Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה

Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54616

Introduction

Murine Encephalomyelitis וירוס של Theiler (TMEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי neurotropic כי מדביק את מערכת העצבים המרכזית murine בהתמדה (CNS). בעכברים רגישים, זיהום עם TMEV גורם מחלה demyelinating החיסונית בתיווך, כרונית-פרוגרסיבי, הידועה כמחלת demyelinating הנגרמת TMEV (TMEV-IDD). זיהום ניסיוני של עכברים לוקח מהלך מחלה דומה לזו שנצפתה בצורות מתקדמות של טרשת נפוצה (MS). TMEV-IDD מאופיין בשני שלבים: בשלב האקוטי בשלב הכרוני. בשלב החריף הוא 1,2 דלקת מוח קל, בדרך כלל תת-קליני. השלב השני, כרונית, החל כחודש לאחר ההדבקה, מורכב נכות שהתקדמה לאטה מאופיין demyelination, דלקות, 1,2 נזק axonal. החולשה שנצפתה בעכברים קשור עוויתות, מדי פעם, עוויתות טוניק חמורה.

מאחר שקיימים כרגע אין medications כדי לשפר הנכות מתקדמת בחולים, חוקרים נמשכים במיוחד על ידי TMEV-IDD, המייצג במודל חיה אופטימלית לניטור השפעת סמים שינוי מחלה על התקדמות המחלה. עם זאת, בעכברים כמו גם אצל חולי טרשת נפוצים, הפיקוח על התקדמות מוגבלת הצריך הסתכלות קלינית מתמשכת לאורך תקופות ממושכות של זמן. בעכברים, ניטור ארוך טווח התקדמות נכות יכול להיות מושלם עם מבחן ביצועים Rotarod.

מבחן ביצועי Rotarod הוא מבחן התנהגותי סטנדרטי מעריך פונקציות קשורות מנוע כגון קואורדינציה, שיווי משקל, עייף במכרסמים. העכברים יש לשמור על שיווי משקלם על מוט מחרטות, אשר מסתובב תחת אצה רציפה; חביון הזמן לרדת מ מוט זה נרשם. בעלי חיים עם חוסר תפקוד נוירולוגי אינם מסוגלים להישאר על מוט מסתובב כל עוד שולטת, והם בדרך כלל להשיל כאשר מהירות סיבוב עולה שלהםקיבולת מנוע. ירידת ערך הנוירולוגיות יותר החיות יש, כמה שיותר מהר הם נופלים שבקצה המוט ואת קצר חביון הזמן הוא.

היתרון של בדיקת Rotarod על מערכות בקיע החזותיות המסורתיות הוא שזה מייצר אובייקטיבי, מדיד משתנה הזמן חביון-אשר יכול בסופו של דבר לשמש עבור ניתוחים סטטיסטיים לכמת את ההשפעות של טיפולי פרוצדורות 3.

במעבדה של Neuroimmunology (לוני) ב Dartmouth, עכברים כפופים פרוטוקול הסתגלות, שבו הם נבחנים לפני ההדבקה TMEV כדי לערוך להם היכרות עם המכונה ועל מנת להעריך את "הבסיס" ושליטה מוטורית תיאום האיזון הרגיל שלהם 4, 5. לאחר הבסיס הוא הקים את עכברים נגועים עם TMEV, הם נבחנים פעם או פעמיים בשבוע במשך תקופה של מספר חודשים. פרוטוקול הבדיקה בפועל נמשך בממוצע 150 ימים, ובכך מאפשר הערכה שלהירידה של שיווי משקל, קואורדינציה, ושליטה מוטורית על כל מהלך מחל demyelinating.

