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Neuroscience

मापने मल्टीपल स्केलेरोसिस के एक माउस मॉडल में प्रगतिशील मस्तिष्क संबंधी विकलांगता

Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54616
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

Introduction

Theiler के लिए murine Encephalomyelitis वायरस (TMEV) एक neurotropic एकल असहाय आरएनए वायरस है कि लगातार murine केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को संक्रमित करता है। अतिसंवेदनशील चूहों में, TMEV के साथ संक्रमण एक प्रतिरक्षा की मध्यस्थता, जीर्ण-प्रगतिशील demyelinating रोग, TMEV प्रेरित demyelinating रोग (TMEV-आयोडीन अल्पता विकार) के रूप में जाना जाता है का कारण बनता है। चूहों की प्रायोगिक संक्रमण एक बीमारी पाठ्यक्रम मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) के प्रगतिशील रूपों में देखा है कि दिखने लगते हैं। तीव्र चरण और क्रोनिक चरण: TMEV-आयोडीन अल्पता विकार दो अलग चरणों की विशेषता है। तीव्र चरण के एक हल्के, आमतौर पर उपनैदानिक इन्सेफेलाइटिस 1,2 है। दूसरा, जीर्ण चरण, संक्रमण के बाद एक महीने के बारे में शुरुआत, धीरे-धीरे प्रगति विकलांगता माइलिन रहित, सूजन, और axonal क्षति 1,2 की विशेषता के होते हैं। चूहों में मनाया कमजोरी spasticity और, कभी कभी, गंभीर टॉनिक ऐंठन के साथ जुड़ा हुआ है।

क्योंकि वर्तमान में कोई medicatio देखते हैंएनएस रोगियों में प्रगतिशील विकलांगता को सुधारने के लिए, शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से TMEV-आयोडीन अल्पता विकार है, जो रोग प्रगति पर रोग को संशोधित करने के लिए दवाओं के प्रभाव की निगरानी के लिए एक इष्टतम पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है के द्वारा आकर्षित कर रहे हैं। हालांकि, चूहों में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एमएस रोगियों में, विकलांगता प्रगति की निगरानी के लिए समय की विस्तारित अवधि में एक सतत नैदानिक ​​अवलोकन की आवश्यकता है। चूहों में, विकलांगता प्रगति के लिए लंबे समय तक निगरानी rotarod प्रदर्शन परीक्षण के साथ पूरा किया जा सकता है।

Rotarod प्रदर्शन परीक्षण एक मानक व्यवहार परीक्षण है कि इस तरह के समन्वय, संतुलन, और कृन्तकों में थकान के रूप में मोटर से जुड़े कार्यों का मूल्यांकन करता है। चूहों एक मोड़ छड़ी है, जो निरंतर त्वरण के तहत घूर्णन कर रहा है पर अपने संतुलन रखने के लिए है, समय विलंबता से इस छड़ी दर्ज की गई है गिर करने के लिए। मस्तिष्क संबंधी रोग के साथ पशु नियंत्रण के रूप में लंबे समय के रूप घूर्णन छड़ी पर रहने में असमर्थ हैं, और वे सामान्य रूप से छोड़ जब रोटेशन की गति से अधिक है उनकीमोटर क्षमता। अधिक स्नायविक हानि जानवरों है, जल्दी ही वे रॉड गिर, और कम समय विलंबता है।

पारंपरिक दृश्य स्कोरिंग सिस्टम पर rotarod परीक्षण का लाभ यह है कि यह एक उद्देश्य उत्पन्न करता है, मध्यम श्रेणी चर-समय विलंबता जो अंततः चिकित्सा और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं 3 के प्रभाव को यों तो सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

डार्टमाउथ पर Neuroimmunology (LONI) की प्रयोगशाला में, चूहों के क्रम में उन्हें मशीन के साथ परिचित करने के लिए और अपने सामान्य "आधारभूत" संतुलन समन्वय और मोटर नियंत्रण 4 का आकलन करने के लिए एक अनुकूलन प्रोटोकॉल, जहां वे TMEV संक्रमण से पहले परीक्षण कर रहे हैं के अधीन हैं, 5। एक बार जब आधारभूत स्थापित है और चूहों TMEV से संक्रमित होते हैं, वे कई महीनों की अवधि में एक या दो बार एक सप्ताह परीक्षण कर रहे हैं। वास्तविक परीक्षण प्रोटोकॉल इस प्रकार के एक आकलन के लिए अनुमति देता है 150 दिनों की एक औसत रहता है,demyelinating रोग के पूरे पाठ्यक्रम पर संतुलन, समन्वय, और मोटर नियंत्रण की कमी आई है।

