Introduction
تايلر الفئران التهاب الدماغ فيروس (TMEV) هو فيروس RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل موجه للعصب الذي يصيب باستمرار الجهاز العصبي المركزي الفئران (CNS). في الفئران عرضة، والعدوى مع TMEV يسبب والمرض المزيل لل-المزمنة التدريجي المناعة بوساطة، والمعروفة باسم يسببها TMEV المرض المزيل (TMEV-IDD). العدوى التجريبية من الفئران يأخذ مسار المرض تشبه تلك التي شوهدت في أشكال التدريجي لمرض التصلب المتعدد (MS). يتميز TMEV-الاتصال الدولي المباشر من قبل مرحلتين متميزتين: المرحلة الحادة والمرحلة المزمنة. المرحلة الحادة هو معتدل، عادة تحت الإكلينيكي التهاب الدماغ 1،2. المرحلة الثانية، المزمنة، ابتداء نحو شهر بعد الإصابة، يتكون من العجز تتقدم ببطء تتميز إزالة الميالين، والالتهابات، ومحور عصبي 1،2 الضرر. ويرتبط ضعف لوحظت في الفئران مع التشنج، وأحيانا تشنجات منشط شديدة.
لأن هناك حاليا أي medicatioنانو ثانية للتخفيف من العجز التقدمية في المرضى، تنجذب الباحثين بشكل خاص TMEV-الاتصال الدولي المباشر، وهو ما يمثل نموذج حيواني الأمثل لرصد تأثير الأدوية المعدلة للمرض على تطور المرض. ومع ذلك، في الفئران وكذلك في مرضى التصلب المتعدد، ورصد تطور العجز يتطلب المراقبة السريرية مستمرة على مدى فترات طويلة من الوقت. في الفئران، ورصد طويلة الأجل لتطور العجز ويمكن تحقيق ذلك مع اختبار الأداء Rotarod.
اختبار الأداء Rotarod هو اختبار السلوك القياسية التي تقيم وظائف المرتبطة السيارات مثل التنسيق والتوازن، والتعب في القوارض. الفئران لها للحفاظ على توازنها على قضيب تحول، والذي يدور في ظل التسارع المستمر. الكمون الوقت لتسقط من يتم تسجيل هذا قضيب. حيوانات مع خلل عصبي غير قادر على البقاء على قضيب الدورية طالما الضوابط، ويسقطون عادة قبالة عندما تتجاوز سرعة دورانهاقدرة المحرك. انخفاض القيمة أكثر عصبية والحيوانات لديها، وكلما كانت تسقط على قضيب، وأقصر الكمون الوقت.
الاستفادة من تجارب Rotarod على أنظمة التسجيل البصرية التقليدية هو أنه يولد موضوعي وقابل للقياس متغير الوقت الكمون والتي يمكن استخدامها في نهاية المطاف التحليلات الإحصائية لقياس آثار العلاجات والإجراءات التجريبية 3.
في مختبر علم المناعة العصبية (لوني) في دارتموث، يتعرض الفئران لبروتوكول التكيف، حيث يتم اختبارها قبل العدوى TMEV من أجل تعريفهم على آلة وتقييم العادي "الأساس" التنسيق توازنها والتحكم في المحركات 4، 5. وبمجرد وضع خط الأساس وإصابة الفئران مع TMEV، يتم اختبارها مرة واحدة أو مرتين في الأسبوع على مدى عدة أشهر. بروتوكول الاختبار الفعلي يستمر في المتوسط 150 يوما، مما يتيح إجراء تقييم للتراجع التوازن والتنسيق، والتحكم في المحركات على مدى كامل من هذا المرض المزيل.
