Introduction
Theiler des Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV) ist ein neurotropen einzelsträngige RNA-Virus, das das murine zentralen Nervensystems persistent infiziert (CNS). Bei anfälligen Mäusen eine Infektion mit TMEV verursacht eine immunvermittelte, chronische progressive demyelinisierende Krankheit, bekannt als TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung (TMEV-IDD). Experimentelle Infektion von Mäusen nimmt einen Krankheitsverlauf, dass bei der progressiven Formen der Multiplen Sklerose (MS) gesehen ähnelt. der akuten Phase und der chronischen Phase: TMEV-IDD wird durch zwei unterschiedliche Phasen gekennzeichnet. Die akute Phase ist eine milde, in der Regel subklinischen Enzephalitis 1,2. Der zweite, der chronischen Phase, etwa einen Monat nach der Infektion beginnt, besteht aus einer langsam fortschreitende Behinderung durch Demyelinisierung gekennzeichnet, Entzündung und axonalen Schädigung 1,2. Die Schwäche in Mäusen beobachtet, die mit Spastik und gelegentlich schwere tonische Krämpfe.
Da es derzeit keine medications den progressiven Behinderung bei Patienten zu verbessern, sind die Forscher besonders angezogen von TMEV-IDD, die für die Überwachung der Auswirkungen von disease modifying Drogen auf den Krankheitsverlauf eines optimalen Tiermodell darstellt. bei Mäusen als auch bei MS-Patienten jedoch erfordert die Überwachung des Fortschreitens der Behinderung eine kontinuierliche klinische Beobachtung über längere Zeiträume. Bei Mäusen kann die Langzeitüberwachung für Behinderungsprogression mit dem Rotarod Leistungstest durchgeführt werden.
Die Rotarod Performance-Test ist ein Standard-Verhaltenstest, der Motor-assoziierten Funktionen wie Koordination, Gleichgewicht und Müdigkeit bei Nagern auswertet. Die Mäuse haben ihr Gleichgewicht auf einer Drehstange zu halten, die unter ständiger Beschleunigung dreht; die Zeit, die Latenz zu fallen aus dieser Stab aufgezeichnet wird. Tiere, die mit neurologischen Störungen sind nicht in der Lage auf dem rotierenden Stab solange Kontrollen zu bleiben, und sie normalerweise abfallen, wenn die Drehzahl übersteigt ihreMotorleistung. Je mehr neurologische Beeinträchtigung der Tiere haben, fallen je früher sie von der Stange, und je kürzer die Zeit Latenz ist.
Der Vorteil der Rotarod - Test gegenüber den traditionellen optische Bonitur Systemen ist , dass es ein Ziel erzeugt, messbare variabler die Zeit latenz die letztlich für statistische Analysen verwendet werden können , um die Auswirkungen von Therapien und experimentellen Verfahren 3 zu quantifizieren.
Im Labor für Neuroimmunologie (LONI) in Dartmouth, Mäuse zu einem Anpassungsprotokoll unterzogen werden, wo sie vor der TMEV Infektion, um sie mit der Maschine vertraut zu machen getestet und ihre normalen "Baseline" Balance Koordination und Motorsteuerung zu bewerten 4, 5. Sobald der Basislinie festgelegt wird, und die Mäuse werden mit TMEV infiziert, werden sie einmal oder zweimal pro Woche über einen Zeitraum von mehreren Monaten getestet. Die eigentliche Testprotokoll dauert durchschnittlich 150 Tage, so dass eine Beurteilung ermöglichender Rückgang der Balance, Koordination und Motorsteuerung über den gesamten Verlauf der demyelinisierende Erkrankung.
