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Biochemistry

定义底物特异性的脂肪酶和磷脂酶考生

Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54613
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México

Abstract

微生物产生的那些，以使可用于生物体外部基板分泌（磷）的脂酶广泛光谱。另外，其他（磷酸）脂肪酶可以在物理上与生产菌引起的内在脂质的营业额，并经常引起细胞膜的重塑有关。虽然势（磷）的脂肪酶可以用数目的算法时该基因/蛋白质序列可用来预测，经常没有获得的酶的活性，底物特异性，和潜在的生理功能的实验证据。这个手稿描述的测定条件与未知底物特异性，以及如何利用这些优化条件下在搜索用于相应（磷）的脂肪酶的天然底物准（磷）的脂肪酶的最优化。采用人工发色底物，如对硝基苯衍生物，可有助于检测小为在标准条件下的预测（磷）的脂肪酶的酶活性。具有遇到这样的次要的酶活性，酶测定法的不同参数可以在为了获得人造基底的更有效的水解而变化。已确定在其下的酶工作良好的条件之后，各种潜在天然底物应测定其降解，其可以采用不同的层析方法进行随后的处理。底物特异性为新酶的定义，通常提供假设这些酶，然后可通过实验测试的潜在生理作用。遵循这些指导原则，我们能够确定降解磷脂酰胆碱磷酸胆碱到甘油二酯和，在膜中生长时的磷限制条件细菌根瘤菌重塑的关键一步磷脂酶C（SMc00171）。两个预测patatin-就像有机体一样的磷脂酶（SMc00930和SMc01003），我们可以重新确定自己的底物特异性和澄清SMc01003是甘油二酯脂肪酶。

Introduction

基于甘油脂质，如三酰甘油和（甘油）磷脂构成了重要的可能是最知名的类脂质1。三酰基甘油（变量）的脂肪或油，其通常用作存储脂类，因此作为潜在的能量和碳的来源。标签可以通过脂肪酶，这是经常被生产菌分泌的消化外部变量并使它们可作为碳源退化。另外，脂肪酶已经被广泛地研究，多年来，由于其重要的生物技术应用2。

由于它们的两亲性质及其近圆筒状的形状，（甘油）磷脂展览成膜性，通常构成了双层膜3的主要类脂组分。在简单的微生物，如细菌大肠杆菌中，只有三个主要头组的变体，磷脂酰甘油（PG），心磷脂（CL），和phosphatidylethanolamine（PE）遇到，尽管人们应该知道，他们中的每一个都可以用在sn相当数量的不同脂肪酰基链的-1或SN -2位置引起大量不同分子种类4的被取代。其他细菌可能具有除了或代替其他磷脂。例如， 苜蓿中华根瘤菌 ，土壤细菌，其能够形成与豆科苜蓿（ 紫花苜蓿 ）一个固氮根瘤共生，包含除了PE的第二两性离子磷脂，磷脂酰胆碱（PC），5。另外，不含有脂质磷或甘油可能是细胞膜的两亲性并形成部分。例如，在磷限制生长条件下，在S根瘤菌 ，（甘油）磷脂主要由膜脂质不包含磷， 即，硫脂，鸟氨酸脂质和diacylglyceryl trimethylho取代moserine（DGTS）6。在细菌中，DGTS从二酰甘油（DAG）在一个两步通路7形成，但是对于DAG生成源不明确。脉冲追踪实验表明个人电脑可能是DGTS 8的前体，并使用在这个手稿，我们可以识别磷脂酶C（PLCP，SMc00171）中描述的方法，该方法是磷限制性的条件下形成并且可PC转换为DAG和磷酸8。

在另一项研究中，我们发现，酰基-CoA合成酶（FADD）S的缺陷型突变体进入生长9的固定相时的根瘤菌或大肠杆菌积累游离脂肪酸。尽管这些脂肪酸似乎是从膜脂质衍生自游离脂肪酸或解放出来的酶的确切来源没有已知的。再次，采用的策略在这个手稿概述，二patatin启动类10（磷）的脂肪酶（SMc00930和SMc01003），该对S中形成的游离脂肪酸贡献根瘤菌 11进行了预测。令人惊讶地，SMc01003使用的DAG作为底物将其转换为单酰甘油和最后甘油和游离脂肪酸11。因此，SMc01003是DAG脂肪酶（DGLA）。

虽然用于预测潜在（磷）存在一些算法脂酶12,13，它们的精确的功能和生理作用通常是不知道的。在这里，我们勾勒出一个协议，克隆和过度预测的或潜在的（磷）的脂肪酶。这份手稿解释酶检测如何开发和利用人工色底物的过度表达（磷）脂肪酶进行了优化。我们提供的例子，这些研究结果可能如何与优化的酶测定可遇到的实际（磷酸），酶底物，以及如何丰富我们的微生物生理学的理解。

