Introduction
Многоклеточные бактериальные сообщества играют важную роль в природных и техногенных средах, а также может быть полезным или очень вредным. Эти многоклеточные колонии известны как биопленки, в которых отдельные клетки погруженных в матрицу собственного производства внеклеточных полимерных веществ (EPS). САЭ сильно слипание клеток к поверхности они колонизировать. Они служат в качестве защиты от механических и химических сил и создать тесный контакт между соседними клетками, что способствует сотовой связи 1. Биопленка можно рассматривать как дифференцированное сообщество, где клетки используют высоко регулируемом оркестровке процессы для координации их деятельности в рамках сообщества, а также разных видов 2-5. Переход от планктонных, свободно живущих режиме роста до состояния биопленки часто ассоциируется с процессами развития. Хорошим примером может служить грамположительных почвы бактерии Bacillus Сенная, и , следовательно, undomesticated штамм служит надежной модельного организма для изучения стадии развития, приводящие к образованию биопленки. В этой бактерии, подвижных клеток самоорганизуются в заметных многоклеточных структур , которые выполняют специализированные задачи 4. Одна группа клеток, матрично-производители секретируют экзополисахариды 6, амилоидный белок Tasa 7,8, а поверхность гидрофобность белка BslA 9,10; все из которых участвуют в сборке EPS 11-13.
Учитывая обилие биопленок в природных и техногенных нишах и предполагаемый фатальной ущерб, который они могут вызвать, существует настоятельная необходимость поиска путей предотвращения их образования. Малые молекулы ингибиторов могут помочь в обнаружении новых регуляторных путей, ферментов и структурных белков, участвующих в формировании биопленки, и тем самым способствовать понимание в сложных процессах сборки многоклеточного сообщества. Как B. Сенная является хорошо изученным модель для биоформирование пленки 14,15, он может быть использован для оценки влияния различных ингибиторов биопленки. Это исследование решает четыре основные методы, которые являются ключевыми для оценки реакции биопленок на низкомолекулярные ингибиторы. Во-первых, чтобы гарантировать, что эти ингибиторы имеют биопленки конкретной цели, разделение эффекта на планктонных роста от влияния на формирование биопленок имеет решающее значение. Большинство антибактериальных агентов в клетки-мишени в их планктонных фазе роста, но молекулы, которые нацелены на биопленки образ жизни встречаются редко. Кроме того, как молекулы , которые не влияют на рост планктона не являются токсичными, они могут уменьшить селективное давление , благоприятствующую устойчивых к антибиотикам мутантов 16. Например, когда биопленки обрабатывают D-аминокислот или некоторых других клеточных стенок, мешая молекул, они либо нарушены или в разобранном виде , но эти ингибиторы лишь слегка влияют на планктонные 12,17 роста. В противоположность этому, многие антибиотики резко ухудшает планктонный рост, с лittle или не оказывает влияния на формирование биопленок 17.
Во-вторых, создание последовательной и надежной экспериментальной базы для изучения влияния малых молекул имеет решающее значение. Мы наблюдали, что активный диапазон концентраций ингибиторов молекулы малых была чувствительна к условиям предварительной культуры и экспериментальной установки для изучения влияния этих низкомолекулярные ингибиторы. Различные отчеты, в частности , тех , кто изучает B. Сенная, выявлены различия в диапазоне концентраций , при которых D-аминокислоты ингибируют образование Плёночные - плавучие бактериальных биопленок 12,17-19. Результаты , представленные здесь , предполагают , что внимание следующие факторы различия в активном диапазоне концентраций: условия предварительной культуры (логарифмическая 12,17 по сравнению с поздней стационарной фазе роста 20), среда роста , использованный в состоянии предварительной культуры (богатых, не определено [Лурия Бульон, LB] по сравнению с определен [глутамат натрия-глицерол, MSgg]), отношение прививка и особенно удаление предварительно культуральной среде перед инокуляцией. Температура статического роста зубного налета показал менее важную роль в области деятельности малых молекулу ингибитора D-лейцина, репрезентативный D-аминокислоты, используемые в данном исследовании.
Наконец, когда биопленки обрабатывают специфическими ингибиторами биопленки, надежные и информативные методы необходимы, чтобы охарактеризовать влияние этих ингибиторов на биопленки пригодности. Здесь два способа независимо друг от друга характеризуют влияние малых молекулы ингибиторов подробно описаны: (1) Воздействие на отдельные клетки в биопленки колонии и их устойчивость к антимикробным агентам. Клетки в биопленки , как правило , более устойчивы к антибиотикам по сравнению с свободно живущих бактерий 21-23. В то время как это явление является многофакторной, способность САЭ , чтобы уменьшить проникновение антибиотика часто рассматривается в качестве привлекательной объяснения 24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оценка воздействия малых Молекулы ингибиторов на пелликулой и биопленки колонии Формирование
- Приготовьте раствор 2x определенной биопленки индуцирующего среды MSgg 25 без хлористого кальция и железа (III) гексагидрата хлорида. После стерилизации фильтров, добавляют хлорид кальция. Среда готова к использованию непосредственно или его можно хранить при температуре 4 ° С в темноте.
- Готовят разведение 1x MSgg на день эксперимента.
- Развести среду 2x MSgg до 1х стерильной дистиллированной водой (Плёночные) или стерильным 3% горячей (80 ° С), агар (биопленки), и добавить железа (III) гексагидрат хлорида до конечной концентрации 50 мкМ (Плёночные) или 250 мкМ ( биопленки). Добавить антибиотики или низкомолекулярные ингибиторы до желаемой концентрации и хорошо перемешивают. Например, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 мМ D-лейцина в 30 мл установить Плёночные или биопленки, добавить 196,6 мкл 76,3 мМ (10 мг / мл), D-лейцина раствор.
НЕТТЕ:. Окончательный состав 1x MSgg описана в таблице 1 , по сравнению с оригинальной рецептуре 25, среда содержала 50 мкг / мл треонин и железа концентрация расти биопленки колонии на твердой среде MSgg увеличивали 2.5x для оптимизации морщинистой морфологии колоний ,
- Развести среду 2x MSgg до 1х стерильной дистиллированной водой (Плёночные) или стерильным 3% горячей (80 ° С), агар (биопленки), и добавить железа (III) гексагидрат хлорида до конечной концентрации 50 мкМ (Плёночные) или 250 мкМ ( биопленки). Добавить антибиотики или низкомолекулярные ингибиторы до желаемой концентрации и хорошо перемешивают. Например, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 мМ D-лейцина в 30 мл установить Плёночные или биопленки, добавить 196,6 мкл 76,3 мМ (10 мг / мл), D-лейцина раствор.