Mehrere hundert TMEV-IDD und scheinbehandelten Mäuse wurden bisher für neurologische Dysfunktion bei Dartmouth getestet. Diese Mäuse hatten verschiedene immunmodulatorische Behandlungen erhielten, aber keine pharmakologischen Wirkstoff gefunden wurde in Lindern Behinderungsprogression 6,7 wirksam zu sein. Der vorliegende Artikel und die damit verbundene Protokoll beschreibt, wie die schrittweise von TMEV-IDD Mäuse zeigten neurologische Beeinträchtigung zu charakterisieren. Insbesondere auf das Protokoll bietet Empfehlungen spezifischer Testparameter glaubte für die Untersuchung neurologische Behinderungen bei TMEV-IDD-Mäuse im Allgemeinen geeignet sein, die Rotarod-Test. Dieses Verfahren stellt eine Basislinie, gegen die zur Beurteilung (1) die Relevanz dieses Mausmodell progressive MS und (2) ihre Nützlichkeit für Therapien bei der Behandlung von progressiven neurologischen Erkrankungen wie MS Ziel zu testen. Offensichtlich ist dieRotarod Leistungsprüfung und die aktuelle optimierte Testparameter und das Protokoll sind nicht nur nützlich bei progressive neurologische Behinderungen bei der TMEV-IDD-Maus-Modell zu erfassen, sondern sind auch nützlich bei der Beeinträchtigungen in anderen Virus-induzierten und / oder genetischen Mausmodellen von neurodegenerativen Erkrankungen aufzudecken.
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Protocol
Alle tierischen Arbeit nutzt Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) bei Geisel School of Medicine an der Dartmouth überprüft und genehmigt.
1. Die Maus-Modell
- Die Induktion von TMEV-induzierte demyelinisierende Erkrankung
- Verschieben Sie die Käfige 4- bis 6-Wochen alte weibliche SJL / Jhan Mäuse aus dem Rack zu einem komfortablen Arbeitsraum enthält. Markieren die Mäuse (zB mit einer Ohrmarke oder Ohr punch) für individuelle Bewertung der klinischen und histologischen Krankheits zu ermöglichen.
- Zeichnen Sie 30 ul TMEV infizieren Lager (2 × 10 6 Plaque - bildende Einheiten; PFU) in PBS in eine 29-Gauge - Insulin - Spritze und Nadel.
- Bereiten Sie die Anästhesiegas-Maschine: das System überprüfen das Vorhandensein von ausreichenden Mengen an Sauerstoff und Isofluran für die Dauer des Verfahrens zu gewährleisten.
- Schalten Sie den Durchflussmesser auf 1 L / min. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und versiegeln die Spitze. Schalten Sie die vaporizer auf 3,5% und das Tier bis zur Liege überwachen.
- Nehmen Sie das Tier aus der Kammer und testen Sie die Maus durch die Fußballen Kneifen ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. Der Mangel an Reaktion auf eine starke Prise zeigt eine ausreichende Anästhesie.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Isopropylalkohol.
- Injizieren Sie den 30 ul TMEV infizieren Lager in die rechte Gehirnhälfte durch freihändig Injektion (Abbildung 1). Die Injektionsstelle ist etwa auf halbem Weg zwischen dem Auge und Ohr Linie und in unmittelbarer Nähe der Mittellinie.
- Bringen Sie die Maus an seinen Haltekäfig einmal voll wach und mobil (in der Regel 3 bis 5 min).
- Euthanize Mäusen durch Ausbluten oder Herzperfusion 3 bis 6 Monate nach TMEV-Infektion, je nach der Schnelligkeit, mit der Entwicklung der Krankheit.
2. Rotarod Analyse
- Der Rotarod Vorrichtung
- Test-Mäuse vor TMEV Infektion sie mit dem vertraut zu machenMaschine und ihre normalen Ausgangs Balance Koordination und Motorsteuerung zu beurteilen.
- Starten Sie das Anpassungsprotokoll auf -5 Tage nach der Infektion (dpi, dh 5 Tage vor TMEV Infektion).
- Erlauben die Mäuse für mindestens 30 min vor dem Rotarod-Tests, um den Testraum zu akklimatisieren, damit sie an die Umgebung anzupassen.
- Stellen Sie sicher , dass sowohl die Rotarod - Einheit und der Computer eingesteckt sind und die miteinander verbunden sind (Figur 2).