כמה מאות TMEV-IDD ואת שטופלו דמה עכברים נבדקו עד כה עבור ליקוי נוירולוגי בדארטמות. עכברים אלו קיבלו טיפולים אימונו שונים, אבל לא תרופתי כבר נמצא יעיל בהפחתת התקדמות הנכות 6,7. המאמר הנוכחי ואת הפרוטוקול הקשור מתארים כיצד לאפיין את ליקוי הנוירולוגים המתקדם שהפגין עכברי TMEV-IDD. במיוחד, הפרוטוקול מציע המלצות של פרמטרים לבדיקה ספציפיים ככל הנראה מתאים בדרך כלל לומד נכות נוירולוגית בעכברי TMEV-IDD באמצעות מבחן Rotarod. הליך זה מספק בסיס, שלעומתו ניתן להעריך (1) הרלוונטית של מודל העכבר הזה ל- MS המתקדמת (2) התועלת שלה לבדיקת טיפולים שמטרתם בטיפול במצבי נוירולוגית מתקדמות כגון MS. ברור,מבחן ביצועי Rotarod והפרוטוקול ופרמטרי בדיקות אופטימיזציה הנוכחי אינם יעילים רק באיתור נכות נוירולוגית הדרגתית במודל עכבר TMEV-IDD, אבל הם גם שימושיים בחשיפת ליקויים הנגרמת וירוס אחרים ו / או עכבר גנטי מודלים של מחלות ניווניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודת החיה מנצלת פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר Geisel לרפואה בדארטמות.

1. במודל עכבר

  1. אינדוקציה של מחלות demyelinating TMEV-מושרה
    1. הזז את הכלובים המכילים 4- לעכברי SJL בת 6 שבועות בן / JHan מהמדף למרחב עבודה נוח. סמן את העכברים (למשל, עם תג אוזן או אגרוף באוזן), כדי לאפשר הערכה פרטנית של מחלה קלינית היסטולוגית.
    2. צייר 30 μl של המניה מדביק TMEV (2 x 10 6 יחידות פלאק ויוצרים; PFU) ב- PBS לתוך מזרק אינסולין 29-מד המחט.
    3. הכן את מכונת גז הרדמה: לבדוק את המערכת כדי להבטיח את נוכחותם של כמויות מספיקות של חמצן isoflurane למשך ההליך.
    4. הפעל את מד הזרימה עד 1 ליטר / דקה. מניחים את החיה לתוך תא אינדוקציה ולסגור את הדף. הפעל את vaporizer ל -3.5% ולנטר את החיה עד שכיבה.
    5. הסר את החיה מן החדר ולבדוק את העכבר על ידי צובט את שודד הדרכים כדי להבטיח הרדמה נאותה. חוסר בתגובת קמצוץ חזק מצביע הרדמה נאותה.
    6. נקה את הזריקה עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
    7. להזריק את 30 μl של המניה מדביק TMEV לתוך הימנית של המוח הגדול בזריקה ביד חופשית (איור 1). האתר של הזרקה הוא בערך באמצע הדרך בין קו העין ואוזן ואת ממש ליד קו האמצע.
    8. החזר את העכבר לכלוב החזקתה פעם ערנית לחלוטין וניידת (בדרך כלל 3 - 5 דקות).
    9. להרדים עכברים ידי exsanguination או זלוף לב 3 עד 6 חודשים לאחר הדבקת TMEV, תלוי במהירות של התפתחות המחלה.