- После застывания агара, высушить твердые пластины MSgg в биологической капюшоном в течение 30-45 мин до начала прививки.
- Чтобы выбрать специфические ингибиторы , которые мешают с механизмами формирования зубного налета (рисунок 1), исключает, что используемые концентрации влияют на планктонные и статического роста.
- Определить планктонный рост (увеличение оптической плотности с течением времени в жидкой культуре) в простой кривой роста путем не измерения оптической плотности при 600 нм каждый час до стационарной фазы роста.
- Для того, чтобы подтвердить, что измеренная культура мутности представляет собой подсчет живых клеток, определяют количество колониеобразующих единиц (КОЕ)клеток в планктонных фазе роста из качалке культуры после нескольких моментов времени.
- Для оценки влияния низкомолекулярные ингибиторы по статическому роста зубного налета, урожай клеток в конце 3-дневной инкубации при 23 ° С от 24-луночного клеточной культуре хорошо, засевают при тех же самых условиях, как описано в разделах 1.7-1.9 и определяют КОЕ. Для этого контроля, использовать пленочную-дефицитный штамм , который испытывает недостаток оперонов кодирования для компонентов внеклеточного матрикса (т.е. B. Сенная Δ EPSH, Δ Tasa).
Примечание: Этот штамм способен расти в статических условиях, но в отличие от пленочную формирования дикого типа, она испытывает дефицит в способности плавать на поверхности раздела жидкость-воздух, где рост благоприятствуют из - за повышенного уровня 26 кислорода. Таким образом, этот внеклеточный и пелликула различным материалам-дефицитный штамм является рекомендуемым эталонный штамм для оценки роста в статических условиях.
Примечание: Для конкретного эксвполне достаточный из неканонической D-аминокислоты D-лейцина описано ниже, влияние на планктонных и статического роста в концентрациях , которые вмешивались с образованием пелликула был исключен 12,17. Методы для определения планктонных и статического роста подробно описаны 17.
Рисунок 1. Концептуальная обзор для идентификации надежной экспериментальной установки для оценки специфическое ингибирование образования биопленки. Критерии отбора для низкомолекулярные ингибиторы , которые указывают на конкретное вмешательство с образованием биопленок без выраженного влияния на планктонных роста. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
- Серия из B. Сенная от -80 ° C складе (LB cultuповторно из 10 9 клеток / мл , замороженные в 20% глицерина) для выделения отдельных колоний на% агаром LB-1,5 со стерильным наконечником или аппликатора.
- Расти в течение ночи при 30 ° С.
- Важным шагом: Для надежного торможения зубного налета по неканонической D-аминокислоты , такие как D-лейцина, выращивают одну колонию собирали с% агаром-1,5 LB в 3 мл LB - бульоне при температуре 37 ° С в течение 4 часов в встряхивая инкубатор (скорость встряхивания 200 оборотов в минуту). Заменить бульон LB с биопленки индуцирующих MSgg среды перед посевом центрифугированием 1,5 мл закваски в течение 4 мин при 6000 х г, осторожно удаляя супернатант и ресуспендирования осадка в 1,5 мл MSgg среды. Остальная часть культуры могут быть отброшены.
Важно: Для того, чтобы обеспечить надежность системы, оптическая плотность при 600 нм (OD 600) промытого закваски должна быть в пределах от 0,6 до 1. - Во время роста закваски, подготовить 12-луночного клеточной культуры multidish пластины containinг 3 мл MSgg среды без или с диапазоном концентраций от низкомолекулярный ингибитор (например, 0,3, 0,5, 1 мМ D-лейцин 17). Чтобы исключить краевые эффекты, распределить расположение различных концентраций через multidish пластины. Кроме того, использование 24-луночного культивирования клеток multidish пластины, содержащие 1,5 мл MSgg среды.
- Инокулируйте лунки 12-луночного культивирования клеток multidish пластины с 3 мкл промытой закваски (1: 1000 разведение).
Примечание: более низкий коэффициент разбавления, то есть 1: 500 может быть использован. Это уменьшает время разработки из Плёночные. - Расти Плёночные при 23 ° C в статических условиях в течение трех дней. Не перемещайте Плёночные в это время, так как это может повлиять на конечную морфологии поверхности плёнкой.
- Приобретать снимки с помощью бинокулярного и гомогенного воздействия молнии. В качестве альтернативы, возьмите картину Плёночные с камерой высокого разрешения. Чтобы избежать артефактов, вызванных inconsisпалаточные углы света и тени, возьмите сверху вниз снимки с помощью камеры, установленной на штатив и используйте мягкую и большой источник света под углом 45 ° с обеих сторон.
Примечание: альтернативный метод исследования Б. Сенная многоклеточность является анализ колонии биопленки на твердом, биопленки индуцирующего MSgg среды. Как Плёночные, этот анализ позволяет изучение пространственно-временных процессов. После того, как активный диапазон низкомолекулярные ингибиторы определяется, их влияние на образование биопленки колонии могут быть изучены. - Чтобы вырастить биопленки колонии, симметрично пятно 1,5 мкл непромытом предварительной культуры (шаг 1,7) на осушенном MSgg 1,5% агаром с помощью шаблона - 4 капли на чашку Петри диаметром 8,5 см. Пусть капли адсорбировать на тарелку перед их перемещением.
Примечание: Шаблон позволяет получить равномерное распределение биопленки колоний в зоне, где выращиваются клетки. Чтобы подготовить шаблон, нарисовать общую площадь роста в первоначальных масштабах, разделить его на равные сектыПРС и отметьте центр. Для круглого чашку Петри диаметром 8,5 см, Назначает 14 см 2 на одну биопленки колонию. - Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение трех дней. За это время биопленка колонии развиваются и образуют трехмерную структуру, морщинистое.
- Сфотографируйте, как в шаге 1.11.