- Die Rotarod mit den -5 dpi Trainingsprotokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Speichern Sie die Arbeitsdatei mit dem Datum und Identifikationsinformationen.
- Bewegen Sie den Käfig der Kader enthält neben dem Rotarod aus dem Rack an einem Tisch getestet werden. Die Mäuse werden in der Regel in Trupps von 4 getestet.
- Pick-up eine Maus am Schwanz und legen Sie es auf der Stange, mit Blick weg vom Bediener. Wiederholen Sie dies für den zweiten bis vierten Maus. Wenn eine Maus falls oder springt, legen Sie sie in der Spur auf dem Rotarod zurück, bis alle Mäuse in der Lage sind. Ignorieren, wenn irgendwelche Mäuse herum drehen den Bediener zu stellen.
- Nach dem Laden alle Mäuse, drücken Sie die "Enter" Taste, um das Experiment zu starten. Beachten Sie die Timer automatisch und die Umdrehungen pro Minute (rpm) auf dem Display für jede Spur beginnen.
- Da jedes Tier von der Stange fällt, die Geschwindigkeit der Stange aufzunehmen, sowie auch die Dauer der Zeit, zu der Zeit des Falls, das Tier auf der Stange geblieben. Der Stab wird weiter drehen, bis das letzte Tier aus dem Gestänge gefallen ist.
- Nachdem alle Mäuse gefallen sind, ein Gewebe verwenden, jede fäkale Boli und Urin von der Stange zu entfernen. Das Vorhandensein von Urin und Fäkalien können die Fähigkeit der Mäuse zu greifen beeinflussen die Stange.
- Nach einer 3-min Ruhe, geben die Mäuse eine zweite und dann eine dritte Versuch. Die maximale Zeit pro Einzel Studie beträgt 240 sec. Verwalten insgesamt 3 Versuche bei jedem Testtag.
- Bringen Sie die Mäuse in ihre Heimat Käfig und bringt sie auf die Zahnstange zurück. Am Ende der experimentellen Sitzung, reinigen Sie die Rotarod mit Seife und Wasser alle Fäkalien aus der Maschine zu entfernen.
- Wischen Sie die Grundplatte mit Ethanol 70%. Sprühen Sie die gesamte Maschine mit Chlordioxid nach unten zu desinfizieren.
- An den Tagen , - 4, - 3, - 2 und - 1 pi, die Rotarod mit den entsprechenden Trainingsprotokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben, und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.1.12.
- Nachdem die Basismaßnahmen zu erhalten, infizieren die Mäuse mit TMEV. Lassen Sie einen 6-Tage pi Erholungsphase.
| Protokoll | Testing Day | Frequenz | Startgeschwindigkeit (rpm) | MaxSpeed (rpm) | Beschleunigung | Versuche | ES I |
| (rpm / sec) | (N x sec) | (min) | |||||
| Ausbildung | - 5 dpi | 1 Tag | 1 | 12 | 01/03 | 3x240 sec | 3 |
| - 4 dpi | 1 Tag | 1 | 13 | 01/03 | 3x240 sec | 3 | |
| - 3 dpi | 1 Tag | 1 | 14 | 01/03 | 3x240 sec | 3 | |
| - 2; - 1 dpi | 1 Tag | 5 | 40 | 01/03 | 3x240 sec | 3 | |
| Experimental | Von 7 bis 50 dpi | 2 Wochen | 5 | 40 | 30.05 | 3x240 sec | 3 |
| Von 51 bis 150 dpi | 1 Woche | 5 | 40 | 30.05 | 3x240 sec | 3 |
Tabelle 1: Rotarod Parameter im Training und experimentelle Protokolle.
- Die Rotarod experimentelles Protokoll
- Auf +7 dpi, die Rotarod mit den entsprechenden experimentellen Protokollparameter voreingestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 2.1.10.
- Am Ende der Studie # 3, jede Maus wiegen und eine Notiz des Körpergewichts auf dem Datenblatt zu machen. Reinigen und desinfizieren Sie die Rotarod gemäß Schritt 2.1.11 und 2.1.12.