2. ניתוח Rotarod

  1. מנגנון Rotarod
    1. עכברי מבחן לפני הדבקת TMEV לערוך להם היכרות עםמכונת להעריך מלאת בסיס איזון תיאום מנוע הרגילה שלהם.
    2. הפעל את פרוטוקול הסתגלות על -5 ימים לאחר ההדבקה (dpi; כלומר, 5 ימים לפני ההדבקה TMEV).
    3. אפשר העכברים להסתגל לחדר הבדיקה טרם תחילת 30 דקות לפחות בדיקות כדי Rotarod, על מנת לאפשר להם להסתגל לסביבה.
    4. ודא כי הן יחידת Rotarod והמחשב מופעלים ומחוברים זה לזה (איור 2).
    5. טרום להגדיר את Rotarod עם פרמטרי פרוטוקול אימון dpi -5, כמתואר בטבלה 1.
    6. שמור את קובץ העבודה עם המידע עדכני והזדהות.
    7. הזז את הכלוב ובו הכיתה להיבדק מהמדף אל שולחן סמוך Rotarod. עכברים בדרך כלל נבדקים חוליות 4.
    8. תרים עכבר בזנב ולמקם אותו על המוט, עם גב מהמפעיל. חזור על השני באמצעות העכבר הרביעי. אם FAL עכברls או קופץ, ומכניס אותו מנתיבה על Rotarod עד שכל העכברים נמצאים בעמדה. התעלם אם בכלל עכברים להסתובב להתמודד עם המפעיל.
    9. לאחר טעינת כל העכברים, ולחץ על כפתור "Enter" כדי להתחיל את הניסוי. שימו לב טיימרים להתחיל באופן אוטומטי ואת הסיבובים לדקה (סל"ד) על תצוגה עבור כל שביל.
      1. כמו כל חיה נופלת מן המוט, להקליט את המהירות של המוט בעת הנפילה, כמו גם את משך הזמן שבו החיה נשארת על המוט. המוט ימשיך לסובב עד שהחיה האחרונה נפלה ממכלול המוט.
    10. אחרי כל העכברים נפלו, השתמש במטלית כדי להסיר כל boli ושתן צואה מן המוט. הנוכחות של שתן חומר צואתי יכולה להשפיע על היכולת של עכברים כדי לאחוז את המוט.
      1. לאחר מנוחה של 3 דקות, לתת העכברים שניים ולאחר מכן לערוך מחקר שלישי. הזמן המקסימאלי לכל ניסוי יחיד הוא 240 שניות. נהל סך של 3 ניסויים במהלך כל היום בדיקות.
    11. החזר את העכברים לכלוב ביתם ולהחזיר אותם בחזרה אל המדף. בסוף פגישת הניסוי, לנקות את Rotarod עם מים וסבון כדי להסיר את כל הצואה את המכונה.
    12. נקה את baseplate עם 70% אתנול. תרסיס את המכונה כולה עם דו תחמוצת כלור לחיטוי.
    13. בימים - 4, - 3, - 2, ו - 1 pi, מראש להגדיר את Rotarod עם פרמטרים פרוטוקול הכשרה מתאימה, כפי שמתואר בטבלה 1, וחזור על שלבים 2.1.2 עד 2.1.12.
    14. לאחר קבלת אמצעי הבסיס, להדביק את העכברים עם TMEV. אפשר תקופת החלמה pi ל- 6 ימים.
פרוטוקול יום הבדיקה תדירות מהירות ההתחלה (סל"ד) מקסמהירות (סל"ד) תְאוּצָה ניסויים ITI
(סל"ד / sec) (N x שניות) (דקות)
הַדְרָכָה - 5 dpi יום 1 1 12 03/01 3x240 שניות 3
- 4 dpi יום 1 1 13 03/01 3x240 שניות 3
- 3 dpi יום 1 1 14 03/01 3x240 שניות 3
- 2; - 1 dpi יום 1 5 40 03/01 3x240 שניות 3
נִסיוֹנִי מ +7 כדי +50 dpi 2 / שבוע 5 40 30/05 3x240 שניות 3
מ 51-150 dpi שבוע 1 5 40 30/05 3x240 שניות 3

טבלה 1: Rotarod פרמטרים באימוני פרוטוקולי ניסוי.