2. Этанол Сопротивление пробирного
- Grow биопленок, как описано в пунктах 1.1-1.7 и 1.12-1.14.
- После 68 ч роста при 30 ° С, разрезать биопленка колонии на две равные части с помощью лезвия бритвы и шаблон.
Рисунок 2. Пример эксперимента с целью оценки устойчивости биопленки колонии клеток к стерилизующих агентов. (А) используется в качестве шаблона для равномерного распределения биопленки колоний через чашку Петри и для резки. (В)Нисходящий изображения необработанного дикого типа биопленку выращивают в течение 68 ч на твердом, определенной биопленки индуцирующих MSgg среде при температуре 30 ° C. Расширение показывает, как биопленки колонии можно разрезать на две равные половины. (C) две равные половины биопленки рассматривают одинаково (контроль, PBS) или вводили фосфатный буферный раствор или стерилизующего агента и обрабатывали , как описано. Шкала бар: 1 см . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Осторожно поднимите каждую половину биопленки колонии из чашки с агаром с небольшим шпателем и переместить его в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, содержащей 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). При необходимости скрести оставшиеся клетки из пластины и передавать их в микроцентрифужных трубки, а также.
Примечание: вторая половина биопленки колонии обрабатывают дифференцированно, в зависимости от того, является ли он или контроль, чтобы проверить устойчивость к SteriЛИЗИНГ агенты. - Для контроля, инкубировать вторую половину биопленки колонии в 500 мкл PBS, как на стадии 2.3. Для оценки устойчивости к стерилизующих агентов, передавать вторую половину биопленки колонии до 500 мкл 50% (об / об) этанола.
могут использоваться альтернативные стерилизацией агенты, такие как гипохлорит натрия: Примечание. Для всех стерилизующих агентов, используемых, определяют концентрацию активного и инкубационный время в предварительном эксперименте. - Выдержите биопленка колонии в течение 10 мин на стендовом при комнатной температуре.
- Центрифуга биопленки колонии в течение 5 мин при 18000 мкг и осторожно удалить супернатант с помощью пипетки. Добавьте 300 мкл PBS.
- Разрушать ультразвуком клетки слабо (амплитуда 10%, пульс 5 сек) с микроострия из соникатор.
Примечание: Энергия озвучивания должна быть достаточной для отдельных агрегатов биопленки. Тем не менее, слишком суровым Озвучивание может лизировать клетки. Подтвердите заранее с помощью световой микроскопии, что энергия Озвучиваниеиспользуется не лизиса клеток и что все агрегаты растворяются. - Добавьте 700 мкл PBS до конечного объема 1 мл. Выполните серийные разведения (10 -7) в PBS и распространение 100 мкл 3 разведений на% агаром LB-1,5 с использованием стерильных стеклянных шариков.
Примечание: Оптимальные разведений металлизируемые должно быть определено в предварительном эксперименте, так как это зависит от количества клеток в биопленки колонии интереса и выживаемости клеток в ответ на стерилизующего агента. - Инкубируйте пластин в течение ночи при температуре 30 ° C, подсчитывают КОЕ и определяют КОЕ / мл. Из окончательной КОЕ / мл каждого половинных биопленки колоний, вычислить процент выживших.
Примечание: Когда выполняется и анализировали, как описано выше, две половины управления биопленки колонии и необработанных клеток по сравнению обработанной этанолом половину необработанной биопленки колонии должны давать различия ниже 10% в числа живых клеток, проверяя симметрию или сопротивление колонии , respectively. В качестве альтернативы, результаты могут быть представлены в общем КОЕ. Подсчеты клеток контроля и необработанной биопленки колонии должны оставаться в том же порядке величины. В противоположность этому, количество клеток этанола обработанной половины малой молекулы обработанной биопленки колонии, как ожидается, сократится на минимум на два порядка претендовать на повышенную чувствительность к стерилизующего агента.
3. Подготовка образца биопленки колонии для сканирующая электронная микроскопия
- Grow биопленки колонии, как описано в пунктах 1.1-1.7 и 1.12-1.14.
- Готовят свежую порцию 2% (об / об) глутаровый альдегид, 3% (об / об) раствор параформальдегида в 100 мМ какодилате натрия, 5 мМ буфера хлорида кальция, рН 7,3. Подготовка 5 мл закрепителя для каждого чашку Петри диаметром 8,5 см.
ВНИМАНИЕ: Глютаральдегид и параформальдегида опасны. Обращайтесь с ними оборудования для обеспечения безопасности внутри химической капотом. Откажитесь решения и загрязненные материалы в ЗТВотходов для здоровья и взрывоопасных. - Осторожно добавьте закрепитель в биопленки колонии, без дозирования непосредственно поверх биопленки.
Примечание: Из-за гидрофобного характера биопленки колонии, колонии медленно отделяться от агара и начинают плавать. - Тщательно запечатать пластины с полосой Parafilm. Инкубируют на роторной качалке в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем передать пластины до 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день, тщательно удалить жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера, соединенный с вакуумным насосом.
- Осторожно добавьте 10 мл 100 мМ какодилат натрия, 5 мМ буфера хлорида кальция для промывки биопленки и инкубировать в течение 5 мин. Осторожно удалите жидкость со стеклянной пипетки Пастера из угла пластины, чтобы избежать повреждения биопленки и добавить свежий промывочный раствор осторожно пипеткой. Повторите этот шаг один раз.
- Для обезвоживания биопленки колоний, выполните следующие шаги: 2x 5 мин в DDH 2 O; 2x 20 мин в 30% этанола; 2x 20 мин в 50% -ном этаноле; 2x 20 мин в 70% -ном этаноле; 2x 20 мин в 96% этанол; 2x 30 мин в 100% этаноле.
- Добавьте 15 мл жидкости для каждого чашку Петри диаметром 8,5 см на каждой стадии и удалить жидкость тщательно после каждой инкубации.
- Используйте один из двух различных методов для сушки образцов из этанола.
- Для воздушной сушки из этанола:
- Вырезать фильтр целлюлозной бумаги (диаметром 9 см) в четверти. Кратко погрузить одну четверть в 100% этаноле, а затем осторожно перенести одну плавающую биопленки колонию на него. Поместите фильтровальную бумагу мокрой в чашке Петри выровненной с фильтровальной бумагой. Накройте чашку Петри и пусть биопленки колониям сухой в течение ночи в химическом капюшоном.