- Testen der Mäuse zweimal pro Woche für die folgenden 6 Wochen, wie oben beschrieben. Nach 6 Wochen (in denen die Mäuse wahrscheinlich eine Plateauphase erreicht haben) 8,9, testen Sie die Mäuse einmal pro Woche mit der gleichen Experimental-Protokoll. Die tatsächliche Testprotokoll dauert im Durchschnitt 150 Tage, abhängig von dem spezifischen Krankheitsverlauf.
- Neurologische Funktions Index
- Exportieren Sie die Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsdatei und die Ergebnisse zu analysieren.
- Express - Daten als Laufzeit (3A): Dies ist die normale Laufzeit plus die passive Rotationszeit minus der Drehverzögerungszeit (Tabelle 2) 10. Berechnen Sie die mittlere Zeit der drei Versuche pro Tag ausgeführt wird.
- Express die Daten als neurologische Funktions Index (NFI, 3B).
- Berechnen Sie die Basisleistung Schwelle jeder einzelnen Maus. Die Baseline - Performance - Grenzwert wird als Mittelwert aller Laufzeiten von Tag + 15 bis + 45 pi 6,7 bestimmt.
- Berechnen Sie die NFI als Mittelwert der drei letzten Mal durchschnittliche Lauf dividiert durch die Basisleistungsschwelle dieser spezifischen Maus 6,7 </ Sup>.
HINWEIS: Wenn die Laufzeiten für eine Maus am Tag getestet + 72, + 76 und + 79 pi sind 55 sec, 45 sec und 50 sec, und der Basiszeit für die gleiche Maus betrug 135 sec, die NFI für die Maus auf +79 dpi wird [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 oder 0,37.
- Express die Daten als ein bereinigtes NFI (adjNFI; 3C): die LFI - Daten von einer Bevölkerung Wert für den einzigen Experiment einzustellen.
- Berechnen Sie die adjNFI durch die NFI-Wert durch die durchschnittliche NFI von der scheinbehandelten Gruppe an diesem bestimmten Tag erhalten zu teilen.
| Begriff | Definition |
| Normale Laufzeit | Die Gesamtzeit , die Maus auf dem rotierenden Stab aktiv ausgeführt damit verbringt, das heißt, die Latenz zu fallen. |
| Passive Drehzeit | die aBerg der Zeit hat sich die Maus auf dem Stab in der passiven Rotationsmodus geblieben. |
| Rotation Verzögerungszeit | Die Menge an Zeit, die Maus auf der Stange während der passiven Rotationsmodus bleibt |
| Passive Rotationsmodus | Wenn packt die Maus, um die Stange und dreht sich ohne ambulate zu müssen. |
| Gesamtsitzungszeit | Gesamtzeit bleibt die Maus auf dem rotierenden Stab während der Sitzung. |
| Basisleistung | Anschädigung Motorleistung die minimale Leistungsschwelle zu bestimmen, beurteilt. |
| Neurologische Funktionsindex (NFI) | Klinischer Index, der jede Maus Motorleistung vergleicht, das heißt, Laufzeit, zu jeder Zeit auf seine Höchstleistung. |
| Das bereinigte neurologische Funktionsindex (adjNFI) | Wenn ein Normalisierungsprozess angewendet LFI-Daten von einer Bevölkerung Wert einzustellen fürdie einzigen Experiment. |
| Bevölkerung Wert | Durchschnittliche NFI Wert durch die scheinbehandelte Gruppe an einem bestimmten Tag erhalten. |
Tabelle 2: Definitionen der Rotarod Parameter Angenommen neurologische Beeinträchtigung zu beziffern.