وقد تم اختبار عدة مئات من TMEV-الاتصال الدولي المباشر والمعالجة الصورية الفئران حتى الآن عن خلل عصبي في دارتموث. وكانت هذه الفئران تلقت العديد من العلاجات المناعية، ولكن لم يتم العثور على وكيل الدوائية لتكون فعالة في تخفيف تطور العجز 6،7. هذه المادة وعلى البروتوكول المتعلق تصف كيفية تميز إعاقة للجهاز العصبي التدريجي المعروضة من قبل الفئران TMEV-الاتصال الدولي المباشر. بشكل خاص، بروتوكول يقدم توصيات يختبر معلمات معينة يعتقد أنها مناسبة بشكل عام لدراسة الإعاقة العصبية في الفئران TMEV-الاتصال الدولي المباشر باستخدام اختبار Rotarod. يوفر هذا الإجراء خط الأساس يمكن على أساسها تقييم (1) أهمية هذا نموذج الفأر لمرض التصلب العصبي المتعدد التدريجي و(2) فائدته لاختبار العلاجات التي تهدف إلى علاج الحالات العصبية التقدمية مثل MS. ومن الواضح أناختبار الأداء Rotarod والحاليين بروتوكول المعلمات الاختبار الأمثل وليست مفيدة فقط في الكشف عن الإعاقة العصبية التقدمية في نموذج الفأر TMEV-الاتصال الدولي المباشر، بل هي أيضا مفيدة في الكشف عن ضعف في نماذج أخرى يسببها فيروس و / أو الماوس الجيني للأمراض الاعصاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كل عمل الحيوان يستخدم بروتوكولات مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في مدرسة جيزل الطب في دارتموث.
1. الفأر نموذج
- تحريض المرض المزيل للالمستحثة TMEV-
- نقل الأقفاص التي تحتوي البالغ من العمر 6 أسابيع-4- إلى الإناث SJL / JHan الفئران من رف إلى مساحة عمل مريحة. بمناسبة الفئران (على سبيل المثال، مع علامة الأذن أو لكمة الأذن) للسماح للتقييم الفردي للأمراض السريرية والنسيجية.
- رسم 30 ميكرولتر من اصابة الأسهم TMEV (وحدات تشكيل 2 × 10 6 اللوحة، PFU) في برنامج تلفزيوني في حقنة الأنسولين 29 عيار والإبرة.
- إعداد آلة غاز التخدير: التحقق من نظام لضمان وجود كميات كافية من الأكسجين والأيزوفلورين لمدة الإجراء.
- بدوره على تدفق متر إلى 1 لتر / دقيقة. وضع الحيوانات في غرفة تحريض وختم أعلى. تشغيل زارة شؤون المحاربين القدامىporizer إلى 3.5٪، ومراقبة الحيوانات حتى راقد.
- إزالة الحيوان من الغرفة واختبار الماوس عن طريق معسر قاطع الطريق لضمان التخدير المناسب. عدم الاستجابة لقرصة قوية تشير التخدير المناسب.
- تنظيف موقع الحقن مع 70٪ ايزوبروبيل.
- حقن 30 ميكرولتر من الأسهم اصابة TMEV في نصف الكرة المخية اليمنى عن طريق الحقن مرفوعة (الشكل 1). موقع الحقن هو في منتصف المسافة تقريبا بين خط العين والأذن وقبالة خط الوسط.
- عودة الماوس إلى القفص حصتها مرة واحدة في حالة تأهب والمحمول بالكامل (عادة 3-5 دقائق).
- الموت ببطء الفئران عن طريق استنزاف أو نضح القلب بعد 3-6 أشهر العدوى TMEV، اعتمادا على سرعة تطور المرض.
2. تحليل Rotarod
- جهاز Rotarod
- الفئران اختبار قبل العدوى TMEV لتعريفهمآلة وتقييم الرقابة التنسيق توازن خط الأساس والمحرك وضعها الطبيعي.
- بدء تشغيل بروتوكول التكيف في أيام -5 إصابة آخر (نقطة في البوصة، أي قبل 5 أيام من العدوى TMEV).
- السماح للفئران حتى يتأقلم إلى غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل Rotarod الاختبار، وذلك لتمكينهم من التكيف مع البيئة.
- تأكد من أن كل وحدة Rotarod والكمبيوتر وتوصيله في ومتصلة مع بعضها البعض (الشكل 2).
- قبل تعيين Rotarod مع -5 نقطة في البوصة المعلمات بروتوكول التدريب، كما هو موضح في الجدول رقم 1.