  1. פרוטוקול הניסוי Rotarod
    1. ביום +7 dpi, מראש להגדיר את Rotarod עם פרמטרים פרוטוקול הניסוי המתאים, כפי שמתואר בטבלה 1. חזור על שלבים 2.1.2 עד 2.1.10.
    2. בסוף הניסוי # 3, שוקל כל עכבר ולעשות לעצמך את משקל הגוף על גליון הנתונים. לנקות ולחטא את Rotarod לפי השלבים 2.1.11 ו 2.1.12.
    3. בדוק את העכברים פעמים בשבוע במשך 6 השבועות הבאים, כפי שתואר לעיל. לאחר 6 שבועות (שבו העכברים הגיעו סביר בשלב מפנה) 8,9, לבדוק את העכברים פעם בשבוע עם אותה experimentaפרוטוקול l. פרוטוקול הבדיקה בפועל נמשך בממוצע 150 ימים, תלוי כמובן המחלה הספציפית.
  2. אינדקס נוירולוגיות פונקציונלי
    1. לייצא את הנתונים הגולמיים לתוך קובץ גיליון אלקטרוני לנתח את התוצאות.
    2. נתונים אקספרסים ככל שהזמן פועלים (איור 3 א): זוהי הפעם ריצה הרגילה בתוספת זמן הסיבוב הפסיבי פחות זמן עיכוב סיבוב (טבלה 2) 10. חשב את זמן הריצה הממוצע של שלושה ניסויים ליום.
    3. אין מהיר הנתונים כמדד פונקציונלי נוירולוגיות (NFI; איור 3).
      1. חשבתי את סף ביצועי הבסיס של כל עכבר בודד. סף ביצועי בסיס נקבע כממוצע של כל זמנים פועלים מהיום + 15 עד + 45 pi 6,7.
      2. חשבתי את NFI כממוצע של שלוש רצות הממוצע האחרונות מחולק סף ביצועי בסיס של זה 6,7 עכבר ספציפי </ Sup>.
        הערה: אם נבדק פעמים רצופות עבור עכבר ביום + 72, + 76, ו + 79 pi הם 55 שניות, 45 שניות, ו -50 שניות, ובפעם הבסיס לאותה העכבר היה 135 שניות, את NFI בשביל זה עכבר על 79 dpi יהיה [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 או 0.37.
    4. לבטא את הנתונים כקובץ NFI מתואם (adjNFI; איור 3 ג): להתאים את נתוני NFI לפי ערך אוכלוסייה עבור הניסוי הבודד.
      1. חשב את adjNFI על ידי חלוקת שווי NFI ידי הממוצע NFI שהשיגו בקבוצה שטופלה-דמה באותו יום ספציפי.
טווח הַגדָרָה
זמן ריצה רגיל הזמן הכולל העכבר מבלה פועל באופן פעיל על מוט מסתובב, כלומר, חביון ליפול.
זמן סיבוב פסיבי אהר של זמן העכבר נשאר על המוט במצב הסיבוב הפסיבי.
זמן השהיה סיבוב משך זמן העכבר נשאר על המוט במהלך מצב הסיבוב הפסיבי
מצב סיבוב פסיבי כאשר העכבר תופס את המוט מסתובב מבלי ambulate.
זמן הפעלה סה"כ הסכום הכולל של זמן העכבר נשאר על מוט מסתובב במהלך הפגישה.
ביצועי Baseline ביצועי המנוע טרום נזק העריכו לקבוע סף הביצועים מינימום.
מדד תפקוד נוירולוגי (NFI) מדד קליני, אשר משווה כל ביצועי מנוע עכבר, כלומר, זמן ריצה, בכל עת כדי ביצועי השיא שלה.
מדד תפקוד נוירולוגים מתואם (adjNFI) כאשר תהליך נורמליזציה מוחל להתאים נתוני NFI לפי ערך אוכלוסייההניסוי היחיד.
ערך האוכלוסין ממוצע ערך NFI מתקבל על ידי הקבוצה שטופל מדומה ליום מסוים.

טבלה 2: הגדרות של Rotarod פרמטרים שאומצו לכמת נוירולוגיות ירידת ערך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת הניסוי נציג זו הייתה להשוות את נכות נוירולוגית הנגרמת על ידי זן דניאלס (DA) ומתח שעועית של TMEV. למטרות המחקר הנוכחי, קבוצה של 32 נקבות עכברים SJL נדבקו intracranially עם TMEV, או זן DA (n = 16) או זן שעועית (n = 16), וסימנים קליניים שלהם נוטרו לאורך זמן. קבוצה נוספת של 20 עכברים טופלה דמה (כלומר, תמיסת מלח הוזרקה intracranially) ושמשה בקבוצת ביקורת בריאה.