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Representative Results
Das Ziel dieser repräsentativen Experiment war die neurologische Behinderung durch die Daniels (DA) Stamm und BEAN Stamm von TMEV induziert zu vergleichen. Für die Zwecke der vorliegenden Studie wurde eine Gruppe von 32 weiblichen SJL-Mäuse wurden infiziert intracranial mit TMEV, entweder die DA-Stamm (n = 16) oder die BEAN-Stamm (n = 16), und ihre klinischen Symptome wurden im Laufe der Zeit überwacht. Eine weitere Gruppe von 20 Mäusen wurde Schein behandelt (dh wurde Kochsalzlösung injiziert intracranial) und diente als Kontrollgruppe.
Die Rotarod Performance-Test wurde verwendet, um die chronische Krankheitsprogression bei TMEV-infizierten Mäusen und Scheinkontrollen zu bewerten. Mäuse wurden einzeln Ohr markiert und einer der Anpassungsprotokoll täglich in der Woche vor der Injektion von TMEV und dann dem eigentlichen Testprotokoll, der 125 Tage dauerte. Für jeden Testtag, der Laufzeit, wie die Länge von ti definiertme die Maus blieb auf dem Stab wurde individuell für jede Maus als Mittelwert der 3 Versuche für diesen Tag gespeichert. Rotarod Daten wird auch als NFI und als Schein-normalisierte adjNFI ausgedrückt.
Wie in 3A gezeigt, eine Infektion mit TMEV negativ beeinflusst die Laufzeiten der Mäuse. Eine wiederholte Maßnahmen Zweiweg-ANOVA ergab eine signifikante Wirkung von TMEV - Infektion (F = 56,76, p <0,0001) als auch einen signifikanten Effekt der Zeit (F = 3,26, p <0,0001) , und einen Zeitbehandlung Interaktion (F = 8,065, p <0,0001). Die folgenden Dunnett-Mehrfachvergleichstest zeigte , dass beide Gruppen von TMEV-infizierten Mäusen als die sham - Mäusen signifikant niedriger NFI - Werte hatten (p ≤ 0,01; 3B). Der Unterschied war statistisch signifikant bei Tag beginnend + 61 pi bis zum Ende des Follow-up (3B). Es gab keinen Unterschied comparing Behinderungsprogression bei Mäusen mit dem BEAN - Stamm infiziert und infiziert solche mit dem DA - Stamm zu allen Zeitpunkten (p> 0,5; 3C).
Abb . 1: intrakranielle Injektion intrakranielle Injektionen ausführen zu können , ist die Maus Gas betäubt und auf einer festen Oberfläche zurückgehalten. Bis zu 30 & mgr; l werden sicher in das Gehirn der Maus injiziert. Die Injektionsstelle ist etwa auf halbem Weg zwischen dem Auge und Ohr Linie und in unmittelbarer Nähe der Mittellinie. Eine 30 G - Nadel durchbohrt direkt auf den Schädel und eine Insulinspritze ist günstig , die Nadel zu verhindern , die sich von zu tief in das Gehirn eingesetzt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Die Rotarod Apparatur Die Rotarod Test ist ein Standard - Neuropsychologische Test , bei dem Mäuse trainiert sind auf einem rotierenden Stab zu laufen und sind mit Zeit, wie lange sie auf der Stange bleiben kann , wie es langsam beschleunigt. Der Stab wird über einem Kabinenboden suspendiert und Mäusen versuchen natürlich auf dem Stab zu bleiben, zu Boden zu fallen. Der Tropfen von der Stange an der Basis des Instruments verursacht keine Schädigung der Mäuse. A) A Standard Rotarod Vorrichtung eines motorgetriebenen Stange besteht mit konstanter oder Beschleunigungsgeschwindigkeiten. B) Panels teilen die Stange in getrennte Bahnen, die jeweils geeignet für ein einzelnes Tier. Eine Gesamtzahl von 4 Mäuse können bei jedem Versuch. C getestet werden) Der Stab ist 1.18 in. (Ca. 3 cm) im Durchmesser, und seine Oberfläche ist geriffelt, so dass die Mäuse besser in den Griff zu bekommen. Der Fall der Maus wird gerade von einem Fotostrahl verfolgt, dasszeichnet automatisch die Menge an Zeit auf der Stange aufgewendet. Die experimentellen Daten in einem Computer aufgezeichnet wird , nachdem die Mäuse wurden alle von der Stange