- حفظ ملف العمل مع التاريخ وتحديد المعلومات.
- نقل قفص يحتوي على تشكيلة لفحصها من رف إلى الجدول المجاور لRotarod. يتم اختبار الفئران عادة في مجموعات من 4.
- التقاط الماوس من ذيله ووضعه على قضيب، التي تواجه بعيدا عن المشغل. أكرر للمرة الثانية عن طريق الماوس الرابع. إذا كان فال الماوسليرة سورية أو يقفز، وضعه مرة أخرى في مسارها على Rotarod حتى كل الفئران التي هي في الموقف. تجاهل جدت الفئران بدوره حولها لمواجهة المشغل.
- بعد تحميل جميع الفئران، اضغط على زر "إدخال" لبدء التجربة. مراقبة توقيت تبدأ تلقائيا والتناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على الشاشة لكل حارة.
- كما يقع كل حيوان من قضيب، تسجيل سرعة قضيب في وقت الخريف، وكذلك مدة من الزمن ظلت الحيوان على قضيب. وسوف تستمر قضيب لتدوير حتى انخفض حيوان آخر من التجمع قضيب.
- بعد أن سقطت كل الفئران، واستخدام الأنسجة لإزالة أي بولي البراز والبول من القضيب. وجود البول والمواد البرازية قد يؤثر على قدرة الفئران لقبضة قضيب.
- بعد راحة 3-مين، وإعطاء الفئران الثانية ومن ثم محاكمة ثالثة. الحد الأقصى للوقت في محاكمة واحدة هو 240 ثانية. إدارة ما مجموعه 3 محاكمات خلال كل يوم الاختبار.
- عودة الفئران إلى قفص المنزل والعودة إليها مرة أخرى إلى الرف. في نهاية الدورة التجريبية، وتنظيف Rotarod بالماء والصابون لإزالة جميع البراز خارج الجهاز.
- مسح تنظيف اللوح الأساس مع الايثانول 70٪. رش أسفل الجهاز كله مع ثاني أكسيد الكلور لتعقيم.
- في أيام - 4، - 3، - 2، و- 1 بي، قبل تعيين Rotarod مع المعلمات بروتوكول التدريب المناسبة، كما هو موضح في الجدول رقم 1، وكرر الخطوات من 2.1.2 إلى 2.1.12.
- بعد الحصول على التدابير الأساسية، ويصيب الفئران مع TMEV. السماح بفترة انتعاش بي لمدة 6 أيام.
| بروتوكول | يوم الاختبار | تردد | سرعة الانطلاق (دورة في الدقيقة) | ماكسالسرعة (دورة في الدقيقة) | تسريع | محاكمات | ITI |
| (دورة في الدقيقة / ثانية) | (N س ثانية) | (دقيقة) | |||||
| تدريب | - 5 نقطة في البوصة | يوم 1 | 1 | 12 | 03/01 | 3x240 ثانية | 3 |
| - 4 نقطة في البوصة | يوم 1 | 1 | 13 | 03/01 | 3x240 ثانية | 3 | |
| - 3 نقطة في البوصة | يوم 1 | 1 | 14 | 03/01 | 3x240 ثانية | 3 | |
| - 2. - 1 نقطة في البوصة | يوم 1 | 5 | 40 | 03/01 | 3x240 ثانية | 3 | |
| تجريبي | من 7-50 نقطة في البوصة | 2 أسبوع | 5 | 40 | 30/05 | 3x240 ثانية | 3 |
| من 51-150 نقطة في البوصة | أسبوع 1 | 5 | 40 | 30/05 | 3x240 ثانية | 3 |
الجدول 1: Rotarod معلمات في التدريب والبروتوكولات التجريبية.
- بروتوكول التجريبية Rotarod
- على +7 نقطة في البوصة، قبل تعيين Rotarod مع المعلمات بروتوكول التجريبية المناسبة، كما هو موضح في الجدول رقم 1. كرر الخطوات من 2.1.2 إلى 2.1.10.
- في نهاية محاكمة # 3، وزن كل فأر وتقديم مذكرة من وزن الجسم على ورقة البيانات. نظيفة وتطهير Rotarod حسب الخطوات 2.1.11 و2.1.12.