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Protocol

1.克隆和过度表达结构基因的脂肪酶预测

  1. 使用聚合酶链反应（PCR）14和特异性寡核苷酸（ 表1）15，扩增感兴趣（smc01003，smc00930或smc00171）的基因，预测为脂肪酶编码或磷脂酶，从宿主生物的基因组DNA（ 即， 苜蓿根瘤菌 ）。
    1. 引入特定的限制性位点（有寡核苷酸的设计的序列）。消化与相应的限制性内切酶的扩增的DNA片段，并将其克隆到表达载体中，如PET系列16的质粒。
    2. 验证为克隆基因的正确DNA序列后，转化载体至表达菌株如大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS中16。
  2. 准备表达宿主大肠杆菌的过夜预培养大肠杆菌 BL21（DE3）PLYSS，窝藏与克隆基因或空载体的各个pET载体，在含有20ml的Luria BERTANI肉汤（LB）17 100毫升培养瓶中加所需的抗生素。培养细胞在30℃（或在从该脂肪酶源自细菌的通常生长温度）。
    1. 使用过夜预培养物，接种在2L培养瓶中500毫升预热的LB培养基（加所需抗生素）在620nm（OD 620）= 0.05，以获得一个初始光密度。跟随在的OD 620 = 0.3培养物和生长，添加异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至100μM的最终浓度，并在搅动下孵育在30℃，为期4小时。
    2. 在温育期结束时，在5000 xg离心传送各培养到500ml的离心管并离心在4℃下30分钟。重悬细菌细胞沉淀在5ml悬浮缓冲液（ 例如 ，SMc00930-和SMc01003表达细胞在50mM的Tris-HCl pH 8.0的和SMc00171表达细胞在50mM二乙醇胺 - 盐酸pH值9.8）。在-80°C，直到使用储存细胞悬液。

2.准备无细胞蛋白提取物和确定蛋白质浓度

  1. 除霜细菌细胞悬浮液并储存在冰上。传递细胞悬液通过冷压细胞三次，每2磅20000。离心5000 xg离心在4℃下除去完整细胞和细胞碎片30分钟。
  2. 离心后，从上清液用于后续分析准备的100和500微升等分试样，并将其存储在-80℃直至使用。
  3. 使用100微升等分试样中的一个由选择的方法或如所述18，以确定不同的无细胞提取物的蛋白质浓度。

3.使用人工基质用于优化酶的（磷）的脂肪酶活动

  1. 对于不同的酶活性的初始覆盖，使用通过水解产生有色产物人工基质，如对硝基苯酚（ 第 -NP）。
    1. 对于人工对硝基苯酯底物已经过优化的酶测定（概述的磷脂酶C PLCP（SMc00171），以及对预测的patatin启动状磷脂SMc00930和SMc01003），在表2中记载的使用移液的方案。
    2. 当探索新的潜在的（磷）的脂肪酶，制备含有50mM Tris-盐酸，pH值8.5，100mM NaCl的，0.05％的Triton X-100，0.5mM的磷复合含有硝基苯基（ 对硝基苯磷酸盐的第一标准酶测定，二- 对硝基苯基酯，磷酸对硝基苯癸酸盐，或对硝基苯基棕榈酸酯），和无细胞蛋白提取物（检查1，3，10，30，100，300，和1000微克）以1:1的总体积毫升在1毫升塑料CUVEttes。
      注意：下面的连续测定对硝基苯酯的水解时使用的碱性pH值（ 图1）。另外，使用单个时间点测定法的范围内的pH值，在温育期结束时加入NaOH以终止酶反应，并确保所有的p -NP存在于酚形式。
    3. 按照时间过程为在30℃下在5分钟内于405nm的增加吸光度，因为p -NP的形成，在分光光度计。通过确定每时间吸光度的增加的初始斜率量化p -NP的最初线性形成。
    4. 计算浓度（ΔC）的对p-NP使用朗伯-比尔定律（ΔA=εΔCd）1名的变化。
      注：ΔA是吸光度确定的线性变化，ε是在各自的波长的摩尔消光系数（以M为单位-1 -1），d为光路（1厘米）的长度，和ΔC是浓度的（待确定的变化以M为单位）。
      1. 考虑到分析体积为1毫升，计算形成在p -NP量。
        注：金额=浓度X卷。
      2. 除以在它形成时形成在p -NP的量计算出的酶活性。通过蛋白质的这是负责生成该活动的量（以mg）除以酶活性确定特定的酶的活性。
    5. 通过比较蛋白质提取物挑起吸光度的变化，其中一个候选基因（smc00171，smc00930或smc01003）已表达了与港仅一个空向量提取物。
      注意：为了继续执行下面的步骤，具体活动，造成其中的候选基因已被表达的蛋白提取物，应至少两次或间矿石比造成窝藏只有一个空的载体蛋白提取物的具体活动得到的数值。
    6. 进一步的实验中，选择这些条件，其中含有硝基苯- 对化合物的水解是最小的与无细胞提取物（ 即，空载体）和的量，最明显形成p -NP的与p -nitrophenolate阴离子（ 图1）可以在蛋白质提取物中使用的，其中一个候选基因已被表达进行观察。
  2. 确定在3.1的初始酶活性后，通过改变pH值，缓冲液类型优化用于各酶的测定条件，缓冲强度的NaCl浓度，洗涤剂如Triton X-100和不存在的或不同的二价阳离子的存在。
    1. 对于不同浓度的各变量，确定特定酶的活性（见3.1.4.2）（获得最高数目限定的条件最大酶活性的）。使用的每个变量所遇到的最佳条件的组合来定义一个优化的酶测定，其中每个变量是存在于它的最佳浓度。

图1
图1. 对 硝基苯酯在分光光度测定法（磷）的脂肪酶作为人工基质。当对硝基苯酯的水解，酸（R-OH）和对硝基苯酚（ 对 -NP）形成。由于pK a为= 7.2酚类的 H +从对 -NP解离，在pH> 9.2的99％以上是在明亮的黄色p -nitrophenolate形式和18000 M -1 cm的摩尔消光系数- 1可以在波长使用为游离对 -nitrophenolate 22的量化405纳米。当使用具有pH为8.5缓冲，吸收在400 nm和14500 M -1厘米的摩尔消光系数确定-1采用23。 请点击此处查看该图的放大版本。