gefallen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Rotarod Performance Test in TMEV-infizierten Mäusen und Sham-Kontrollen Der Rotarod Test wurde durchgeführt , die motorische Funktion der Schein, der DA-infizierten und bohnen infizierten Mäusen zu messen. Neben der Laufzeit (sec) (A) wurden Rotarod Daten auch als eine neurologische Funktionsindex (NFI) (B) ausgedrückt wird , und ein Schein normalisierten eingestellten NFI (adjNFI) (C). Die Latenzzeit fallen von einem Beschleunigungs Rotarod wurde in drei Versuchen pro Tag gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Blue Kreis, n = 16 bohnen infizierten Mäusen; rote Quadrate, n = 16 DA-infizierten Mäusen; schwarze Dreiecke, n = 20 scheinbehandelten Kontrollen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Trotz einiger Einschränkungen stellt die Rotarod Performance-Test ein wichtiges Instrument der motorischen Funktion und Dysfunktion in TMEV-IDD sowie die Wirkung von pharmakologischen Interventionen auf Behinderungsprogression bei Mäusen für die Beurteilung.
Der Rotarod Test wurde zum ersten Mal für die Messung neurologische Defizite bei Nagern 11 im Jahr 1957 als ein Werkzeug beschrieben. Nagetiere haben auf einem rotierenden Stab zu gehen, mit Drehgeschwindigkeit zu erhöhen und versuchen, auf den Boden zu fallen. Die Latenzzeit wird fallen aufgezeichnet und als quantitatives Endpunkt für die motorische Funktion verwendet: Je mehr neurologische Beeinträchtigung der Tiere haben, desto schneller fallen sie weg von der Stange. Der klare Vorteil dieses Tests gegenüber den herkömmlichen visuellen Scoring - Systeme ist , dass es eine objektive Variable erzeugt , die für statistische Zwecke verwendet werden können , um die Auswirkungen von Therapien und experimentellen Verfahren auf Behinderungsprogression 3 zu quantifizieren. Die optische Bonitur Systeme wie das Aufrichten reflex Test könnte als eine einfachere und schnellere bevorzugt werden, um Testbewegungsfähigkeiten bei Mäusen zu bewerten. Allerdings fehlen diese Systeme die Genauigkeit einer quantitativen Test, wie die Rotarod Performance-Test, und sie sollten daher nicht verwendet werden, um die Naturgeschichte oder phänotypische Veränderungen von Mäusen mit milden und progressive neurologische Beeinträchtigung zu überwachen. Auf der anderen Seite, visuelle Tests wie der aufrichtenden Reflex-Test besonders an Mäuse angepasst, die zu jung sind, oder auch auf der betroffenen Rotarod getestet werden.
Um verzerrtes Beurteilungen der Rotarod - Test zu vermeiden, sind die Testparameter (dh, die Größe, die Geschwindigkeit und Beschleunigung der Drehstange; Menge an Trainings dem Tier gegeben, und endgültige Datenverarbeitung) müssen sorgfältig 3 repliziert werden. Heute ist die Rotarod Performance-Test ist nach wie vor die am häufigsten verwendete Motor Verhaltenstest, doch gibt es wenig Konsens über die ideale Testparameter optimale Ergebnisse zu erzielen. Wir haben gefundenStudien mit TMEV-IDD - Mäuse , die Stangendurchmesser von 1,18 bis 1,6 in verwendet. (3 bis 4 cm) 12,13, Festgeschwindigkeitsraten von 5 bis 10 rpm 12,13 und Beschleunigungsraten von 5 bis 10 U / min 14.12. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Rückschlüsse auf neurologische Unterschiede zu anderen Testbedingungen zu verallgemeinern würde. Das vorliegende Protokoll bietet Empfehlungen spezifischer Testparameter, die optimiert wurden und eignen sich somit für progressive neurologische Behinderungen bei der TMEV-IDD Mausmodell der MS Untersuchung der Rotarod-Test. Insbesondere vor bei Mäusen auf einem Rotarod Motorik Studie einsteigen, es, dass eine Anzahl von potentiell wichtigen Faktoren empfohlen wird-unter anderem Basisleistung und passive rotations betrachtet.