- Для критической точки (CP) -drying с использованием диоксида углерода (СО 2) в качестве переходного жидкости:
- Fill 75% от критической машины камеры Точка сушки с 100% -ным этанолом. Передача образцов в держатель, каждый образец в свой собственный CHamber. При необходимости разрезать биопленку с ножницами на мелкие кусочки. Оставьте образцы погруженные в этаноле в течение всего обращения. Затем перенесите держатель в камеру и закройте камеру плотно.
- Охладить камеру до 7 ° С и начинают перемешивание. Заполните камеру полностью жидким CO 2. В течение времени инкубации 7 мин, пусть смесь этанола с CO 2. Затем разрядить 25% раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не выливать в камеру ниже уровня образца. - Повторите шаг 3.8.2.2 в четыре раза.
- Повторите шаг 3.8.2.2 пять раз с инкубирования в течение всего 5 мин. И, наконец, этанол должен быть полностью замещен CO 2.
- Во время последнего раунда, пустой лишь 5% от камеры. Выключите перемешивание и охлаждение. Начинали нагрев камеры до 42 ° С. При температуре 31,1 ° С и давлении 73,9 бар, жидкий СО 2 достигает критической точки, состояние , в котором газообразный pHASE имеет ту же плотность, что и в жидкой фазе растворителя 27. После того, как температура достигнет 42 ° C, инкубируют в течение 10 мин. При 42 ° С в СО 2 в камере существует в виде газа в сверхкритическом состоянии .
Примечание: Постоянно проверяйте давление камеры. Давление не должно превышать 120 бар при 42 ° C. - Начинают медленно выпустить газ с непрерывным нагревом. Это сохраняет образцы в фазе СО 2 -Газовый и предотвращает деформацию морфологии образца через поверхностное натяжение жидкостей. Установите расходомер до 5 л / ч с помощью тонкой настройки дозирующий клапан, управляющий расходомер. Подождите, пока все давление в камере не будет отпущен. Теперь откройте камеру и извлеките образцы тщательно из держателя.
- Для воздушной сушки из этанола:
- Coat электронный микроскопия заглушкой с углеродной лентой. С помощью пинцета, тщательно передать биопленки колонии на заглушке. Подключите каждую колонию к заглушке, добавив тонкий мост от автомобилябон лента, которая имеет решающее значение для устранения заряда под электронным пучком. На данном этапе, обрабатывать биопленка колонии с осторожностью, так как они очень хрупкие. Хранить образцы в эксикаторе в течение по крайней мере 24 ч или до обследования.
- В день обследования с помощью сканирующего электронного микроскопа, разбрызгивание пальто биопленки колонии в течение 2 мин при 60 ° угол в золото-палладий-распыл для нанесения покрытий. Повторите этот шаг дважды, и вращать образцы на 120 ° между ними. В конце концов, разбрызгивание халата образцы один раз в течение 3 мин с вершины. 20 нм тонким слоем золота-палладия улучшает проводимость и усиливает контраст образца для формирования изображения в РЭМ.
- Хранить образцы в эксикаторе, чтобы избежать регидратации образца 28 до получения изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа 29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ плева является одним из методов изучения сильно отрегулированной и динамических процессов В. Сенная многоклеточность. Кроме этого, анализ пелликула подходит для тестирования диапазона либо условий предварительного стартера или небольших концентрациях молекул в одной клетки-культуры multidish пластины в одном эксперименте. Тем не менее, Б. формирование зиЫШз пелликула чувствительна к условиям предварительной культуры (например, рост среда предварительной культуры и ее фаза роста), отношение прививка и удаление предварительно культуральной среды. Поэтому мы первый скрининг на экспериментальной установки, которая позволила нам воспроизвести пленочную ингибирование D-лейцина. Наши результаты показывают, что воспроизводимый пелликула ингибирование D-лейцин может быть получен, если клетки предварительно культивировали в неопределенном, богатой LB среде до фазы роста средней логарифмическом (одной колонии в 3 мл LB при 37 & deg; С в течение 4 ч при встряхивании ), осаждали и ресуспендировали в определенной среде MSgg до 1: 1000 inoculatиона (рис 3А). Когда клетки выращивали в MSgg среде до середины логарифмической фазы роста (одной колонии в 1 мл LB в течение 2 ч, повторно разводили 1: 100 до 3 мл MSgg, и выращивали в течение 5 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту), удаление предварительно культуральной среды не оказывают влияние на D-лейцина активности. Клетки, выращенные в стационарной фазе роста (одной колонии в 1 мл LB в течение 2 ч, повторно разводили 1: 100 до 3 мл MSgg, и выращивали в течение до 20 часов в ролике при комнатной температуре) и отмывали в MSgg среде перед прививка были менее чувствительны. Тем не менее, это повышение устойчивости к ингибирующей пелликула эффекта D-лейцина может быть из-за более высокой плотности клеток предварительной культуры, увеличение отношения инокуляции. Отношение инокуляция предварительной культуры к статическому росту в MSgg среде, т.е., 1: 500 или 1: 1000, влияют диапазон активности D-лейцина и время развития зубного налета (фигура 3В). Зубного налета ингибирование D-лейцина произошлопри различных температурах роста (23 ° C и 30 ° C, рис 3C). Важно отметить, что в то время как чувствительность клеток к D-лейцина, зависит от условий предварительной культуры, воспроизводимость явлений при различных температурах показывает, что ингибирование пелликула маленькая молекула D-лейцина обладает надежными функциями.