- اختبار الفئران مرتين في الأسبوع لمدة 6 أسابيع التالية، كما هو موضح أعلاه. بعد 6 أسابيع (في هذه الفئران قد المرجح التوصل إلى مرحلة الهضبة) 8،9، اختبار الفئران مرة واحدة في الأسبوع مع نفس experimentaبروتوكول لتر. بروتوكول الاختبار الفعلي يستمر في المتوسط 150 يوما، وهذا يتوقف على مسار مرض معين.
- مؤشر الوظيفي للجهاز العصبي
- تصدير البيانات الخام إلى ملف البيانات وتحليل النتائج.
- البيانات كما أعرب عن إدارة الوقت (الشكل 3A): هذه هي المرة تشغيل العادي بالإضافة إلى الوقت دوران السلبي ناقص وقت دوران تأخير (الجدول 2) 10. حساب متوسط تشغيل وقت المحاكمات الثلاث في اليوم الواحد.
- التعبير عن البيانات كما مؤشر عصبي وظيفي (المواد غير الغذائية، الشكل 3B).
- حساب عتبة الأداء الأساسية من كل فأر الفردية. يتم تحديد عتبة أداء خط الأساس بأنه متوسط جميع الأوقات يمتد من يوم + 15 + 45 لبي 6،7.
- حساب المواد غير الغذائية كمتوسط العصر تشغيل متوسط أحدث ثلاثة مقسوما على عتبة أداء خط الأساس من أن 6،7 الماوس محدد </ سوب>.
ملاحظة: إذا كان اختبار مرات الترشح للماوس على يوم + 72، + 76، و + 79 بي هي 55 ثانية، 45 ثانية و 50 ثانية، وزمن الأساس لنفس الماوس كان 135 ثانية، والمواد غير الغذائية لهذا الماوس على +79 نقطة في البوصة سيكون [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 أو 0.37.
- التعبير عن البيانات كما والمواد غير الغذائية المعدلة (adjNFI، الشكل 3C): ضبط بيانات المواد غير الغذائية من قيمة السكان لتجربة واحدة.
- حساب adjNFI بقسمة قيمة المواد غير الغذائية في متوسط المواد غير الغذائية التي حصلت عليها المجموعة التي عولجت صورية في ذلك اليوم تحديدا.
| مصطلح | تعريف |
| إدارة الوقت العادي | الوقت الإجمالي الماوس تنفق تشغيل بنشاط على قضيب الدورية، أي الكمون في الانخفاض. |
| الساعة تناوب السلبي | ولمن الزمن ظلت جبل الماوس على قضيب في وضع الدوران السلبي. |
| تأخير الوقت تناوب | مقدار الوقت الماوس يبقى على قضيب أثناء وضع الدوران السلبي |
| طريقة التناوب السلبي | عندما الاستيلاء على الماوس قضيب وتدور دون الحاجة إلى ambulate. |
| إجمالي وقت الجلسة | المبلغ الإجمالي من الوقت تبقى الماوس على قضيب الدورية خلال الدورة. |
| أداء خط الأساس | تقييم الأداء الحركي-الضرر قبل لتحديد الحد الأدنى أداء. |
| مؤشر ظيفة الجهاز العصبي (غير الغذائية) | مؤشر السريري، الذي يقارن كل الأداء الحركي الماوس، أي يشغل وقت، في أي وقت لذروة الأداء. |
| مؤشر ظيفة الجهاز العصبي المعدل (adjNFI) | عندما يتم تطبيق عملية تطبيع لضبط بيانات المواد غير الغذائية من قيمة السكان لفي تجربة واحدة. |
| قيمة السكان | متوسط قيمة المواد غير الغذائية التي حصلت عليها المجموعة التي عولجت صورية في يوم معين. |
الجدول 2: تعاريف Rotarod معلمات اعتمد على القياس الكمي العصبية انخفاض قيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذه التجربة التمثيلية للمقارنة الإعاقة العصبية الناجمة عن سلالة دانيلز (DA) والفول سلالة من TMEV. لأغراض هذه الدراسة، أصيب مجموعة من 32 الفئران SJL الإناث intracranially مع TMEV، إما سلالة DA (ن = 16) أو سلالة فول (ن = 16)، وكانت ترصد علامات السريرية على مر الزمن. مجموعة إضافية من 20 الفئران كان خدعة معاملة (أي تم حقن محلول ملحي intracranially) وخدم مجموعة التحكم كما صحية.