Erstens, in Bezug auf Basisleistung: ausgeübt und nicht - infizierte Mäuse verbessern ihre Motorleistung im Laufe der Zeit schließlich ein stabiles Plateau über mehrere Tage oder Wochen 8,9 erreicht. Dies ist the Ergebnis der normalen Prozess des motorischen Lernens. Jedoch ist diese Verbesserung nicht permanent, und wenn Mäuse für mehrere Tage ungeübten gelassen, ihre Motorleistung auf dem rotierenden Stab fällt schnell 9. Daher ist eine Basisleistungsbestimmung entscheidend zwischen Motor Lernen und tatsächlichen Wiederherstellung nach einer therapeutischen Intervention, sowie zwischen einer physiologischen Motorleistungsverlust und Verschlechterung aufgrund eines experimentellen Verfahrens zu unterscheiden.
Unsere verbesserte Rotarod - Protokoll erwartet TMEV-IDD Mäuse von + 15 bis + 45 dpi (dh, zwischen der akuten Encephalitis zu trainieren, die innerhalb von + auftritt 3 bis + 12 dpi und späten chronische demyelinisierende Erkrankung, die von + 30 entwickelt , um + 40 dpi) 15. Dies ermöglicht die Bewertung der Motorleistung als Folge der fortschreitenden Myelinverlust und schließt somit keine Defizite aufgrund der frühen encephalitis beiträgt. Idealerweise sollte die Rotarod Ausbildung vor werden durchgeführt, umInduktion der Krankheit. Um jedoch eine chronische Infektion des ZNS, SJL - Mäuse zu entwickeln , haben die mit dem Virus vor der 7. Woche alt 16 injiziert werden. Da es , dass das Alter der Tiere im allgemeinen angenommen , daß die Rotarod - Test durchgeführt werden kann , auf 17 8 bis 26 Wochen, ein effektives Training nicht vor TMEV - Infektion in Mäusen durchgeführt werden kann.
Ausbildung und Baseline-Performance Evaluation sind auch wichtig, um die Wirkung von geringer Motivation, niedrige basale Leistung und niedrigen Lernfähigkeiten auszuschließen. Jedes Tier unterschiedlich ist, und diese Unterschiede müssen in einer Motorleistungsbewertung berücksichtigt werden. Dies wird am besten abgeholfen, indem eine Basisleistung normalisierten Index verwendet, der auch als NFI bekannt. Dieser Index berücksichtigt auch Leistungsschwankungen, die bei Mäusen während der verschiedenen Testsitzungen beobachtet werden könnten. Performance-Variabilität ist ein häufiges Problem in Verhaltenstests, vor allem aufgrund von Faktoren außerhalb des VersuchsProtokoll, wie zum Beispiel geringe Motivation und Erfahrungen aus der Vergangenheit des Tieres. Die mittlere Zeit für die letzten drei Zeitpunkte jeder Maus ausgeführt liefert eine Schätzung der mittleren Tendenz der Verteilung, die erwartet wird, wenn die Leistung stabil bleibt. Diese Konten für Tag zu Tag die individuelle Leistung Variabilität. Schwere neurologische Behinderung wird dann von NFI-Werte von weniger als oder gleich 0,3 ist, definiert, während relativ unbeeinflußt Mäusen erzielt werden mit NFI-Werte größer als oder gleich 0,7. Leider funktioniert diese Strategie das Problem nicht vollständig entfernen, die motivationale Veränderungen könnte die Motorleistung beeinflussen. Um dieses Problem zu lösen, Mäuse können mit dem Zusatz von speziellen motivierende Features, wie mild Nahrungsentzug vor dem Training oder erhöhte Angst vor Stürzen durch einstellbare Fallhöhen von 17,5 bis 23,5 in. (44,5 bis 60 cm) trainiert werden.