. Рисунок 3. Пример результатов , которые показывают влияние различных условий предварительного культивирования на зубного налета ингибирования D-лейцина Несколько параметров должны быть оценены , чтобы получить надежную экспериментальную установку, в том числе: удаление (A) загрязняющих веществ от роста до культуры среда (не вымывается против мыть), средний рост предварительной культуры (богатый, неопределенном среде LB или определено биопленки индуцирующих MSgg среда), а также состояние роста предварительной культуры (логарифмическая против стационарной фазе роста), (Б) отношение прививка (1: 1000 в сравнении с 1: 500) из предварительной культуры в конечном среде роста пелликула, и () температура роста С (23 ° С против 30 ° С) В.. Клетки зиЫШз NCIB 3610 выращивали в среде , указанной (LB или MSgg) в течение 4 ч при 37 ° С или при комнатной температуре в течение ночи (O / N) при встряхивании, и предварительно культуральная среда была заменена MSgg , если указано (промытый или не промытые). И, наконец, закваска засевают 1: 1000, если не указано иное, и Плёночные выращивали в статических условиях при 23 ° С в течение трех дней. фотографии сверху вниз были приобретены с камерой. Ну диаметр 22 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
После идентификации условий предварительной культуры и экспериментальной установки, что позволило воспроизводимый диапазон активности Dлейцина на формирование пелликула (предварительной культуры, выращенной в LB к фазе роста средней логарифмические, промывают в MSgg, разведенным 1: 1000 и выращивали при 23 ° С в течение трех дней), эффект был проверен на его надежности. Для этой цели, активность D-лейцина на образование зубного налета оценивали в различных средах модифицированной MSgg (рисунок 4). Диапазон активности D-лейцина в ингибировании зубного налета был последовательным в пяти средах испытанных, и показывает, что действие D-лейцина на образование зубного налета является устойчивым. Аналогичная тенденция наблюдалась и с D-тирозин, где пелликула торможение в концентрации в диапазоне до 2 мкМ был последовательным в несколько модифицированных средах MSgg (более низкой концентрации железа и замены источника азота с хлоридом аммония или источника углерода с глюкозой, данные, которые не показано).
Рисунок 4. Чувствительность к D-лейцина происходит вразличные среды для выращивания. Показаны сверху вниз фотографии B. зиЫШз NCIB 3610 Плёночные, выращиваемые в статических условиях при 23 ° С в определенном, биопленки индуцирующих MSgg среды или в различных модифицированных средах MSgg (источник углерода 0,5% глюкозы, источник азота , 0,5% (NH 4) 2 SO 4; высоким содержанием железа в 250 мкМ FeCl 3; низкий глицерина 0,125% глицерина) в течение трех дней, для альтернативного источника азота среды (где Плёночные выращивали в течение пяти дней) либо без или с D-лейцина в концентрациях , указанных исключением. Стартовые культуры выращивали в течение 4 ч при 37 ° С при встряхивании в неопределенном, обогащенной среде LB. Перед посевом клетки отмывали центрифугированием и ресуспендировали в соответствующей среде роста пелликула. Закваска разводили 1: 1000, диаметр скважины 22 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Альтернативный метод исследования Б. Сенная многоклеточность является анализ колонии биопленки на твердом MSgg среде. Как Плёночные, этот анализ позволяет изучение пространственно-временных процессов. После того, как активный диапазон низкомолекулярные ингибиторы определяется в системе зубного налета, их влияние на образование биопленки колонии могут быть изучены. В этом исследовании биопленки колонии были использованы для оценки влияния D-лейцина на сопротивление биопленки колоний к стерилизующих агентов, потому что биопленки колонии являются менее хрупкими и на твердом фоне, они легче манипулировать. Когда биопленки колонии , обработанные D-лейцина подвергаются 50% этаноле в течение 10 мин, процент выживших клеток резко падает по сравнению с необработанным фракцией (рисунок 5). Этот метод может быть дальнейшее развитие с целью оценки влияния других ингибиторов небольшую молекулу и их влияние на устойчивость к бактерицидным агентам (стерилрующих агентов или антибиотиков).
Рисунок 5. Пример результатов необработанной или обработанной сопротивления биопленки колонии против стерилизующего агента. Биопленки колонии B. зиЫШз NCIB 3610 выращивали на твердой, определенной среде в течение 68 ч при температуре 30 ° C, с добавлением или без 0,5 мМ D-лейцина. После разрезания колонии на две равные части, одна половина обрабатывалась PBS (внутренний контроль), а вторая половина с 50% -ным этанолом или PBS (контроль). После мягкой обработки ультразвуком, серийного разведения, обшивкой и подсчета образующих колонию единиц, рассчитывали процент выживших по сравнению с внутренним контролем. Показаны результаты трех независимых экспериментов, средние значения из двух (А) или трех (B, C) размножается и их стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , тO просмотреть большую версию этой фигуры.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) является мощным инструментом , который может быть использован , чтобы сосредоточиться на пространственной архитектуры биопленки колонии морщин, обилие и локализации EPS и одной морфологии клеток 31. SEM-изображений требует образцов, которые могут быть отображены в высоком вакууме. Для исследования образцов в условиях высокого вакуума, все сыпучие молекулы воды должны быть удалены, и, следовательно, SEM изображения требуется обезвоживание образца до начала визуализации. В качестве альтернативы, образцы могут быть отображены в условиях низкой вакуума во влажном режиме внешней среды сканирующей электронной микроскопии (ESEM), где гидратированные образцы осторожно высушивают в микроскоп камеры. Для того, чтобы оценить влияние ингибиторов молекулы малых по архитектуре биопленки колонии, организации EPS и морфологии клеток, сравнивали три различных типа образца обезвоживания: сушка в микроскоп под мокрой моде условия (ESEM), сушат на воздухе от растворителя или критической точки (CP) -dried с использованием диоксида углерода в качестве переходного жидкости. В необработанном и D-лейцина обработке В. Сенная биопленки колонии разных стадиях гидратации согласно методу , использованному можно было наблюдать. Обработки изображений в условиях низкой вакуума во влажном режиме по ESEM сохранил очень естественное состояние биопленки колонии. Тем не менее, информация о единой морфологии клеток и САП изобилию и архитектуры было мало, поскольку пенополистирол были еще полностью гидратированного и клетки были встроены в EPS (данные не показаны). С точки зрения обезвоживания, CP-сушка была наиболее строгая процедура. Она устранила наиболее структурно связанных и объемные молекулы воды из ткани, что составляет потери объема 30-70%, в зависимости от ткани 32. В противоположность этому, воздушная сушка сохранили молекул связанной воды. Эмбриональной ткани, например , потеряли 18% своего объема после воздушной сушки от летучих растворителей этанола и 59% после того, как CP-32 сушки (6А) , Биопленки колонии , которые были обезвожены с этанолом и CP высушенных также сохранили свою трехмерную структуру, и EPS появился как паутина (6С). В высушенных на воздухе и CP высушенных образцов, эффекты низкомолекулярный ингибитор D-лейцина на архитектуре биопленки колонии, одиночная морфология и EPS - клеточной структуры были очевидны (рис 6В и D). Биопленка колоний, выросших в присутствии D-лейцина, были меньше, и морщины были менее выражены. D-лейцин-обработанные клетки были удлинены, такой фенотип, который OBSErved в клетках , обработанных клеточной стенки , ориентированных молекул 33. Кроме того, клетки были явно менее покрыты ЭПС и не тесно связаны с соседними клетками через САП, как видно в необработанных биопленки колоний. Представленные результаты показывают, что оба метода биопленки колонии дегидратации, сушат на воздухе из этанола или СР-сушке с использованием диоксида углерода в качестве переходного жидкость дают ценную информацию о влиянии малых молекул на одной морфологии клеток, а также на обилии EPS и архитектуры.