מבחן ביצועי Rotarod שמש כדי להעריך את התקדמות המחלה הכרונית בעכברי TMEV נגועים ובקרות דמה. עכברים היו בנפרד אוזן מסומנת נתון פרוטוקול ההסתגלות יומי בשבוע לפני זריקה של TMEV ואז פרוטוקול הבדיקה בפועל שנמשך 125 ימים. עבור כל יום בדיקות, הזמן רץ, המוגדר אורך tiלי העכבר נשאר על המוט, אוחסן בנפרד עבור כל עכבר כממוצע של 3 הניסויים לאותו יום. נתונים Rotarod מתבטא גם NFI וכפי adjNFI דמה-מנורמל.

כפי שניתן לראות באיור 3 א, זיהום עם TMEV השפיע לרעה על זמני הריצה של העכברים. A-מדידות חוזרות דו כיוונית ANOVA חשפו השפעה משמעותית של זיהום TMEV (F = 56.76, p <0.0001), כמו גם השפעה משמעותית של זמן (F = 3.26, p <0.0001) ו אינטראקצית טיפול בזמן (F = 8.065, p <0.0001). המבחן להשוואות המרובה של באי Dunnett גילה כי שני הקבוצות של עכברי TMEV נגועים היו משמעותי ערכי NFI נמוכים מאלה של עכברי דמה (p ≤ 0.01; איור 3). ההבדל היה מובהק סטטיסטית החל מ יום + 61 pi עד סוף המעקב (איור 3 ב). לא נמצא הבדל שיתוף mparing התקדמות הנכות עכברים נגועים עם זן קטניות אלה נגועים עם זן DA בכל נקודות הזמן (p> 0.5; איור 3 ג).

איור 1
איור 1:. הזרקה תוך גולגולתי כדי לבצע זריקות תוך-גולגולתי, העכבר הוא הרדים-גז ומאופק על משטח מוצק. עד 30 μl מוזרקים בבטחה לתוך מוח העכבר. האתר של הזרקה הוא כמחצית דרך בין קו העין ואוזן ואת ממש ליד קו האמצע. מחט 30 G ישירות מפלחת את הגולגולת, ואת מזרק אינסולין משמש נוח כדי למנוע את המחט מלהעמיד עמוק מדי לתוך המוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גיל = "1"> איור 2
איור 2:. מנגנון Rotarod מבחן Rotarod הוא assay נוירו-התנהגותיות רגיל, שבהם מאומנים עכברים לרוץ על מוט מסתובב מתואמים עבור כמה זמן הם יכולים להישאר על המוט כפי שהוא מאיץ לאט. מוט מושעה מעל רצפת הכלוב, ועכברים באופן טבעי מנסים להישאר על מוט כדי להימנע מליפול אל הקרקע. הירידה מן המוט לבסיס של המכשיר לא גורמת לפגיעת העכברים. א) מנגנון Rotarod סטנדרטי מורכב מוט מונע במנוע עם מהירויות קבועות או מואצות. B) פנל לחלק את המוט לתוך נתיבים נפרדים, כל אחד מתאים חית פרט. מספר כולל של 4 עכברים ניתן לבדוק במהלך כל ניסוי. ג) המוט הוא 1.18 ב. (כ -3 סנטימטרים) קוטר, ופני השטח שלו הוא המחורצים, המאפשר עכברים כדי לקבל אחיזה טובה יותר. הנפילה של העכבר הוא במעקב דווקא על ידי קרן לצילוםבאופן אוטומטי מתעד את כמות הזמן המושקעת על המוט. נתוני הניסוי נרשם במחשב לאחר העכברים כל נפלו מן המוט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. מבחן ביצועי Rotarod עכברי TMEV נגוע Sham-שולט מבחן Rotarod בוצע למדוד תפקוד מוטורי של אחיזת עיניים, נגוע DA, ועכברי שעועית נגועות. מלבד זמן ריצה (sec) (א), נתונים Rotarod באו לידי ביטוי גם כמדד תפקוד נוירולוגי (NFI) (B), וכן NFI המתואם-מנורמל דמה (adjNFI) (C). ההשהיה ליפול מתוך מאיץ Rotarod נמדדה בשלושה ניסויים ליום. נתונים מוצגים כפי סטיית התקן ± הממוצע של הממוצע (SEM). Blue עיגול, n = 16 עכברים נגועים שעועית; ריבועים אדומים, n = 16 עכברים נגועים DA; משולש שחור, n = 20 שולט שטופל דמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות מספר מגבלות, מבחן ביצועי Rotarod מייצג כלי חשוב להערכת תפקוד מוטורי ועל תפקוד TMEV-IDD וכן את ההשפעה של התערבויות פרמקולוגיות על התקדמות מוגבלת בעכברים.