تم استخدام اختبار الأداء Rotarod لتقييم تطور المرض المزمن في الفئران المصابة TMEV والضوابط صورية. وكانت الفئران بشكل فردي الأذن ملحوظ وتخضع لبروتوكول التكيف يوميا في الأسبوع السابق لحقن TMEV ثم إلى بروتوكول الاختبار الفعلي الذي استمر 125 يوما. عن كل يوم الاختبار، وإدارة الوقت، الذي يعرف بأنه طول منظمة الشفافية الدوليةلي الماوس بقي على قضيب، تم تخزين بشكل فردي لكل فأر كما يعني من 3 محاكمات لذلك اليوم. وأعرب عن بيانات Rotarod أيضا المواد غير الغذائية وكما adjNFI الشام تطبيع.
كما هو مبين في الشكل 3A، والعدوى مع TMEV أثرت سلبا على مرات تشغيل من الفئران. A-التدابير المتكررة في اتجاهين أنوفا كشفت عن وجود تأثير كبير للإصابة TMEV (F = 56.76، ف <0.0001)، وكذلك تأثير كبير من الوقت (F = 3.26، ف <0.0001) والتفاعل في الوقت المعالجة (F = 8.065، P <0.0001). وكشف اختبار المقارنات المتعددة وDunnett التالية أن كلا المجموعتين من الفئران المصابة TMEV-كان القيم المواد غير الغذائية أقل بكثير من تلك التي من الفئران الشام (ص ≤ 0.01، الشكل 3B). كان فروق ذات دلالة إحصائية ابتداء من يوم + 61 بي حتى نهاية المتابعة (الشكل 3B). لم يكن هناك اختلاف التعاون mparing تطور العجز في الفئران المصابة بسلالة الفول والمصابين بالسلالة DA في كل نقطة زمنية (ع> 0.5، الشكل 3C).
الشكل 1: حقن داخل الجمجمة لإجراء الحقن داخل الجمجمة، والماوس وضبط النفس على سطح صلب-تخدير الغاز. يتم حقن ما يصل إلى 30 ميكرولتر بأمان في مخ الفأر. موقع الحقن ما يقرب من نصف الطريق بين خط العين والأذن وقبالة خط الوسط. إبرة 30 G يخترق مباشرة الجمجمة، ويستخدم حقنة الانسولين بشكل ملائم لمنع الإبرة من توسيع عميقا جدا في الدماغ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العمر = "1"> 
الشكل 2: إن جهاز Rotarod الاختبار Rotarod هو الفحص السلوكي العصبي القياسية التي يتم تدريب الفئران لتشغيل على قضيب الدورية وتوقيتها فإلى متى يمكن أن تبقى على قضيب كما تسرع ببطء. تم تعليق قضيب فوق أرضية القفص، والفئران بشكل طبيعي في محاولة للبقاء على قضيب لتجنب الوقوع على الأرض. هبوط من قضيب إلى قاعدة وثيقة يسبب أي أذى للفئران. أ) جهاز Rotarod قياسي يتكون من قضيب بالمحركات مع سرعات ثابتة أو التسارع. ب) لوحات تقسيم قضبان في ممرات منفصلة، كل ملاءمة ل حيوان على حدة. ويمكن اختبار مجموع عدد 4 الفئران خلال كل محاكمة. C) قضيب 1.18 في. (حوالي 3 سم) في قطر، ويخرش سطحه، مما يتيح للالفئران للحصول على أفضل قبضة. وتعقب سقوط الماوس على وجه التحديد من قبل شعاع الصورة التيتلقائيا بتسجيل مقدار الوقت الذي يقضيه على قضيب. يتم تسجيل البيانات التجريبية في جهاز الكمبيوتر بعد الفئران وتراجعت كل من قضيب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: Rotarod أداء اختبار في الفئران المصابة TMEV والشام ضوابط تم إجراء اختبار Rotarod لقياس وظيفة الحركة صورية، DA-المصابين، والفئران المصابة الفول. إلى جانب إدارة الوقت (ثانية) (A)، وأعرب عن بيانات Rotarod أيضا بمثابة مؤشر وظيفة الجهاز العصبي (غير