注：在已经确定的最佳条件为所关注的酶的活性，踏上寻求本脂肪酶的实/生理底物。原则上，利用2个，经常补充，方法来实现这个目标， 在体内方法或体外方法。

4.一脂肪酶的生理底物的体内鉴定

ove_content“>注意： 在体内的方式，表达了在宿主生物体8,11感兴趣的脂肪，才能随着时间的推移脂肪酶的表达是否改变了host's血脂登记在另一个体内的方法，生成突变体缺乏兴趣8,11的基因并研究其脂质分布是否是由野生型版本6,8,11是不同的。为了得到生物体的脂质分布的定量评估，一个简单的方法包括放射性标记细胞化合物，提取脂质，通过色谱法将它们分离，并量化放射性标记的分离脂质。

  1. 脂类的放射性标记。
    1. 在5毫升的所需培养基（复合培养基或定义基本培养基）的制备的兴趣（ 大肠杆菌或S.根瘤菌 ）有机体的过夜预培养，并在30℃下生长。
    2. 从预培养，接种20毫升的股份有限公司在100毫升培养瓶中箱新鲜培养基，得到初始OD 620 = 0.3的培养。
    3. 取培养物的等分试样（1ml）中在无菌条件下，并转移到14毫升无菌聚苯乙烯圆底管中。
    4. 添加[1- 14 C]乙酸盐（每毫摩尔60毫居里）的1 ml培养1微居里。
    5. 孵育在搅拌下在液体培养物在30℃，为期24小时。
    6. 在温育期结束时，转移培养到1.5ml微量离心管中并离心以12,000 xg离心在室温下5分钟。
    7. 重悬在100μl水中沉淀。在这一点上，存储所述细胞悬浮液在-20℃下或立即继续与极性脂质（第4.2节）的提取。
  2. 极性脂质的提取。
    注：这里主要介绍的方法遵循布莱和代尔19日报道的过程。
    1. 以100微升水细胞停赛的ension，添加375微升甲醇：氯仿溶液（2：1;体积/体积）。
    2. 涡旋30秒，并孵育在室温下5分钟。
    3. 离心5分钟，在室温下以12000 xg离心。
    4. 将上清转移至新的1.5 ml离心管中。
    5. 加氯仿的125微升和125微升水，旋涡30秒。
    6. 离心1分钟，在室温下12000 xg离心。
    7. 下部氯仿相转移到新的管中，并干燥，用氮气流。
    8. 溶解在100μl氯仿中干燥脂质：甲醇溶液（1：1;体积/体积）。
      注意：在这一点上，5微升脂质溶液的等分试样可通过液体闪烁计数进行定量。
    9. 对于薄层色谱（TLC）分析，干下来其余95微升用氮气流和在20μl氯仿中再溶解干燥的脂质：甲醇溶液（1：1;体积/体积）。使用3微升等分对于TLC分析。
  3. 通过薄层色谱（TLC）极性脂质的分离。
    注意：根据所述脂质类进行分析，固体和流动相的不同组合可能被用于分离。此处带电极性脂质和另一个，更适合中性极性脂质，采用高性能薄层色谱法（HPTLC）硅胶铝板作为固相的典型分离，进行了概述。
    1. 由二维TLC（2D-TLC）带电极性脂质的分离。
      1. 在HPTLC硅胶铝板（10×10厘米），从板的边缘2厘米一角应用脂质样品的一个3微升等分试样。
      2. 准备与在第一维混合用于分离的流动相（140毫升氯仿60毫升甲醇，和10毫升水）。
      3. 大衣色谱纸TLC发展内部腔。
        注意：这是为了确保该室的气体相将用于第一维流动相后迅速饱和（30分钟内）已经被添加到腔室和腔室已被封闭的玻璃板。
      4. 制备并混合流动相（130毫升氯仿，50ml甲醇，和20ml冰醋酸），用于在所述第二维分离，并转移到一第二薄层显影室内部涂覆有色谱纸，让腔饱和。
      5. 小心地将薄层硅胶铝板与干燥的脂质样品在封闭腔室中的第一维5转移到第一室和发展（ 即 ，执行色谱法）该板60分钟。
      6. 从腔室中取出板，并让溶剂擦干在一个流罩30分钟。
      7. 90度相对于转动板到先前层析后，转移薄层硅胶铝板，在其上的脂质已经在一个维度被分离，给塞康ð腔和开发该板在第二维5 60分钟。
      8. 除去从腔室的薄片，让该溶剂干燥掉在一个流罩至少2小时。
    2. 中性极性脂质的分离。
      1. 适用于启动从板的边缘2cm的薄层硅胶铝板脂质样品3微升等分试样。如果多个样品在一维色谱分析，保持的不同示例应用点之间至少1.5厘米的距离。
      2. 制备并混合流动相（140毫升己烷，60毫升乙醚，和8ml乙酸），并转移到一个薄层显影室内部涂覆有色谱纸和覆盖有一个玻璃板，让腔饱和（30分钟）。
      3. 与干燥的脂质样品转移薄层硅胶铝板到腔和发展板在封闭室30分钟。
      4. 从室中取出板并让溶剂擦干在一个流罩2小时。
  4. 定量分离极性脂类的可视化。
    1. 一旦开发了薄层片材干燥，以光激励发光（PSL）屏幕孵育它在一个封闭的盒3天。
    2. 露出孵育屏幕到PSL扫描器并获取分离放射性标记的脂质的虚像。
    3. 使用PSL软件20进行量化。
  5. 可视化和个人极性脂质类的隔离。
    1. 孵育发达型TLC片在以1g碘晶体的存在下层析室10分钟。
      注：分居脂质化合物会溶解碘和出现褐色斑点。
    2. 圈用铅笔斑点，把它们比作标准化合物（ 即 1,2- dipalmitoyl- SN -甘油，二棕榈-L-α-磷酸的相对移动（R F）phatidylcholine，DL-α-甘油一棕榈酸酯，或棕榈酸），并确定它们可能属于哪脂质类。
    3. 在通风橱中，让碘在TLC板蒸发。
    4. 用刮铲的帮助下，刮含有从纸张目的产物的硅胶，并用100微升的水和375微升甲醇中的混合物中提取的硅胶化合物：氯仿溶液（2：1;体积/体积）。
    5. 根据布莱和代尔拔牙继续概述（4.2.2起）。
    6. 商店纯化脂质类在100μl的氯仿：甲醇溶液：;在-20℃直到使用（1体积/体积）。