कई सौ TMEV-आयोडीन अल्पता विकार और नकली इलाज चूहों डार्टमाउथ में मस्तिष्क संबंधी रोग के लिए अब तक परीक्षण किया गया है। इन चूहों विभिन्न इम्यूनोमॉड्यूलेटरी उपचार प्राप्त किया था, लेकिन कोई औषधीय एजेंट विकलांगता प्रगति 6.7 सुधारने में प्रभावी होना पाया गया है। वर्तमान लेख और संबंधित प्रोटोकॉल प्रगतिशील स्नायविक हानि TMEV-आयोडीन अल्पता विकार चूहों द्वारा प्रदर्शित चिह्नित करने के लिए कैसे का वर्णन है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल rotarod परीक्षण का उपयोग TMEV-आयोडीन अल्पता विकार चूहों में मस्तिष्क संबंधी विकलांगता के अध्ययन के लिए आम तौर पर उपयुक्त माना जा रहा विशिष्ट परीक्षण के मापदंडों की सिफारिशों प्रदान करता है। इस प्रक्रिया का आकलन करने के खिलाफ जो एक आधारभूत (1) इस माउस ऐसे एमएस के रूप में प्रगतिशील स्नायविक शर्तों के उपचार के उद्देश्य से उपचारों के परीक्षण के लिए प्रगतिशील एमएस और (2) इसकी उपयोगिता को मॉडल की प्रासंगिकता प्रदान करता है। जाहिर है,Rotarod प्रदर्शन परीक्षण और मौजूदा अनुकूलित परीक्षण मानकों और प्रोटोकॉल TMEV-आयोडीन अल्पता विकार माउस मॉडल में प्रगतिशील मस्तिष्क संबंधी विकलांगता का पता लगाने में ही उपयोगी नहीं हैं, लेकिन यह भी neurodegenerative रोगों के अन्य वायरस प्रेरित और / या आनुवंशिक माउस मॉडल में दोष को उजागर करने में उपयोगी होते हैं।

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Protocol

सभी जानवर काम की समीक्षा की और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) डार्टमाउथ में मेडिसिन के Geisel स्कूल में द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करता है।

1. माउस मॉडल

  1. TMEV प्रेरित demyelinating रोग की प्रेरण
    1. एक आराम से काम कर अंतरिक्ष के लिए रैक से 4 से 6 सप्ताह पुराने महिला SJL / Jhan चूहों युक्त पिंजरों ले जाएँ। चूहों (जैसे, एक कान टैग या कान पंच के साथ) मार्क नैदानिक और histological रोग का व्यक्तिगत मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए।
    2. एक 29 गेज इंसुलिन सिरिंज और सुई में पीबीएस में; TMEV संक्रमित शेयर (pfu 2 एक्स 10 6 पट्टिका गठन इकाइयों) के 30 μl ड्रा।
    3. संज्ञाहरण गैस मशीन तैयार: प्रक्रिया की अवधि के लिए ऑक्सीजन और isoflurane की पर्याप्त मात्रा की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए प्रणाली की जाँच करें।
    4. 1 एल / मिनट के लिए फ्लो मीटर चालू करें। पशु प्रेरण कक्ष में रखें और ऊपर सील। VA चालू करें3.5% porizer और लेटा हुआ जब तक पशु की निगरानी।
    5. चैम्बर से पशु निकालें और लुटेरा बन्द रखो पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए माउस का परीक्षण करें। एक मजबूत चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी पर्याप्त संज्ञाहरण इंगित करता है।
    6. 70% isopropyl शराब के साथ इंजेक्शन साइट को साफ करें।
    7. मुक्तहस्त इंजेक्शन (चित्रा 1) द्वारा सही मस्तिष्क गोलार्द्ध में TMEV संक्रमित शेयर के 30 μl इंजेक्षन। इंजेक्शन के स्थल से लगभग आधे रास्ते आंख और कान के बीच लाइन और सिर्फ midline बंद है।
    8. (- 5 मिनट आमतौर पर 3) अपनी होल्डिंग पिंजरे में एक बार पूरी तरह से सतर्क है और मोबाइल के लिए माउस लौटें।
    9. exsanguination या हृदय छिड़काव द्वारा चूहों euthanize 3 से 6 महीने TMEV संक्रमण के बाद, रोग के विकास की तेज़ी पर निर्भर करता है।