מבחן Rotarod תואר לראשונה בשנת 1957 ככולים למדידת גירעונות נוירולוגיות במכרסמים 11. מכרסמים צריך ללכת על מוט מסתובב, עם הגברת מהירות סיבוב, ולנסות להימנע מליפול אל הקרקע. ההשהיה ליפול הוא מוקלט ומשמש כנקודת הקצה כמותיים התפקוד המוטורי: ירידת נוירולוגיות יותר החיות יש, כמה שיותר מהר הם נופלים שבקצה המוט. היתרון הברור של מבחן זה על מערכות בקיע החזותיות המסורתיות הוא שזה יוצר משתנה אובייקטיבי, שניתן להשתמש בם למטרות סטטיסטיות לכמת את ההשפעות של טיפולי פרוצדורות על התקדמות מוגבלת 3. מערכות הבקיע חזותית כגון Refle ליישרמבחן x עשוי להיות מועדף כעל מבחן פשוט יותר ויותר מהיר להעריך את היכולות של תנועה בעכברים. עם זאת, מערכות אלו חסרות את הדיוק של מבחן כמוני יותר כמו מבחן ביצועי Rotarod, והם צריכים ולכן לא ניתן להשתמש כדי לפקח על תולדות טבע או שינויים פנוטיפי של עכברים עם ליקוי נוירולוגים קל ומתקדם. מצד השני, בדיקות ויזואלית כמו המבחן רפלקס ליישר מותאמות במיוחד לעכברים כי הם צעירים מדי או המושפעת גם להיבדק על Rotarod.

על מנת להימנע הערכות מעוותות של מבחן Rotarod, פרמטרי הבדיקה (כלומר, גודל, מהירות, אצה של המוט מסתובב; כמות אימונים שניתנו החיה; ועיבוד נתונים סופי) חייבות להיות משוכפל 3 בקפידה. היום, מבחן ביצועים Rotarod עדיין מבחן התנהגותי המנוע הנפוץ ביותר, ובכל זאת יש קונצנזוס קצת על הפרמטרים בדיקות אידיאלי לייצר תוצאות אופטימליות. מצאנומחקרים שנעשו בעכברים TMEV-IDD שהשתמשו בקטרים מוט מן 1.18 כדי 1.6. (3 עד 4 ס"מ) 12,13, שיעורי במהירות קבועה של 5 עד 10 סל"ד 12,13, ושיעורי האצה של 5 עד 10 סל"ד / min 12-14. עם זאת, לא ידוע אם המסקנות לגבי הבדלי נוירולוגיות היו להכליל תנאי בדיקה אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציע המלצות של פרמטרים לבדיקה ספציפיים כי היו אופטימיזציה ועל כן הם מתאימים ללימוד נכות נוירולוגית הדרגתית במודל עכבר TMEV-IDD של MS באמצעות מבחן Rotarod. במיוחד, לפני היציאה על מחקר תפקוד מוטורי Rotarod בעכברים, מומלץ כי מספר פוטנציאלי חשובים גורמים בין יתר, ביצועי בסיס וסיבוב-להיות פסיבי נחשב.