Рисунок 6. Малые молекулы могут изменить большие и малые масштабы архитектуры биопленки колонии. Биопленки колонии B. зиЫШз NCIB 3610 выращенный (А и D) , в отсутствие или (В и D) , в присутствии 0,5 мМ D-лейцина в течение 72 ч при 30 ° Cна твердой среде MSgg фиксировали , как описано в протоколе и сушат из этанола следующим образом : (А и В) сушат на воздухе и (С и D) , СР-сушке с использованием диоксида углерода в качестве переходного жидкости. Изображены сверху вниз бинокулярного изображения биопленки колоний (левая, верхняя часть панели), сверху вниз фотографии высушенных биопленки колоний, установленных на электронной микроскопии заглушек перед золотодобывающей палладиевого покрытия (слева, нижние панели), с низким и высоким увеличением изображения, полученные с помощью SEM, чтобы показать 3D архитектуру биопленки колонии морщин или одной морфологии клеток / EPS организации. Шкала баров слева направо: 5 мм., 100 мкм, 2 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 1,925 мМ | горшокодноосновного фосфата полевыми шпатами исчезло |
| 3.075 мМ | двухосновный фосфат калия |
| 100 мМ | 3- (N -morpholino) пропансульфокислоты, рН 7,1 |
| 2 мМ | магния гексагидрат хлорида |
| 700 мкМ | безводный хлорид кальция |
| 50 мкм а | железа (III) гексагидрата хлорида |
| 125 мкМ б | |
| 1 мкМ | цинка безводный хлорид |
| 2 мкМ | тиамина гидрохлорид |
| 50 мкг / мл | триптофан |
| 50 мкг / мл | фенилаланин |
| 50 мкг / мл | треонин |
| 0,5% (об / об) | глицерина безводный |
| 0,5% (вес / объем) | L-глутаминовой кислоты мононатриевой соли гидрата |
| а при анализе зубного налета; б для анализа биопленки | |
Таблица 1. Окончательный 1x MSgg композиция , используемая в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сенная палочка образует прочные и хорошо структурированный биопленки как в жидком (Плёночные) и на твердой среде (колонии). Таким образом, он служит в качестве идеальной модели организма, чтобы охарактеризовать способ действия специфических ингибиторов биопленки. На твердых средах, клетки образуют многоклеточные структуры с отличительными особенностями, которые не очевидны в Плёночные, как морщины, расходящихся от центра к краю. Таким образом, Плёночные и колонии являются дополняющими друг друга систем для изучения B. Сенная многоклеточность.
Целью данного исследования является разработка B. Модель системы Сенная для биопленки (Плёночные и колоний) торможения. Несколько шагов имеют решающее значение для воспроизводимости возмущения биопленки эссе. Первым важным шагом является подтверждение того, что влияние на формирование биопленок не из-за общей токсичности для бактерий, выращенных в планктонных образ жизни. Это можно рассматривать путем сравнения эффекта заданной концентрации, какингибитор молекулы центр на относительной биопленки торможения к эффекту этой молекулы на планктонных роста. Резко сильный эффект на развитие биопленки может обеспечить идентификацию целевых механизмов, которые особенно важны для развития биопленок. Кроме того, в настоящем документе описывается исследование демонстрирует важность условий предварительной культуры к развитию Плёночные и их чувствительность к малым молекулам. Перед тем, характеризующий влияние малых молекул, воспроизводимые и надежные экспериментальные условия (например, температура роста пелликула и отсутствие чувствительности к композиции средств массовой информации) , чтобы проверить их последствия должны быть определены. Чтобы найти такие условия, средства массовой информации о состоянии предварительной культуры, фазы роста предварительной культуры, предварительно культура удаления среды, температуры роста и роста средств массовой информации должны быть рассмотрены.
Одна из основных проблем, как только специфический ингибитор для образования биопленки найден, чтобы найти количественноеи качественные методы, которые характеризуют влияние этих низкомолекулярные ингибиторы на развитие биопленки и сопротивления. При этом возможны два важных методики описаны подробно, которые могут быть использованы для оценки влияния таких ингибиторов. Во-первых, мы вводим простой количественный метод, который может воспроизводимо зондировать сопротивление обработке по сравнению с необработанными колонии биопленок к бактерициды, такие как этанол. Типичные результаты приведены для чувствительности D-лейцина обработанных биопленки колоний до 50% этанола. Тем не менее, это эссе может быть легко изменена с помощью различных стерилизующих агентов и антибиотиков. Во-вторых, метод SEM подробно описывается, что позволяет с высокой разрешающей способностью рассмотрение изменений в биопленки колонии, вызванного ингибитором небольшой молекулы в нескольких взаимодополняющих уровнях: общая структура, организация и обилие матрицы EPS и ее компонентов, а также морфология одноклеточные всей биопленки. Отметим, что два метода dehydratiна (воздушной сушки от 100% этанола или CP-сушки с использованием диоксида углерода в качестве переходного типа жидкости) может быть использован в равной степени во время подготовки образца SEM биопленки колонии. Важно отметить успешное фиксация образца биологической пленки в значительной степени зависит от гидрофобности биопленки колонии. Это гидрофобность является неотъемлемой характеристикой B. Сенная биопленки из - за гидрофобного поверхностного слоя 10,34.