الغذائية) (B)، والشام تطبيع المعدل المواد غير الغذائية (adjNFI) (C). الكمون لينخفض من Rotarod تسريع وقد تم قياس في ثلاث محاكمات في اليوم الواحد. يتم عرض البيانات كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). أزرق دائرة، ن = 16 الفئران المصابة الفول؛ المربعات الحمراء، ن = 16 الفئران المصابة DA؛ مثلثات سوداء، ن = 20 ضوابط المعالجة صورية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى الرغم من بعض القيود، يمثل اختبار الأداء Rotarod أداة هامة لتقييم وظيفة الحركة واختلال وظيفي في TMEV-الاتصال الدولي المباشر، فضلا عن تأثير التدخلات الدوائية على تطور العجز في الفئران.
وقد وصفت الاختبار Rotarod أولا في عام 1957 كأداة لقياس العجز العصبية في القوارض 11. القوارض يجب أن المشي على قضيب الدورية، مع زيادة سرعة الدوران، ومحاولة تجنب الوقوع على الأرض. يتم تسجيل الكمون في الانخفاض واستخدامها كنقطة نهاية الكمية لوظيفة الحركة: انخفاض القيمة أكثر عصبية والحيوانات لديها، وكلما كانت تسقط على قضيب. ميزة واضحة من هذا الاختبار على أنظمة التسجيل البصرية التقليدية هو أنه يولد متغير موضوعي التي يمكن استخدامها لأغراض إحصائية لقياس آثار العلاجات والإجراءات التجريبية على تطور العجز 3. نظم التقييم البصرية مثل refle المقومقد يكون من المفضل العاشر اختبار باعتبارها اختبارا أسهل وأسرع لتقييم قدرات الحركي في الفئران. ومع ذلك، فإن هذه النظم تفتقر إلى الدقة لاختبار أكثر الكمي مثل اختبار الأداء Rotarod، وأنها بالتالي لا ينبغي استخدامها لرصد التاريخ الطبيعي أو التغيرات المظهرية من الفئران مع إعاقة للجهاز العصبي معتدل وتدريجي. من ناحية أخرى، يتم تكييفها الاختبارات البصرية مثل اختبار المنعكس المقوم خاص لالفئران التي هي أصغر من أو تأثرا جدا لفحصها على Rotarod.
من أجل تجنب التقييمات مشوهة للاختبار Rotarod، المعلمات اختبار (أي حجم، والسرعة، والتسارع من قضيب الدورية، كمية من التدريب نظرا للحيوان، ومعالجة البيانات النهائية) يجب تكرارها بدقة 3. اليوم، واختبار الأداء Rotarod لا يزال الأكثر شيوعا محرك اختبار السلوكية، وحتى الآن لا يوجد إجماع على معايير اختبار مثالية لإنتاج أفضل النتائج. لقد وجدنادراسات على الفئران TMEV-الاتصال الدولي المباشر التي استخدمت أقطار قضيب 1،18 حتي 1،6 في. (3-4 سم) 12،13، معدلات ثابتة السرعة من 5 إلى 10 دورة في الدقيقة 12،13، وتسارع معدلات من 5 إلى 10 دورة في الدقيقة / دقيقة 12-14. ومع ذلك، فإنه من غير المعروف ما إذا كانت استنتاجات حول الاختلافات العصبية من شأنه تعميم لظروف اختبارات أخرى. يوفر هذا البروتوكول توصيات المعلمات الاختبار المحددة التي تم الأمثل، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة الإعاقة العصبية التقدمية في نموذج الفأر TMEV-الاتصال الدولي المباشر من مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام اختبار Rotarod. بشكل خاص، قبل الشروع في المحرك دراسة وظيفة Rotarod في الفئران، فمن المستحسن أن عددا من مهمة محتملة العوامل وغيرها، والأداء الأساسي وسلبية ويتم التناوب النظر فيها.