2. rotarod विश्लेषण

  1. rotarod उपकरण
    1. प्रायर TMEV संक्रमण के लिए टेस्ट चूहों उन लोगों के साथ परिचित करने के लिएमशीन और उनके सामान्य आधारभूत संतुलन समन्वय और मोटर नियंत्रण का आकलन करने के लिए।
    2. -5 के दिनों में अनुकूलन प्रोटोकॉल के बाद संक्रमण (; यानी, 5 दिन TMEV संक्रमण से पहले डीपीआई) की शुरुआत करें।
    3. चूहों में कम से कम 30 मिनट के लिए पहले rotarod को परीक्षण के लिए परीक्षण के कमरे के लिए acclimate करने के लिए, ताकि उन्हें पर्यावरण के लिए समायोजित करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. सुनिश्चित करें कि दोनों rotarod यूनिट और कंप्यूटर में खामियों को दूर किया और एक दूसरे (चित्रा 2) से जुड़े रहे हैं।
    5. तालिका 1 में वर्णित के रूप में, -5 डीपीआई प्रशिक्षण प्रोटोकॉल मानकों के साथ rotarod पूर्व निर्धारित।
    6. तारीख और पहचान की जानकारी के साथ काम फ़ाइल सहेजें।
    7. टीम इस प्रकार युक्त रैक से एक टेबल rotarod से सटे करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए पिंजरे में ले जाएँ। चूहे आमतौर पर 4 से दस्तों में परीक्षण कर रहे हैं।
    8. पूंछ से एक माउस उठाओ और रॉड पर जगह, ऑपरेटर से दूर का सामना करना पड़। चौथे माउस के माध्यम से दूसरे के लिए दोहराएँ। एक माउस फल हैंरास या कूदता है, यह rotarod पर अपनी लेन में वापस जगह जब तक सभी चूहों की स्थिति में हैं। अनदेखी अगर किसी भी चूहों ऑपरेटर सामना करने के लिए चारों ओर मोड़।
    9. सभी चूहों को लोड करने के बाद, प्रयोग शुरू करने के लिए दर्ज करें "" बटन दबाएँ। निरीक्षण टाइमर स्वचालित रूप से शुरू करते हैं और प्रत्येक लेन के लिए प्रदर्शन पर मिनट (आरपीएम) प्रति घुमाव।
      1. प्रत्येक जानवर रॉड से गिर जाता है के रूप में, गिरावट के समय में लोहे की छड़ की गति, साथ ही समय की अवधि के पशु रॉड पर बने रिकॉर्ड है। रॉड बारी बारी से जब तक अंतिम पशु रॉड विधानसभा से गिर गया है जारी रहेगा।
    10. बाद सभी चूहों गिर गया है, रॉड से किसी भी मल boli और मूत्र को हटाने के लिए एक ऊतक का उपयोग करें। मूत्र और मल सामग्री की उपस्थिति पकड़ के लिए चूहों रॉड की क्षमता को प्रभावित कर सकता है।
      1. एक 3 मिनट आराम के बाद, चूहे एक दूसरे और फिर एक तिहाई परीक्षण दे। एकल परीक्षण प्रति अधिक से अधिक समय 240 सेकंड है। प्रत्येक परीक्षण के दिन के दौरान 3 परीक्षण की कुल प्रशासन।
    11. उनके घर पिंजरे में चूहों पर लौटें और उन्हें वापस रैक पर वापस जाएँ। प्रायोगिक सत्र के अंत में, मशीन बंद सभी fecal बात को हटाने के लिए साबुन और पानी से साफ rotarod।
    12. 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ baseplate साफ कर लें। क्लोरीन डाइऑक्साइड के साथ पूरे मशीन नीचे स्प्रे कीटाणुरहित।
    13. 4, - - 3, - 2, और - दिन पर 1 पीआई, rotarod उचित प्रशिक्षण प्रोटोकॉल मानकों के साथ, 1 टेबल में वर्णित के रूप में पूर्व निर्धारित, और दोहराने कदम 2.1.12 के लिए 2.1.2।
    14. आधारभूत उपायों प्राप्त करने के बाद, TMEV के साथ चूहों को संक्रमित। एक 6 दिन गड़बड़ी वसूली की अवधि के लिए अनुमति दें।
मसविदा बनाना परीक्षण डे आवृत्ति शुरू गति (आरपीएम) मैक्सगति (आरपीएम) त्वरण परीक्षण आईटीआई
(आरपीएम / सेक) (एन एक्स सेकंड) (न्यूनतम)
प्रशिक्षण - 5 डीपीआई एक दिन 1 12 3/1 3x240 सेकंड 3
- 4 डीपीआई एक दिन 1 13 3/1 3x240 सेकंड 3
- 3 डीपीआई एक दिन 1 14 3/1 3x240 सेकंड 3
- 2; - 1 डीपीआई एक दिन 5 40 3/1 3x240 सेकंड 3
प्रयोगात्मक +7 से 50 डीपीआई 2 सप्ताह 5 40 30/05 3x240 सेकंड 3
+51 से 150 डीपीआई 1 सप्ताह 5 40 30/05 3x240 सेकंड 3

तालिका 1: प्रशिक्षण एवं प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में rotarod पैरामीटर।