Zweitens, in Bezug auf passive Rotationen oder Looping: vielleicht die wichtigste Bedrohung für die validity von Rotarod Daten ist das Auftreten von passive Rotationen , die entstehen , wenn die Maus auf klammern und drehen kann passiv wie die Stange 18 dreht. Obwohl passive Rotation auf der Rotarod, vor allem bei Mäusen beobachtet, erlebt die motorische Koordination Probleme, diese Bewältigungsverhalten führen kann den Stab Ende abfällt, was falsch ein Fehlen von motorischen Defiziten hindeuten würde. Daher ist eine Sekundärmaßnahme der gestörten motorischen Koordination, die in der Datenanalyse in Betracht gezogen werden sollte, ist die Zählung der Anzahl von Malen der Maus um die Stange dreht, ohne herunterzufallen. Auch wird passive Rotation stark von Aufgabenparameter wie Durchmesser, Geschwindigkeit und Beschleunigungsgrad der Stange 18 beeinflusst. Es sind keine perfekten Lösungen für das Risiko der passive Rotation verringern, aber der mögliche Auflösung kann mit einem größeren Durchmesser (dh 1,18 bis 3,15 in. (3 bis 8 cm)) oder weniger ausgeprägte Rippen die Verwendung einer Stange sein, um leicht den Griff der Maus zu reduzieren. </ P>
Eine Begrenzung der Rotarod Leistungsprüfung ist, dass der Motor Beurteilung auf eine kurze Beobachtungszeit begrenzt ist. Darüber hinaus das Ergebnis der Verhaltenstests Prüfung zu verschiedenen Zeitpunkten in der Hell-Dunkel - Zyklus kann 19 ändern. So, um diese Probleme zu überwinden, mehrere Unternehmen entwickeln innovative Heimkäfig Analysesysteme, die 24/7 Überwachung von Nagetier Verhalten liefern. Diese Überwachungssysteme stellen sicher die neuesten und spannendsten Technologie, die bei Nagetieren Verhaltensforschung, sind aber immer noch extrem teuer und nicht immer zugänglich zu Forschungslabors.
Zusammenfassend ist die Rotarod Performance-Test eine relativ einfache, kostengünstige und gut charakterisierte Test für Langzeitauswertung für neurologische Behinderungen bei TMEV-IDD, einem murinen Modell der progressive MS. Der Vorteil dieses Tests gegenüber den herkömmlichen klinischen Symptome Score-Systeme ist, dass sie ein objektives variable erzeugt zu quantify die Auswirkungen verschiedener Medikamente, Bedingungen und Verfahren für die Motorfunktion. Aufgrund der Robustheit der Rotarod Performance-Test, indem Sie ein paar einfache Vorsichtsmaßnahmen anwenden, wie oben beschrieben, stellt dieses Verfahren eine Basislinie, gegen die zu bewerten (1) die Relevanz der TMEV-IDD-Maus-Modell zu progredienter MS und (2) ihre Nützlichkeit zum testen von Therapien bei der Behandlung von progressiven neurologischen Erkrankungen wie MS abzielen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old | Envigo | #052 | |
| TMEV virus stock | |||
| Isoflurane vaporizer | Harvard Apparatus | #340471 | |
| Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc | BD | #328203 | |
| Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software | Columbus Instruments | #0890M |
References
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
- Pachner, A. R. A Primer of Neuroimmunological Disease. , Springer. New York. (2012).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).
- McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination. Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).
- Zoecklein, L. J., et al. Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus. Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).
- Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).
- Li, L., et al. The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).
- Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines. Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).
- Columbus Instruments Rotamex-5 Manual. , 1-33 (2005).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).
- Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis. J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).
- Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis. Pain. 136, 293-304 (2008).
- Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS. J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).
- Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis. Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).
- International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from: Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).
- Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination. J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).
- Hopkins, M. E., Bucci, D. J. Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day. Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).