أولا، بخصوص أداء خط الأساس: تمارس والفئران غير المصابة تحسين أداء المحرك مع مرور الوقت، في نهاية المطاف التوصل إلى هضبة مستقرة على مدى عدة أيام أو أسابيع 8،9. هذا هو اله نتيجة لعملية طبيعية من التعلم الحركي. ومع ذلك، هذا التحسن ليست دائمة، وإذا ترك الفئران غير مدربين لعدة أيام، والأداء الحركي على قضيب الدورية إسقاط بسرعة 9. ولذلك، فإن تقرير الأداء الأساسي هو الحاسم للتمييز بين التعلم الحركي والاسترداد الفعلي بعد التدخل العلاجي، وكذلك بين الفسيولوجية انخفاض الأداء الحركي وتفاقم بسبب إجراء التجارب.
يتوقع لدينا الأمثل بروتوكول Rotarod لتدريب TMEV-IDD الفئران من + 15 إلى + 45 نقطة في البوصة (أي في ما بين التهاب الدماغ الحاد الذي يحدث في غضون + 3 + 12 نقطة في البوصة، والراحل المرض المزيل المزمن، والتي تطور من + 30 ل + 40 نقطة في البوصة) 15. وهذا يسمح لتقييم الأداء الحركي نتيجة لإزالة الميالين التدريجي ويستثني أي عجز المساهمة نتيجة لالتهاب الدماغ في وقت مبكر الآن. من الناحية المثالية، يجب أن يتم تنفيذ التدريب Rotarod قبلتحريض المرض. ومع ذلك، من أجل تطوير التهاب مزمن في الجهاز العصبي المركزي، والفئران SJL يجب أن يتم حقنه بفيروس قبل في الاسبوع ال 7 من العمر 16 عاما. وبما أنه من المسلم به عموما أن الأعمار من الحيوانات التي الاختبار Rotarod لا يمكن أن يؤديها على غير 8 إلى 26 أسابيع 17، لا يمكن أن تكتمل دورة تدريبية فعالة في الفئران قبل الإصابة TMEV.
التدريب وتقييم الأداء الأساسي والمهم لاستبعاد تأثير الدافع، وانخفاض الأداء القاعدية، ومهارات التعلم منخفضة أيضا. كل حيوان مختلفة، وتحتاج إلى النظر في تقييم الأداء الحركي هذه الاختلافات. هذا هو أفضل علاج باستخدام مؤشر تطبيع أداء خط الأساس، المعروف أيضا باسم المواد غير الغذائية. ويمثل هذا المؤشر أيضا لتقلبات الأداء التي قد لوحظ في الفئران خلال جلسات الاختبار المختلفة. تقلب الأداء هو قضية مشتركة في الاختبار السلوكي، ويرجع ذلك أساسا إلى عوامل خارجة التجريبيةبروتوكول، هذا الدافع منخفضة والتجارب السابقة للحيوان. يعني تشغيل مرات لنقطة زمنية الثلاثة الأخيرة من كل فأر تقديرا من النزعة المركزية للتوزيع التي من المتوقع إذا استمر أداء مستقر. وهذا يفسر تقلب الأداء الفردي يوما بعد يوم. ثم يعرف العجز عصبية حادة من قبل القيم المواد غير الغذائية أقل من أو يساوي 0.3، بينما سجل الفئران لم تتأثر نسبيا مع المواد غير الغذائية القيم أكبر من أو يساوي 0.7. لسوء الحظ، فإن هذه الاستراتيجية لا يزيل المشكلة تماما أن التغيرات التحفيزية قد تؤثر على الأداء الحركي. لمزيد من معالجة هذه المشكلة، قد يتم تدريب الفئران مع إضافة ميزات تحفيز معينة، مثل الحرمان من الطعام المعتدل قبل التدريب أو زيادة الخوف من السقوط الناجمة عن ارتفاعات هبوط قابل للتعديل من 17،5-23،5 في (44،5 حتي 60 سم).