ראשית, ביצועי בסיס לגבי: למימוש ועכברים נגועים לשפר את ביצועי המנוע שלהם לאורך זמן, בסופו של דבר להגיע לרמה יציבה על פני מספר ימים או שבועות 8,9. זהו התוצאת דואר של התהליך הנורמלי של למידה מוטורית. עם זאת, שיפור זה אינו קבוע, ואם העכברים נותרים מאומנים במשך כמה ימים, ביצועי המנוע שלהם על מוט המסתובב ירדו 9 במהירות. לכן, קביעת ביצועי בסיס חיונית להבדיל בין למידה המוטורית והתאוששות בפועל לאחר התערבות טיפולית, כמו גם בין ירידה ביצוע מנוע פיזיולוגית החמרה עקב הליך הניסיון.

פרוטוקול Rotarod אופטימיזציה שלנו מצפה להכשיר עכברי TMEV-IDD לעומת עלייה של 15 עד + 45 dpi (כלומר, בין דלקת המוח החריפה, דבר המתרחש בתוך + 3 + 12 dpi, ומחל demyelinating הכרונית מאוחר, מפתחת לעומת עלייה של 30 עד + 40 dpi) 15. זה מאפשר ההערכה של ביצועי מנוע כתוצאת demyelination פרוגרסיבי ובכך מוציא מכלל חשבון כל גירעונות תורמים בשל דלקת המוח מוקדם. באופן אידיאלי, אימוני Rotarod צריכות להתבצע לפניאינדוקצית מחלה. עם זאת, על מנת לפתח דלקת כרונית של מערכת העצבים המרכזית, עכברים SJL צריך להיות מוזרק בווירוס לפני 7 th בשבוע בגילם 16. מאז מקובל כי גילי חיות שמבחן Rotarod יכול להתבצע על הוא 8 עד 26 שבועות 17, אימון יעיל לא ניתן להשלים בעכברים לפני הדבקת TMEV.

הדרכת הערכת ביצועי בסיס חשובה גם הביאו בחשבון את ההשפעה של מוטיבציה נמוכה, ביצועי בסיס נמוכים, ומיומנויות למידה נמוכות. כל חיה שונה, והבדלים אלה צריכים להילקח בחשבון בהערכה ביצוע מנוע. זה לתיקון הטוב ביותר באמצעות מדד מנורמל ביצועי בסיס, הידוע גם בתור NFI. מדד זה גם מהווה תנודות ביצועים שהיו יכולים להיות שנצפו בעכברים במהלך הפעלות בדיקות שונות. השתנות ביצועים היא בעיה נפוצה בדיקות התנהגותיות, בעיקר בשל גורמים מחוץ ניסיוניפרוטוקול, מוטיבציה נמוכה כאלה חוויות עבר של החיה. הממוצע פועל פעמים במשך שלוש הנקודות בפעם האחרונות של כל עכבר מספק אומדן של הנטייה המרכזית של ההפצה צפויה אם ביצועים נשארו יציבים. זה מסביר היום-יום השתנות ביצועים אישיים. נכות נוירולוגית חמורה מוגדרת ולאחר מכן על ידי ערכי NFI של פחות מ או שווה ל 0.3, ואילו עכברים מושפעים יחסית הם הבקיע עם NFI ערכי גדול או שווה ל -0.7. למרבה הצער, גישה זו אינה מסירה את הבעיה כי שינויי מוטיבציה עלולים להשפיע על ביצועי מנוע. כדי להמשיך להתמודד עם בעיה זו, עכברים עשויים להיות מאומנים בתוספת תכונות מניע ספציפיות, כגון מניעת מזון קלה לפני אימון או פחד מוגבר לנפילה הנגרם על ידי לגבהים נופלים מתכווננת של 17.5 עד 23.5 ב. (44.5 עד 60 סנטימטרים).