5.脂肪酶的生理底物的体外鉴别

注意：在体外的方法，研究感兴趣的脂酶能否分离脂质或各个纯脂质的混合物转化成相应的hydrolysis产品在3.2定义为最佳的条件下进行。

  1. 使用酶分析吹打方案按表3为PC专用磷脂酶C SMc00171（见5.2），磷脂酶A（见5.3），以及DAG脂肪酶SMc01003（见5.4）的活动。
  2. PC专用磷脂酶C活性（ 表3）的测定。
    1. 到1.5 ml离心管中，加每分钟5,000计数单位共14个 C标记的PC（CPM）和Triton X-100的解决方案。
    2. 混合和干燥在氮气流。
    3. 添加二乙醇胺-盐酸，pH值9.8的缓冲，以及NaCl和的MnCl 2溶液和二次蒸馏水，以获得99.5微升的最终体积。涡旋5秒。
    4. 加入0.5微升酶（5微克蛋白质）的（ 即，无细胞提取物，其中过表达SMc00171存在），以引发反应。简单地混合。
    5. 孵育在30℃下4小时。
    6. 停经反应另外的甲醇250微升和125微升氯仿。
    7. 提取如先前所描述的脂质（见4.2）。
    8. 单独的脂质通过一维（1D）-tlc（参见4.3.2和4.4），并通过PSL成像分析它们。
  3. 磷脂酶A活性的测定（ 表3）。
    1. 到1.5 ml离心管中，加总14 C标记的磷脂5000 CPM和Triton X-100的解决方案。
    2. 混合和干燥在氮气流。
    3. 为最终100μl的测定法中，添加的Tris-HCl，pH值8.5的缓冲，NaCl溶液和水。涡旋5秒。
    4. 添加5微升的酶（50微克蛋白质）（ 即 ，无细胞提取物，其中过表达SMc00930或SMc01003存在）。
    5. 孵育在30℃下5小时。
    6. 停止通过加入甲醇250微升和125微升氯仿的反应。
    7. 提取如先前所描述的脂质（见4.2），独立他们通过使用1D型TLC130毫升氯仿，50ml甲醇，和20ml冰醋酸作为流动相，并且通过PSL成像分析它们。
  4. 甘油二酯（DAG）脂肪酶活性的测定。
    1. 14 C标记的DAG的制备。
      1. 放射性S.根瘤菌文化（见4.1），并提取极性脂质（见4.2）所描述的。独立S.利用在4.3.1中第二维分离所述的条件;（体积/体积20 130：50）， 根瘤菌总脂质提取物通过1D-TLC氯仿：甲醇乙酸。
      2. 由碘染色可视化的PC和用铅笔标记磷脂酰胆碱（PC）的本地化。
      3. 按照4.5中所述隔离放射性标记的PC。
      4. 通过闪烁计数定量提取PC。
        注：约32 CPM PC的预期。
      5. 治疗用0.1ü 产气荚膜梭菌磷脂酶C的PC（250,000 CPM）在50毫米的Tris-HCl，pH值7.2，0.5％的Triton X-100和10mM氯化钙2为在100μl的总体积2小时，停止加入甲醇250微升和125微升氯仿的反应。
      6. 因为他们通过1D-TLC（见4.3.2）以前和独立的描述中提取脂类。
      7. 从硅石板隔离的二酰基甘油和通过闪烁计数量化（如在4.2中描述）
    2. 二酰基甘油脂肪酶测定（ 表3）。
      1. 到1.5 ml离心管中，加入14 C标记DAG 5000 CPM和Triton X-100的解决方案。
      2. 混合和干燥在氮气流。
      3. 为最终100μl的测定法中，添加的Tris-HCl（pH为9.0）缓冲液，NaCl溶液和二次蒸馏水。涡旋5秒。
      4. 发起通过添加5微升的酶（无细胞提取物的50微克蛋白质）的反应。
      5. 孵育在30℃下4小时。
      6. 停止通过加入250微升甲醇中的反应ð125微升如前所述氯仿和提取脂质（见4.2）。
      7. 分析由1D-TLC（见4.1.3.2）和随后的PSL成像中性极性脂质。

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Representative Results

PC专用磷脂酶C SMc00171的活性的双- 对 硝基苯磷酸酯

从大肠杆菌获得的无细胞提取物大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中，其中有smc00171表达，进行了研究它们对水解二- 对硝基苯基磷酸酯的能力，使用分光光度酶促测定法中，测量形成p -NP。没有水解活性是存在于从大肠杆菌获得的无细胞提取物大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中携带一个空pET9a矢量双- 对硝基苯磷酸盐作为底物时（数据未显示）。

为形成p -NP时间的课程表明存在于无细胞提取物的量有很强的依赖性（由大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中，其中有SMc00171表示）加入到测定（ 图2A）。如果p -NP产物形成的量将在酶浓度仅取决于，酶（蛋白质）之间的浓度使用和产品在一定时间后形成的线性关系应观察。显然，这不是用于从大肠杆菌获得的无细胞提取物的情况下大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中，这已smc00171表达（ 图2B）。虽然可能有多种原因的酶活性的蛋白质浓度21指数规律变化，一个常见的原因是，在含酶蛋白质提取物的稀释液，在提取物中的其他成分可被限制性酶的活性， 即 ，潜在辅因子，稀释为好。在这样的情况下，意外地低酶活性是用稀释无细胞提取注册。通过包括3毫米的饱和浓度的MnCl 2在酶测定中，p加入形成一定时间后仅取决于酶的量-NP产物（数据未显示），这表明的MnCl 2是在大肠杆菌中的无细胞提取物为SMc00171活性的限制单元大肠杆菌 。

图2
使用人造基底双- 对 硝基苯磷酸盐 SMc00171（磷脂）活性的 图2 的测定 。对于p -NP形成的时间过程被示出使用无细胞蛋白质提取物（●10微克/毫升，■15微克/毫升， ▲其中SMc00171已表示（A）中。之后用不同量的无细胞蛋白提取物，其中SMc00171已表示（B）的40分钟温育的形成的p -NP 20微克/毫升）。误差线表示标准偏差。.jove.com /文件/ ftp_upload / 54613 / 54613fig2large.jpg“目标=”_空白“> 点击此处查看该图的放大版本。

的预测patatin启动状磷脂SMc00930和SMc01003与 不同链长的 对 硝基苯酰基酯 活动

在大肠杆菌 smc00930或smc01003表达后大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中，获得和研究了其对水解对硝基苯脂肪酰基酯能力的无细胞提取物。在酶测定，形成p -NP在分光光度计测定。次要水解活性均存在于从大肠杆菌获得的无细胞提取物各色的大肠杆菌 BL21（DE3）×pLysS中具有空pET17b载体（ 表4）时对硝基苯酰基酯NT链长被用作基材。当smc01003中表达，得到的提取物表现出不同的链长的对硝基苯酯的增加的水解。 SMc01003降解中链对硝基苯癸以及长链对硝基苯棕榈酸酯和p硬脂酸硝基苯（ 表4）。作为SMc01003为S中形成的长链游离脂肪酸的主要贡献者根瘤菌在固定相11，这是令人惊讶的是SMc01003似乎作用同样适用于中链比长链对硝基苯酰基酯（ 表4）。出乎意料的是，SMc01003也作用于短链底物如对硝基苯基丁酸酯或对硝基苯辛酸（未示出数据）。然而，这些后者基板也通过在大肠杆菌中的无细胞提取物存在的活动劣化大肠杆菌 （ 即，窝藏空VECT或pET17b），而不表达任何额外的基因，并与短链底物（C 4），在基板的一半已被大肠杆菌降解大肠杆菌固有酶（数据未显示）。显然，SMc01003需要被纯化，以澄清SMc01003是否同样适用于短期，中期和长链基板。在一般情况下， 对硝基苯酰基酯似乎没有对SMc01003好的基板这可能是可以理解的明知SMc01003是在现实中的DAG脂肪酶11。无细胞提取物，其中smc00930已表达，显示与对硝基苯酯（ 表4）高得多的酶的活性。此外，SMc00930是能够水解不同链长（C10，C12，C14，C16和C18）的对硝基苯酰基酯，虽然对硝基苯棕榈酸酯（比活性5.5毫摩尔的NP分钟- 1毫克蛋白- 1）显然是对于SMc00930最好的基材。迄今为止，physiolo为SMc00930 gical基板是不知道。

探索无论极性脂质可作为底物用于预测（磷）的脂肪酶

一旦一个（磷）脂肪酶酶法测定已与人工基质，放射性标记的脂质的混合物或纯脂质优化可以作为潜在的基材进行测试。

当测定含SMc00171-无细胞提取物具有优化的条件下14 C标记的PC，我们可以表明，SMc00171降解电脑DAG时，这是通过质谱研究8证实的结果。 SMc00171也降低32 P标记的PC磷酸胆碱和因此作为一个特定的PC-磷脂酶C（PLCP）8，即生长的磷限制性条件下诱导。

什么时候测定SMc00930-或SMc01003含优化条件下用14 C-或32 P标记的总极性脂质无细胞提取物，我们可以表明，没有磷脂是由SMc00930或SMc01003，其中对硝基苯酰基酯运作条件下劣化作为底物11。与此相反，从蛇毒市售的磷脂酶A 2是能够降解磷脂11的这种混合物。这些结果令人吃惊和意外的既是，SMc00930和SMc01003，被预测将patatin启动般的磷脂。

当测定SMc00930-或SMc01003含优化条件下用14 C-标记的二酰基甘油（DAG）的无细胞提取物，我们可以表示DAG不受SMc00930或大肠杆菌的无细胞提取物降解大肠杆菌 ，而SMc01003降低DAG并形成迁移像游离脂肪酸化合物（ 图 3）。最近，我们可以表明，SMc01003充当DAG脂肪酶能降解的DAG或单酰甘油为甘油和游离脂肪酸11（ 图4）。

图3
图3. SMc01003降低甘油二酯 。 大肠杆菌的无细胞提取物大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS中×表示SMc01003，SMc00930或含有该空pET17b载体，或缓冲液与14 C- DAG（从苜蓿根瘤菌获得）24小时孵育。在各孵育时间结束时，放射性标记的脂质提取和使用用于分离中性极性脂质流动相（参见4.3.2）通过1D-TLC分离。 FA，脂肪酸; DAG，甘油二酯。这一数字已从[Sahonero-Canavesi 等。2015年] 11修改。3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.酶甘油二酯脂肪酶DGLA（SMc01003）的功能。甘油二酯（DAG）脂肪酶降解SMc01003 DAG以单酰甘油和一种脂肪酸，再进一步降低单酰基甘油，以甘油和其他脂肪酸。 请点击此处查看这个大版本数字。

寡核苷酸
名称 		序列
（5'-3'） 		基因
出于兴趣 		酶切
网站加入		 向量
表达
oLOP149 AGGAATA CATATG CTGAACTGGACATTCACG smc01003 恩戴我 pET17b
oLOP150 ACGG CTCGAG TCAACGGGACAGCGGTTC smc01003 XhoⅠ位 pET17b
oLOP151 AGGAATA CATATG ACGGAGGTGGCGATGG smc00930 恩戴我 pET17b
oLOP152 AAA GGATCC TTATATCCCTTTCCTCCACC smc00930 巴姆 HI pET17b
cgpho171u AGCT CATATG GCGGCGGCATCGGCACCCCACAG smc00171 恩戴我 pET9a
cgpho171d ACGT GGATCC TCAGGCGGCCTGCGGTGCGAACC smc00171 巴姆 HI pET9a
粗体字母表示酶切位点。

表1用于扩增和克隆的寡核苷酸预测磷酸（脂肪酶）的基因插入pET17b或pET9a载体。引物的寡核苷酸使用所述软件15设计的。

法检测SMc00171 法检测SMc01003 法检测SMc00930
股票 零件
的Tris-HCl，pH 8.5的 25微升
2M的 的Tris-HCl，pH值9.0 25微升
1M的 二乙醇胺 - 盐酸，pH值9.8 50微升
1M的 氯化钠 40微升 150微升 150微升
1％ 的Triton X-100 200微升 200微升
50毫米 对硝基苯棕榈酸酯 12.5微升 12.5微升
200毫米 双对硝基苯基磷酸酯 2.5微升
无细胞提取物（1毫克proteiN /毫升）的候选基因表达 20微升 100微升 1微升
二次蒸馏水 887.5微升 512.5微升 611.5微升
最终体积 1毫升 1毫升 1毫升

表2.移液方案与人工 对 硝基苯酯底 优化酶检测 。

法检测 smc00171 -encoded磷脂酶C 法检测 smc01003 -编码DAG脂肪酶 为磷脂酶A活性测定优化
股票 零件
2M的 的Tris-HCl pH 8.5的 2.5微升
2M的 的Tris-HCl pH为9.0 2.5微升
100毫米 氯化锰2 3微升
1M的 二乙醇胺 - 盐酸pH值9.8 5微升
1M的 氯化钠 4微升 15微升 15微升
1％ 的Triton X-100 2微升 20微升 20微升 14 C标记的脂质（磷脂） 20微升（5000 CPM）
14 C-标记的脂质（PC）的 20微升（5000 CPM）
14 C标记的脂质（DAG） 20微升（5000 CPM）
10毫克/毫升 与表达的候选基因蛋白提取物 0.5微升 5微升 5微升
二次蒸馏水 87.5微升 77.5微升 77.5微升
最终体积 100微升 100微升 100微升

表3.优化酶测定（磷）移液方案脂酶与放射性脂类基质。

活动的单位给出（微摩尔对硝基苯酚/毫克X蛋白分钟）
粗体数字表示 对 硝基苯酯底物 的酰基链长 10 12 14 16 18
大肠杆菌提取物（背景） 16±0.3 10±1.1 13±0.3 11±0.8 10±0.6
SMc00930在大肠杆菌中表达大肠杆菌提取物 1839±283 2873±117 5517±394 3,402±65
SMc01003在大肠杆菌中表达大肠杆菌提取物 43±2.1 29±2 20±0.7 25±1.5 22±0.9
SMc00930减去背景 1823±283 1829±283 2860±117 5,506±394 3392±65
SMc01003减去背景 27±2.1 18±2 7±0.7 14±1.5 12±0.9

表4. 对 硝基苯酰基酯作为patatin启动般的脂肪酶SMc00930和SMc01003基板。

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Discussion

在过去的20年中，许多生物基因组研究已经被测序，虽然丰富的基因组序列数据已经产生，功能解释相对滞后，因此阻碍了我们的基因组功能的认识。在基因组中的基因功能的基础上相似已知功能或保守的基序的发生基因经常被分配。然而，给定基因的精确功能往往不是公知的。尤其，预计酶的结构基因不能由组学技术容易地探索由于这样的事实，大部分酶催化涉及两个基板和两个产品的复杂的反应。目前，似乎更可行，其中至少一个基底是固定的，其中，其他的都可以改变，以探索对酶的基团的底物特异性。例如，在真核生物中的蛋白质大部分磷酸化基序是公知的并用于激酶共识肽已被以生成肽芳发现在固体载体射线。使用这样的阵列和放射性标记的ATP，底物特异性和生物体的不同激酶的活性水平可以测定允许建立一个激酶组轮廓和限定底物特异性24。水解酶构成的另一大组酶对其中一个基板，水，是固定的，但对于其中待水解的其它底物的确切性质往往是未知的。对于一个新的酶的最佳测定条件没有或者是已知的事实，转换在一个多变量问题的新的酶活性的检测。因此，它可以帮助，以便能够固定衬底，以便限定在什么条件下酶的效果最好待水解。

在本手稿中，我们描述的测定条件为准（磷）的最优化与未知底物特异性的脂肪酶，并阐述了如何使用这些优化条件下在寻求重的天然底spective（磷酸）脂肪酶。本技术的意义在于以下事实荧光或发色，人工基质，模仿天然底物在一定程度的水解，可以遵循光度法25，这些测定法容易地应用于大规模研究26。由于此类测定法的灵敏度和它们的简单，以监测反应，他们可以很容易地为给定的酶进行了优化。显然，对于人工基质人们所预料的不太有利动力学常数（ 即，高K M，低K 猫 ）比对天然底物1,21特定的酶。在实践中，然而，人工基质的简便可用性和可检测如（坏）衬底酶的整个群体往往多于弥补缺点运作。一旦已经遇到的条件的酶工作（与人工底物），它会与NATUR这样做人/生理底物为好。作为潜在的脂质底物的制备和分离可费力和费时，它有保证的酶是准备结合并与有价值底物孵育它当工作是很重要的。重要的是，首先优化的酶工作条件的过程中，将允许一个新的（磷）的脂肪酶的生理底物的更快速鉴定。作为概念证明，我们已成功地用于脂酶SMc00171，SMc00930，和SMc01003 8,11的底物特异性的表征此方法。与此相反，许多传统的，可供选择的方法建立测定法（磷）的脂肪酶的活动涉及在哪里底物和产物先前是已知的反应。

显然，测定的修改，以检测最佳的酶活性可以包括使用其他荧光的，发色，或以其它方式标记的人工基质，变异的酶浓度，类型和缓冲液的浓度，或其它添加剂（ 即，洗涤剂或二价阳离子）。如果用人工基质没有检测到酶的活性，相应的酶可能正好与此基板工作，但排除在这种情况下，当然应该包括有已采取一切预防措施的保证，可能是必要的，以保持酶的活性不变（ 即，储存在4℃下无细胞提取物或更低的温度，直到使用，如果需要，为了增加蛋白酶抑制剂到无细胞提取物的鸡尾酒，以避免所关注的酶的蛋白水解降解）27。

在这个手稿提出的技术的局限性是由于这样的事实，人造基底和天然底物是彼此和后果的生物能不同的催化反应将以及1。各种面值应还建立了酶活性的最佳条件ameters为天然底物（通过改变pH值，缓冲液类型，缓冲强度，NaCl和洗涤剂的浓度如Triton X-100的缺失或不同的二价阳离子的存在下），因为它们可能变成是从对人造基底遇到的最佳条件略有不同。另一个重要的限制是，可能不是所有的（磷）的脂肪酶是通过使用人工发色底物的可检测的。例如，该酯底物的人工对硝基苯残余物简单地可能是太笨重，或表现出防止这样的衬底可以访问的酶的活性位点的其他化学性质。有人指出，DAG脂肪酶SMc01003显示低的活动，不同链长11所有对硝基苯酯底。与DAG是SMc01003和天然底物的知识DAG具有相对atively小极性头部基团，选自由甘油的只有11，它很容易可以想象，膨松对硝基苯残余简直太大易于访问SMc01003的活性位点。然而，分子细节为何对硝基苯基酯都不好底物SMc01003没有在这一点众所周知。

该协议中的关键步骤，包括采取措施，确保所研究的酶可以访问各自的基板的所有条款。例如，在搜索的生理脂类底物，这是至关重要的脂质基板在溶解形式提供。因此，建立这样的酶测定法时（在协议的5中所述），脂质基质，通常溶解在甲醇中的混合物：氯仿，应该用洗涤剂的水溶液， 即进行混合，加入Triton X-100前干燥向下用氮气将该混合物。这个过程可以确保，加入其余ingre后用于测定dients，潜在的脂质基板嵌入在去污剂胶束和作为测定期间的酶例如访问。

原则上，这里提出的技术应该是广泛适用于未来的新（磷）的脂肪酶的发现和对它们的天然底物的定义。该技术是为其他类水解酶易于扩展，但也可能是更复杂的开发与需要两个，通常是未知的，基片来完成其催化循环新酶人工基质测定。

为预测（磷）的脂肪酶或两者都不正确的衬底是已知的磷酸也不测定条件在其中酶效果很好。因此，这可能是有用的，以研究是否从人工化合物，如不同含P硝基苯化合物（ 对硝基苯基磷酸盐，二- 对硝基苯基磷酸酯的电池一些化合物， 对硝基苯棕榈酸酯），还不如基底作用。与人工基质初始酶活性的发现铺平了道路，以解决SMc00171是一个特定的PC-磷脂酶C 8方式，即SMc01003是DAG脂肪酶11，并帮助确定下SMc00930充当水解酶11的条件。显然，SMc00930的天然底物是目前还是未知数和SMc00930和SMc01003的生理环境仍有待解决。因此，提出一种生理功能为一预测的脂肪酶的任务是具有挑战性的，而且并不总是立即成功满足。使用突变体缺乏预测脂酶基因的和比较它们各自的野生型菌株可能给实验证据表明，脂酶作用与已在该协议的一部分，4）被假定在其天然菌株背景的特异性。显然，新的脂酶活性的sh的权利要求乌尔德通过体外证据表明，某些衬底被水解转化成规定的产品的支持。有时假定的生理功能可能填补空白在代谢途径或解释产生生物体的生理行为，但在其他情况下，有根本仍可能没有足够的生化知识，使一些活动的感觉。在我们的研究过程中，我们确定了几个酶的细菌降解它们的固有极性膜脂质作用，而且在某些情况下，将其转换为一个玩家在更复杂的脂质周期。例如，结合新的知识SMc00171是增长的磷限制条件下引起的，与已经存在的数据的特定PC-磷脂酶C（PLCP）8，我们可以假设，可能在很多环境变形菌存在一个新的DAG周期这引起了无磷膜脂的形成当磷是生长限制。在对照AST，当磷供应丰富，DAG是rephosphorylated到磷脂酸进入从头磷脂的生物合成，从而闭合该脂质周期并确保主要（甘油）磷脂存在于膜8,28。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

这项工作是由（在InvestigaciónCientíficaBASICA在Investigación连接国界德拉西恩西亚82614，153998，253549和178359以及118），并从提高妇女地位总署德从理事会全国国立科学城ŸTECNOLOGIA - 墨西哥（国家科学技术委员会和墨西哥）资助项目Asuntos去个人Académico-国立自治大学墨西哥（DGAPA，墨西哥国立自治大学; PAPIIT IN202616，IN203612）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform JT Baker 9180-03 TLC analysis & Lipid extraction
Methanol JT Baker 9070-03 TLC analysis & Lipid extraction
Acetic Acid JT Baker 9507-05 TLC analysis & Lipid extraction
Hexanes JT Baker 9309-02 TLC analysis & Lipid extraction
Diethylether Sigma 32203 Enzymatic assays
bidistilled water  ANY  NA Enzymatic assays
Tris Base Sigma T-1503 Enzymatic assays
HCl Baker 9535-02 Enzymatic assays
NaCl Baker 3624-01 Enzymatic assays
Triton X-100 Sigma X-100 Enzymatic assays
LB broth ANY NA Bacterial growth, 10 g tryptone + 5 g yeast extract + 10 g NaCl per liter of bidistilled water
tryptone Becton Dickinson and Company 211705 Bacterial growth
yeast extract Becton Dickinson and Company 212750 Bacterial growth
TY broth ANY NA Bacterial growth, 8 g tryptone + 3 g yeast extract + 66 mg CaCl2·2H2O per liter of bidistilled water
CaCl2·2H2O Baker 1332-01 Enzymatic assays
isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Invitrogen 15529-019 Bacterial growth
Diethanolamine Sigma D-8885 Enzymatic assays
MnCl2 Sigma 221279 Enzymatic assays
Phospholipase A2 snake venom Sigma P0790 Enzymatic assays
Phospholipase C Clostridium perfringens Sigma P7633 Enzymatic assays
Bis-p-nitrophenyl phosphate Sigma 07422AH Enzymatic assays
p-nitrophenyl stearate Sigma N3627 Enzymatic assays
p-nitrophenyl dodecanoate Sigma 61716 Enzymatic assays
p-nitrophenyl decanoate Sigma N0252 Enzymatic assays
p-nitrophenyl palmitate Sigma N2752 Enzymatic assays
p-nitrophenyl butyrate Sigma N9876 Enzymatic assays
p-nitrophenyl octanoate Sigma 21742 Enzymatic assays
Acetic Acid, sodium salt [1-14C] Perkin Elmer NEC084 Bacterial growth
dimethylsulfoxide (DMSO) JT Baker 9224-01 Enzymatic assays
Aluminium HPTLC silica gel 60 plates. Silica gel HPTLC plates size 20 x 20 cm, 25 sheets. Merck 105547 TLC analysis & Lipid extraction
Spectrometer UV/VIS Lambda 35 Perkin Elmer NA Enzymatic assays
Storm 820 Phosphorimager Molecular Dynamics NA Photostimulable Luminescence scanner 
Multipurpose Scintillation Counter Beckman Coulter NA Radioactivity Quantification
French Pressure Cell ThermoSpectronic NA  Breakage of cells
chromatography paper 3MM Chr Whatman 3030917 TLC analysis
Sinorhizobium meliloti 1021our reference 11 studied strain
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Competent cells Novagen 69451 protein expression strain
pET9a vector Novagen 69431 protein expression vector
pET17b vector Novagen 69663 protein expression vector
sterile polystyrene round-bottom tube (14 ml) Falcon Becton Dickinson 352057 radiolabeling of bacterial cultures
polypropylene microcentrifuge tubes (1.5 ml) Eppendorf 30125.15 Enzymatic assays
1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Sigma D9135 lipid standard
L-α-phosphatidylcholine, dipalmitoyl Sigma P6267 lipid standard
DL-α-monopalmitin Sigma M1640 lipid standard
palmitic acid Sigma P0500 lipid standard

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定义底物特异性的脂肪酶和磷脂酶考生
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Sahonero-Canavesi, D. X., Zavaleta-Pastor, M., Martínez-Aguilar, L., López-Lara, I. M., Geiger, O. Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates. J. Vis. Exp. (117), e54613, doi:10.3791/54613 (2016).

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