ثانيا، فيما تناوب السلبي أو حلقات: ربما أهم تهديد للفاليdity البيانات Rotarod هو حدوث تناوب السلبية التي تنشأ عند الفأر يمكن أن يتشبث على وتدوير بشكل سلبي كما يتحول قضيب 18. على الرغم من أن لوحظ تناوب السلبي على Rotarod، خصوصا في الفئران التي تعاني من مشاكل في التنسيق الحركي، قد يؤدي هذا السلوك التعامل في وقت متأخر تسقط قضيب، وهو ما يدل بشكل غير صحيح غياب العجز الحركي. لذلك، وهو مقياس الثانوي من التنسيق الحركي مضطربا، التي ينبغي النظر في تحليل البيانات، هو إحصاء عدد المرات الماوس يتحول حول قضيب دون السقوط. أيضا، يتأثر تناوب السلبي بقوة من قبل المعلمات مهمة مثل قطر والسرعة والتسارع درجة قضيب 18. لا توجد حلول مثالية للحد من مخاطر تناوب السلبي، ولكن قرار محتمل قد يكون استخدام قضيب التي يبلغ قطرها أكبر (أي 1،18-3،15 في (3-8 سم)) أو التلال أقل وضوحا وذلك ل تقلل بشكل طفيف قبضة من الفأرة. </ P>
وجود قيود على اختبار أداء Rotarod هو أن تقييم السيارات يقتصر على فترة مراقبة قصيرة. وعلاوة على ذلك، واختبار في نقاط زمنية مختلفة في دورة خفيفة مظلمة قد يغير من نتائج الاختبار السلوكي 19. وبالتالي، من أجل التغلب على هذه القضايا، العديد من الشركات على تطوير نظم تحليل المنزل قفص المبتكرة التي توفر 24/7 رصد السلوكيات القوارض. تمثل هذه الأنظمة مراقبة بالتأكيد التكنولوجيا الأحدث والأكثر إثارة متوفرة في القوارض البحوث السلوكية، ولكن لا تزال مكلفة للغاية وليس دائما في متناول مختبرات البحوث.
وباختصار، فإن اختبار الأداء Rotarod هو اختبار بسيط نسبيا، وغير مكلفة، وتتميز بشكل جيد لتقييم المدى الطويل الإعاقة العصبية في TMEV-الاتصال الدولي المباشر، وهذا نموذج الفئران من مرض التصلب العصبي المتعدد التدريجي. وميزة هذا الاختبار على الأعراض السريرية التقليدية يسجل الأنظمة هو أنه يولد متغير موضوعي رابعا علىntify آثار الأدوية المختلفة والشروط والإجراءات على الوظائف الحركية. ونظرا لمتانة اختبار الأداء Rotarod، عن طريق تطبيق بعض الاحتياطات البسيطة، كما هو موضح أعلاه، يوفر هذا الإجراء خط الأساس يمكن على أساسها تقييم (1) أهمية نموذج الفأر TMEV-الاتصال الدولي المباشر لمرض التصلب العصبي المتعدد التدريجي و(2) فائدته لاختبار العلاجات التي تهدف إلى علاج الحالات العصبية التقدمية مثل MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old | Envigo | #052 | |
| TMEV virus stock | |||
| Isoflurane vaporizer | Harvard Apparatus | #340471 | |
| Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc | BD | #328203 | |
| Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software | Columbus Instruments | #0890M |
References
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Pachner, A. R. A Primer of Neuroimmunological Disease. , Springer. New York. (2012).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).
- McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination. Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).
- Zoecklein, L. J., et al. Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus. Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).
- Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).
- Li, L., et al. The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).
- Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines. Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).
- Columbus Instruments Rotamex-5 Manual. , 1-33 (2005).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).
- Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis. J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).
- Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis. Pain. 136, 293-304 (2008).
- Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS. J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).
- Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis. Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).
- International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from: Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).
- Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination. J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).
- Hopkins, M. E., Bucci, D. J. Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day. Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).