שנית, לגבי סיבובים פסיביים או חוזר על עצמם: אולי האיום הכי החשוב הוואליdity של נתוני Rotarod הוא המופע של סיבובים פסיביים המתעוררים כאשר העכבר יכול להיאחז ולסובב פסיבי כמו המוט בן 18. למרות סיבוב פסיבי הוא ציין על Rotarod, במיוחד בעכברים חווים בעיות קואורדינציה מוטורית, התנהגות התמודדות זה עלולה לגרום מאוחר נופל שבקצה המוט אשר היה שגויים מצביע על היעדר גירעונות מנוע. לכן, מדד משני של קואורדינציה מוטורית מופרעת, שאמור להיחשב בניתוח הנתונים, הוא הספירה של מספר פעמי העכבר מסתובב המוט בלי לנפול. כמו כן, סיבוב פסיבי מושפע במידה רבה על ידי פרמטרי משימה כמו קוטר, מהירות והאצת מידת המוט 18. אין פתרונות מושלמים להפחתת הסיכון של סיבוב פסיבי, אבל החלטה אפשרית עשויה להיות שימוש מוט בקוטר גדול יותר (כלומר, 1.18 עד 3.15 ב. (3 עד 8 סנטימטרים)) או פחות רכסים בולטים כדי מעט להפחית את האחיזה של העכבר. </ P>

הגבלה של מבחן ביצועי Rotarod היא כי הערכת המנוע מוגבלת זמן תצפית קצר. יתר על כן, בדיקות בנקודות זמן שונות במחזור האור הכהה עשויה לשנות את התוצאה של בדיקות התנהגותיות 19. לכן, על מנת להתגבר על בעיות אלה, מספר חברות מפתחות מערכות ניתוח חדשני בכלוב בבית המספקים ניטור 24/7 של התנהגויות מכרסמים. מערכות ניטור אלה בוודאי לייצג את הטכנולוגיה החדישה והמרגשת ביותר זמינה במחקר מכרסם התנהגותי, אבל עדיין הם יקרים מאוד ולא תמיד נגישים מעבדות מחקר.

לסיכום, מבחן ביצועים Rotarod הוא מבחן פשוט יחסית, זול, היטב מאופיין להערכה ארוכת טווח של נכות נוירולוגית TMEV-IDD, מודל Murine של MS פרוגרסיבי. היתרון של מבחן זה על התסמינים הקליניים המסורתיים להבקיע מערכות הוא שזה יוצר משתנה אובייקטיבי קואהntify את ההשפעות של תרופות שונות, תנאים, ונהלים על תפקוד מוטורי. בהתחשב חוסנו של מבחן ביצועים Rotarod, על ידי החלת כמה אמצעי זהירות פשוטים, כפי שתואר לעיל, הליך זה מספק הבסיס, שלעומתו ניתן להעריך (1) הרלוונטיות של המודל העכבר TMEV-IDD ל- MS מתקדמת (2) התועלת שלה לבדיקת טיפולים שמטרתם בטיפול במצבי נוירולוגית מתקדמות כגון MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old Envigo #052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer Harvard Apparatus #340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc BD #328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software Columbus Instruments #0890M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  2. Pachner, A. R. A Primer of Neuroimmunological Disease. , Springer. New York. (2012).
  3. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).
  4. McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination. Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).
  5. Zoecklein, L. J., et al. Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus. Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).
  6. Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).
  7. Li, L., et al. The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).
  8. Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines. Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).
  9. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).
  10. Columbus Instruments Rotamex-5 Manual. , 1-33 (2005).
  11. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).
  12. Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis. J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).
  13. Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis. Pain. 136, 293-304 (2008).
  14. Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS. J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).
  15. Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis. Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).
  16. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).
  17. International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from: Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).
  18. Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination. J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).
  19. Hopkins, M. E., Bucci, D. J. Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day. Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).

Tags

Neuroscience גיליון 117 התקדמות נכות טרשת נפוצה מודל וירוס של Theiler מחלות demyelinating Rotarod מדד נוירולוגיות
מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gilli, F., Royce, D. B., Pachner, A. More

Gilli, F., Royce, D. B., Pachner, A. R. Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (117), e54616, doi:10.3791/54616 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter