vev for eksempel mistet 18% av sitt volum etter lufttørking fra det flyktige oppløsningsmiddel etanol og 59% etter CP-tørking 32 (figur 6A) . Biofilm kolonier som var dehydrert med etanol og CP-tørket også bevart sin tredimensjonale struktur, og EPS dukket opp som et edderkoppnett (figur 6C). I lufttørket og CP-tørkede prøver, effekten av de små molekyl-inhibitor D-leucin i biofilm-koloni-arkitektur, var den eneste cellemorfologi og EPS struktur tilsynelatende (figur 6B og D). Biofilm-koloniene som dyrkes i nærvær av D-leucin var mindre og rynkene var mindre uttalt. D-leucin-behandlede celler ble langstrakt, en fenotype som er observed i celler behandlet med cellevegg-målsøkende molekyler 33. I tillegg ble cellene klart mindre dekket med EPS og ikke tett forbundet med sine naboceller via EPS som vist i de ubehandlede biofilm kolonier. De presenterte resultater viser at begge metoder for biofilm koloni dehydrering, lufttørket fra etanol eller CP-tørket ved anvendelse av karbondioksid som overgangs fluidet gi verdifull innsikt om virkningen av små molekyler på enkelt celle morfologi, så vel som på EPS overflod og arkitektur.
Figur 6. Små molekyler kan endre store og små skala fra biofilm koloni arkitektur. Biofilm kolonier av B. subtilis NCIB 3610 voksen (A og D) i fravær eller (B og D) i nærvær av 0,5 mM D-leucin i 72 timer ved 30 ° Cpå fast MSgg medium ble fiksert som beskrevet i protokollen og tørket fra etanol som følgende: (A og B) lufttørket og (C og D) CP-tørket ved anvendelse av karbondioksid som overgangen fluid. Vist er toppen og ned kikkerten bilder av biofilm kolonier (venstre, øvre paneler), ovenfra og ned fotografier av tørkede biofilm kolonier montert på elektronmikroskopi stubber før gull-palladium-belegg (venstre, nedre paneler), lav og høy forstørrelse bilder ervervet av SEM å vise 3D-arkitekturen i biofilm koloni rynker eller én celle morfologi / EPS organisasjon. Skala barer fra venstre til høyre. 5 mm, 100 mikrometer, 2 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1.925 mm | gryteassium fosfat enverdig |
| 3.075 mm | kaliumfosfat dibasisk |
| 100 mm | 3- (N -morpholino) propansulfonsyre, pH 7,1 |
| 2 mm | magnesiumkloridheksahydrat |
| 700 mikrometer | kalsiumklorid vannfri |
| 50 mikrometer en | jern (III) kloridheksahydrat |
| 125 mikrometer b | |
| 1 mikrometer | sinkklorid vannfri |
| 2 mikrometer | tiamin hydroklorid |
| 50 ug / ml | tryptofan |
| 50 ug / ml | fenylalanin |
| 50 ug / ml | treonin |
| 0,5% (v / v) | glyserol vannfri |
| 0,5% (vekt / volum) | L-glutaminsyre monosodium salter hydrat |
| en for pellicle analyse, b for biofilm analyse | |
Tabell 1. Slutt 1x MSgg blanding anvendt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacillus subtilis former robuste og svært strukturerte biofilm både i flytende (pellicles) og på fast medium (kolonier). Derfor fungerer den som en ideell modell organisme for å karakterisere virknings av spesifikke biofilm hemmere. På faste medier, cellene danner flercellede strukturer med særpreg som ikke er tydelig i pellicles, som rynker som stråler ut fra sentrum til kanten. Dermed pellicles og kolonier er komplementære systemer for å studere B. subtilis multicellularity.
Målet med denne studien er å utvikle en B. subtilis modellsystem for biofilm (pellicles og kolonier) inhibering. Flere trinn er kritisk for reproduserbarheten av biofilm forstyrrelse essay. Et første viktig skritt er å bekrefte at effekten på biofilmdannelse er ikke på grunn av en generell toksisitet for bakterier dyrket i planktoniske livsstilen. Dette kan betraktes ved å sammenligne effekten av en gitt konsentrasjon av såmall-molekyl-inhibitor på den relative biofilmen inhibering av effekten av dette molekyl på planktoniske vekst. En betydelig sterkere effekt på biofilm utvikling kan sikre identifisering av mål-mekanismer som er spesielt viktig for utviklingen av biofilm. Videre viser de her beskrevne undersøkelse betydningen av de pre-kulturbetingelser for utvikling av pellicles og deres følsomhet for små molekyler. Før karakteriserer virkningen av små molekyler, reproduserbare og robuste eksperimentelle betingelser (f.eks hinne vekst temperatur og mangel på følsomhet overfor media preparat) for å teste deres virkninger må defineres. For å finne slike forhold, mediene av pre-kulturen tilstand, vekstfasen av de pre-kultur, pre-kulturmedium for fjerning, vekst temperatur og vekstmedier bør vurderes.
En hovedutfordring, når en spesifikk inhibitor for biofilmdannelse blir funnet, er å finne kvantitativog kvalitative metoder som karakteriserer virkningen av disse lavmolekylære inhibitorer for biofilm utvikling og bestandighet. Her er to viktige metoder som er beskrevet i detalj som kan anvendes for å vurdere effektene av slike inhibitorer. Først, innfører vi en enkel kvantitativ metode som kan reproduserbart undersøke motstanden av behandlede versus ubehandlede kolonier biofilmer til baktericider, slik som etanol. Representative resultater er vist for følsomheten av D-leucin-behandlede biofilm kolonier til 50% etanol. Imidlertid kan dette essayet enkelt endres ved hjelp av ulike steriliseringsmidler eller antibiotika. For det andre er et SEM-fremgangsmåten beskrevet i detalj som gir høy oppløsning undersøkelse av forandringene i biofilmen kolonien forårsaket av lite molekyl-inhibitor i flere sammenfallende plan: den samlede strukturen, organisering og overflod av EPS-matrise og dens komponenter, og den encellede morfologi hele biofilm. Vi merker oss at to metoder for dehydratipå (lufttørking fra 100% etanol eller CP-tørking ved bruk av karbondioksid som overgangen væske) kan brukes like under SEM prøvepreparering av en biofilm koloni. Viktigere den vellykkede fiksering av biofilm prøven avhenger i stor grad av hydrofobisitet av biofilm kolonien. Dette hydrofobi er et karakteristisk trekk ved B. subtilis biofilm på grunn av det hydrofobe overflatelaget 10,34.
Flere tilnærminger ble tidligere brukt til å studere biofilm montering og utvikling med B. subtilis som modellorganisme 35. En rekke uavhengige studier viser effekten av media sammensetning på biofilm utvikling 36-38. Så langt er imidlertid en systematisk evaluering av effekten av media sammensetning på biofilm hemming var, til det beste av vår kunnskap, mangler. Denne studien viser at mens pellicle hemming av B. subtilis ved små molekyler er følsom for pre-dyrkningsforhold, er det unaffected av effekten av temperatur og media sammensetning, og dermed nyttig for systematiske skjermer av små molekyl hemmere. Også etablerte vi en enkel, reproduserbar og kvantitativ metode for å vurdere holdbarheten av ubehandlet eller lite molekyl hemmer behandlet biofilm kolonier til antibakterielle midler, som for tiden mangler i biofilm modellorganisme B. subtilis.
B. subtilis biofilm i kombinasjon med fluorescerende reportere kan tas videre for å lete etter små molekyl hemmere som er rettet mot enten et bestemt utviklingstrinn av biofilmdannelse eller en bestemt sub-populasjon av celler i biofilm. De heri beskrevne fremgangsmåter gir ikke enkelt celle oppløsning i form av genekspresjon i biofilm. Metoder for EPS matrise genekspresjonsanalyse innen B. subtilis biofilm på celle-nivå ble etablert vellykket 39.
Bakterielle biofilmer er av crucial betydning i landbruket, industrielle og kliniske settinger. I et jordbrukssammenheng, evnen til å danne biofilmer øker plantevert koloniseringen av en rekke plantepatogener 40, og i en klinisk sammenheng, biofilmer er naturlig resistente overfor antimikrobielle midler 21 og er ved kjernen av mange vedvarende og kroniske bakterielle infeksjoner. I tillegg er det nå erkjent at biofilm har store kostnadsmessige konsekvenser til industrien som de er svært vanskelig å fjerne og kontrollere 41. Dermed vil utvikle en eksperimentell rammeverk for studiet av mikrobielle biofilm inhibitorer gi betydelige landbruks 42,43, 21,44 kliniske, og teknologiske fremskritt 45-47.
De nåværende fremgangsmåter er begrenset til, B. subtilis. Vi oppfordrer følge de beskrevne kvantitative og kvalitative begreper for å studere biofilm spesifikke lite molekyl hemmere i andre arter også. I tillegg Denne studien er relatert til et spesifikt eksempel for biofilm inhibering av D-leucin, ut av flere spesifikt biofilm inhibitorer tidligere 17 publisert. Viktigere, D-leucin ble allerede karakterisert som et anti-biofilm-molekylet i anlegget patogen Xanthomonas citri 48, presentere mulige likheter mellom plantekoloniseringen og biofilmdannelse. Biofilmdannelse (pellicle og rugose kolonidannelse) er også vanlig i humane patogener (f.eks, Pseudomonas aeruginosa 49-51 og uropathogenic Escherichia coli 52,53). De beskrevne metoder kan videreutvikles for å søke etter bestemte legemidler som hemmer biofilmdannelse og reduserer biofilm-mediert resistens mot antimikrobielle midler i klinisk forskning. Generelt kan de metoder som er beskrevet her anvendes som en basis for å utvikle kvantitative og kvalitative konsepter for å studere biofilm-spesifikk lavmolekylære inhibitorer i andre arter også.
nt "> I sammendraget, gir vi et enkelt og nyttig verktøy-boksen som viser potensielle styrker og fallgruver ved bruk av B. subtilis å studere biofilm hemmere.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