Несколько подходов использовались ранее для изучения сборки и развитие биопленки с B. Сенная как модельного организма 35. Ряд независимых исследований продемонстрировали влияние состава медиа на развитие биопленки 36-38. До сих пор, однако, систематическое оценка влияния состава носителя на ингибирование биопленки, насколько нам известно, не хватает. Это исследование показывает , что в то время как пелликула ингибирование B. зиЫШз малыми молекулами чувствительна к предкультуры условиям, то Unaffected эффектами температуры и состава среды и таким образом полезны для систематических экранов низкомолекулярные ингибиторы. Кроме того , мы создали простой, воспроизводимый и количественный метод для оценки устойчивости неочищенных или небольшой молекулы ингибитора обработанных биопленки колоний антибактериальных агентов, в настоящее время не хватает в организме B. биопленки модели Сенная.
B. Сенная биопленки в сочетании с люминесцентными репортерами могут быть приняты дополнительно искать низкомолекулярные ингибиторы , которые направлены либо конкретный шаг в развитии образования биопленки или конкретного субпопуляции клеток внутри биопленки. Описанный здесь способы не обеспечивают ни одного элемента разрешения с точки зрения экспрессии генов в биопленки. Методы анализа экспрессии генов EPS матрицы в B. Сенная биопленки на уровне одной клетки были успешно установлены 39.
Бактериальные биопленки имеют cruciaл значение в сельскохозяйственных, промышленных и медицинских учреждениях. В сельскохозяйственном контексте, способность образовывать биопленки увеличивает растения - хозяина колонизация многочисленных патогенов растений 40, и в клиническом контексте, биопленки являются по своей природе устойчивы к антимикробным агентам 21 и лежат в основе многих стойких и хронических бактериальных инфекций. Кроме того, в настоящее время признано , что биопленки имеют огромные последствия ущерба для промышленности , поскольку они чрезвычайно трудно удалить , и 41 управления. Таким образом, развитие экспериментальной базы для изучения микробных ингибиторов биопленки обеспечит значительные сельскохозяйственные 42,43, клинические 21,44 и технологические 45-47 достижений.
Современные методы ограничены В. Сенная. Мы поощряем Следуя описанным качественные и количественные понятия для изучения ингибиторов маленькая молекула биопленки специфических у других видов, а также. К тому же , Это исследование относится к конкретному примеру для ингибирования биопленки D-лейцина, из нескольких ингибиторов специфических биопленки опубликованы ранее 17. Важно отметить, что D-лейцина был уже охарактеризован как анти-биопленки молекулы в растении патогена ХапОг Citri 48, представляя возможные сходства между колонизацией растений и образования биопленки. Формирование биопленок (пелликула и формирование морщинистые колонии) также распространены в человеческих патогенов (например, синегнойной 49-51 и уропатогенных кишечной палочки 52,53). Описанные методы могут быть разработаны в дальнейшем для поиска специфических препаратов, ингибирующих образование биопленки и снижают биопленки-опосредованной устойчивости к антимикробным препаратам в клинических исследованиях. В целом, способы, описанные здесь, могут быть использованы в качестве основы для разработки количественных и качественных представлений для изучения ингибиторы небольшой молекулы биопленки специфичные и у других видов, а также.
нт "> Таким образом, мы предлагаем простой и полезный инструмент ящик , который демонстрирует потенциальные преимущества и подводные камни при помощи B. Сенная для изучения ингибиторов биопленки.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth, Lennox | Difco | 240230 | |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G | |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher Scientific, 209.27 g/mol | BP308-500 | |
| magnesium chloride hexahydrate | Merck, 203.30 g/mol | 1.05833.0250 | |
| calcium chloride anhydrous | J.T. Baker, 110.98 g/mol | 1311-01 | |
| manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma, 197.91 g/mol | 31422-250G-R | |
| iron(III) chloride hexahydrate | Sigma, 270.30 g/mo) | F2877-500G | |
| zinc chloride anhydrous | Acros Organics, 136.29 g/mol | 424592500 | |
| thiamine hydrochloride | Sigma, 337.27 g/mol | T1270-100G | |
| L-tryptophan | Fisher Scientific, 204.1 g/mol | BP395-100 | |
| L-phenylalanine | Sigma, 165.19 g/mol | P5482-100G | |
| L-threonine | Sigma, 119.12 g/mol | T8625-100G | |
| glycerol anhydrous | Bio-Lab Itd | 712022300 | |
| L-glutamic acid monosodium salts hydrate | Sigma, 169.11 g/mol | G1626-1KG | |
| D-leucine | Sigma, 169.11 g/mol | 855448-10G | |
| ethanol anhydrous | Gadot | 830000054 | |
| razor blade | Eddison | NA | |
| circular cellulose filter papers | Whatman, 90 mm | 1001-090 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water | 16220 | |
| paraformaldehyde | EMS, 16% in water | 15710 | |
| sodium cacodylate | Merck, 214.05 g/mol | 8.2067 | |
| calcium chloride 2-hydrate | Merck, 147.02 g/mol | 1172113 | |
| stub-aluminium mount | EMS, sloted head | 75230 | |
| carbon adhesive tape | EMS | 77825-12 | |
| Shaker 37 °C | New Brunswick Scientific Innowa42 | NA | |
| Centrifuge | Eppendorf table top centrifuge 5424 | NA | |
| Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip | Branson | NA | |
| Incubator 30 °C | Binder | NA | |
| Incubator 23 °C | Binder | NA | |
| Filter System, 500 ml, polystyrene | Cornig Incorporated | NA | |
| Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II | Boekel | NA | |
| S150 Sputter Coater | Edwards | NA | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | NA | |
| Environmental Scanning Electron Microscope | XL30 ESEM FEG Philips (FEI) | NA |
References
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu Rev Microbiol. 56, 187-209 (2002).
- Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol. 55, 165-199 (2001).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr Opin Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Kolter, R., Greenberg, E. P. Microbial sciences: the superficial life of microbes. Nature. 441, 300-302 (2006).
- Kearns, D. B., Chu, F., Branda, S. S., Kolter, R., Losick, R. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 55, 739-749 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Romero, D., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 2230-2234 (2010).
- Kobayashi, K., Iwano, M. BslA(YuaB) forms a hydrophobic layer on the surface of Bacillus subtilis biofilms. Mol Microbiol. 85, 51-66 (2012).
- Hobley, L., et al. BslA is a self-assembling bacterial hydrophobin that coats the Bacillus subtilis biofilm. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 13600-13605 (2013).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Kolodkin-Gal, I., et al. D-amino acids trigger biofilm disassembly. Science. 328, 627-629 (2010).
- Chan, Y. G., Kim, H. K., Schneewind, O., Missiakas, D. The capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus is attached to peptidoglycan by the LytR-CpsA-Psr (LCP) family of enzymes. J Biol Chem. 289, 15680-15690 (2014).
- Mielich-Suss, B., Lopez, D. Molecular mechanisms involved in Bacillus subtilis biofilm formation. Environ Microbiol. 17, 555-565 (2014).
- Cairns, L. S., Hobley, L., Stanley-Wall, N. R. Biofilm formation by Bacillus subtilis: new insights into regulatory strategies and assembly mechanisms. Mol Microbiol. 93, 587-598 (2014).
- Chen, M., Yu, Q., Sun, H. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int J Mol Sci. 14, 18488-18501 (2013).
- Bucher, T., Oppenheimer-Shaanan, Y., Savidor, A., Bloom-Ackermann, Z., Kolodkin-Gal, I. Disturbance of the bacterial cell wall specifically interferes with biofilm formation. Environ Microbiol Rep. 7, 990-1004 (2015).
- Sarkar, S., Pires, M. M. D-Amino acids do not inhibit biofilm formation in Staphylococcus aureus. PLoS One. 10, e0117613 (2015).
- Wei, W., Bing, W., Ren, J., Qu, X. Near infrared-caged D-amino acids multifunctional assembly for simultaneously eradicating biofilms and bacteria. Chem Commun (Camb). 51, 12677-12679 (2015).
- Leiman, S. A., et al. D-amino acids indirectly inhibit biofilm formation in Bacillus subtilis by interfering with protein synthesis. J Bacteriol. 195, 5391-5395 (2013).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2, 114-122 (2003).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 877-886 (2015).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15, 2865-2878 (2013).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 11621-11626 (2001).
- Holscher, T., et al. Motility, Chemotaxis and Aerotaxis Contribute to Competitiveness during Bacterial Pellicle Biofilm Development. J Mol Biol. 427, 3695-3708 (2015).
- Bray, D. Methods in Biotechnology. 13, Humana Press Inc. 235-243 (2000).
- Ensikat, H. J., Ditsche-Kuru, P., Barthlott, W. Scanning electron microscopy of plant surfaces: simple but sophisticated methods for preparation and examination. 1, Formatex Research Center. 248-255 (2010).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of scanning electron microscopy: Biological applications. 2, Van Nostrand Reinhold Company. (1976).
- Schatten, H. Scanning Electron Microscopy for the Life Sciences. , Cambridge University Press. (2013).
- Bridier, A., Meylheuc, T., Briandet, R. Realistic representation of Bacillus subtilis biofilms architecture using combined microscopy (CLSM, ESEM and FESEM). Micron. 48, 65-69 (2013).
- Boyde, A., MacOnnachie, E. Volume changes during preparation of mouse embryonic tissue for scanning electron microscopy. SCANNING. 2, 149-163 (1979).
- Yao, Z., Kahne, D., Kishony, R. Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics. Mol Cell. 48, 705-712 (2012).
- Epstein, A. K., Pokroy, B., Seminara, A., Aizenberg, J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 995-1000 (2011).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11, 157-168 (2013).
- Shemesh, M., Chai, Y. A combination of glycerol and manganese promotes biofilm formation in Bacillus subtilis via histidine kinase KinD signaling. J Bacteriol. 195, 2747-2754 (2013).
- Kolodkin-Gal, I., et al. Respiration control of multicellularity in Bacillus subtilis by a complex of the cytochrome chain with a membrane-embedded histidine kinase. Genes Dev. 27, 887-899 (2013).
- Oppenheimer-Shaanan, Y., et al. Spatio-temporal assembly of functional mineral scaffolds within microbial biofilms. npj Biofilms and Microbiomes. 2, 15031 (2016).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. , e3796 (2012).
- Bogino, P. C., Oliva Mde, L., Sorroche, F. G., Giordano, W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. Int J Mol Sci. 14, 15838-15859 (2013).
- Fratamico, P. M., Annous, B. A., Guenther, N. W. Biofilms in the Food and Beverage Industires. 1, Woodhead Publishing. (2009).
- Gao, G., et al. Effect of biocontrol agent Pseudomonas fluorescens 2P24 on soil fungal community in cucumber rhizosphere using T-RFLP and DGGE. PLoS One. 7, e31806 (2012).
- Chen, Y., et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environ Microbiol. 15, 848-864 (2013).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7, 375-381 (2009).
- Nevin, K. P., Woodard, T. L., Franks, A. E., Summers, Z. M., Lovley, D. R. Microbial electrosynthesis: feeding microbes electricity to convert carbon dioxide and water to multicarbon extracellular organic compounds. MBio. 1, (2010).
- Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol Rev. 34, 3-17 (2010).
- Li, J., Wang, N. Foliar application of biofilm formation-inhibiting compounds enhances control of citrus canker caused by Xanthomonas citri subsp. citri. Phytopathology. 104, 134-142 (2014).
- Okegbe, C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. Redox-driven regulation of microbial community morphogenesis. Curr Opin Microbiol. 18, 39-45 (2014).
- Mann, E. E., Wozniak, D. J. Pseudomonas biofilm matrix composition and niche biology. FEMS Microbiol Rev. 36, 893-916 (2012).
- Bouffartigues, E., et al. Sucrose favors Pseudomonas aeruginosa pellicle production through the extracytoplasmic function sigma factor SigX. FEMS Microbiol Lett. 356, 193-200 (2014).
- Wu, C., Lim, J. Y., Fuller, G. G., Cegelski, L. Quantitative analysis of amyloid-integrated biofilms formed by uropathogenic Escherichia coli at the air-liquid interface. Biophys J. 103, 464-471 (2012).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an Architectural Element in Spatially Structured Escherichia coli Biofilms. J Bacteriol. 195, 5540-5554 (2013).