  1. Rotarod प्रायोगिक प्रोटोकॉल
    1. +7 डीपीआई पर, rotarod उचित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मानकों के साथ तालिका में वर्णित के रूप में पूर्व निर्धारित 1। दोहराएँ 2.1.10 के लिए 2.1.2 कदम।
    2. परीक्षण # 3 के अंत में, प्रत्येक माउस वजन और डाटा शीट पर शरीर के वजन के एक नोट करें। स्वच्छ और कदम 2.1.11 और 2.1.12 के अनुसार rotarod कीटाणुरहित।
    3. निम्नलिखित 6 सप्ताह के लिए चूहों का परीक्षण सप्ताह में दो बार, जैसा कि ऊपर वर्णित है। 6 सप्ताह 8,9, एक बार एक सप्ताह ही Experimenta साथ (जिसमें चूहों की संभावना एक पठार चरण पर पहुंच गया है) चूहों का परीक्षण करने के बादएल प्रोटोकॉल। वास्तविक परीक्षण प्रोटोकॉल, 150 दिनों की एक औसत रहता विशेष बीमारी की राह पर निर्भर करता है।
  2. न्यूरोलॉजिकल कार्यात्मक सूचकांक
    1. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में कच्चे डेटा निर्यात और परिणामों का विश्लेषण।
    2. समय चल रहा है (चित्रा 3) के रूप में एक्सप्रेस डेटा: यह सामान्य चल रहा है समय के साथ साथ निष्क्रिय रोटेशन समय शून्य से रोटेशन देरी समय (तालिका 2) 10 है। प्रति दिन तीन परीक्षणों का मतलब समय चल रहा है की गणना।
    3. एक स्नायविक कार्यात्मक सूचकांक (चित्रा 3 बी NFI) के रूप में डेटा व्यक्त करें।
      1. प्रत्येक व्यक्ति के माउस के आधारभूत प्रदर्शन सीमा की गणना। आधारभूत प्रदर्शन दहलीज + 15 + 45 पीआई 6.7 से दिन में सब चल रहा है समय का मतलब के रूप में चुना गया है।
      2. NFI कि विशिष्ट माउस 6.7 के आधारभूत प्रदर्शन सीमा से विभाजित तीन सबसे हाल के औसत से चल रहा है समय का मतलब के रूप में गणना </ Sup>।
        नोट: यदि + 76 + 72 दिन पर एक माउस, के लिए चल रहे कई बार परीक्षण किया है, और + 79 पीआई 55 सेकंड, 45 सेकंड और 50 सेकंड, और एक ही माउस के लिए आधारभूत समय कर रहे हैं 135 सेकंड, कि माउस के लिए NFI था +79 डीपीआई पर [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 या 0.37 होगी।
    4. एक्सप्रेस एक समायोजित NFI के रूप में डेटा (adjNFI, चित्रा -3 सी): ही प्रयोग के लिए एक जनसंख्या मूल्य द्वारा NFI डेटा को समायोजित।
      1. कि विशेष दिन पर दिखावा इलाज समूह द्वारा प्राप्त औसत NFI द्वारा NFI मूल्य विभाजित करके adjNFI की गणना।
अवधि परिभाषा
सामान्य चल रहा है समय कुल समय माउस को सक्रिय रूप से घूर्णन छड़ी पर चल रहे खर्च करता है, यानी, विलंबता गिर करने के लिए।
निष्क्रिय रोटेशन समय द एमाउंट समय के माउस निष्क्रिय रोटेशन मोड में रॉड पर बनी हुई है।
रोटेशन देरी समय राशि समय के माउस निष्क्रिय रोटेशन मोड के दौरान रॉड पर रहता है
निष्क्रिय रोटेशन मोड माउस रॉड पकड़ लेता है और ambulate करने के लिए बिना घुमाता है।
कुल सत्र का समय समय की कुल राशि माउस सत्र के दौरान घूर्णन छड़ी पर बनी हुई है।
आधारभूत प्रदर्शन प्री-नुकसान मोटर प्रदर्शन न्यूनतम प्रदर्शन सीमा निर्धारित करने के लिए आकलन किया।
स्नायविक समारोह सूचकांक (एनएफआई) नैदानिक सूचकांक है, जो प्रत्येक माउस मोटर प्रदर्शन की तुलना, यानी, समय चल रहा है, अपने चरम पर प्रदर्शन करने के लिए किसी भी समय।
समायोजित स्नायविक समारोह सूचकांक (adjNFI) एक सामान्य बनाने की प्रक्रिया के लिए एक जनसंख्या मूल्य द्वारा NFI डेटा को समायोजित करने के लिए लागू किया जाता हैही प्रयोग।
जनसंख्या मूल्य औसत मूल्य NFI एक विशेष दिन पर दिखावा इलाज समूह द्वारा प्राप्त की।

तालिका 2: rotarod पैरामीटर्स की परिभाषाएँ न्यूरोलॉजिकल हानि यों को अपनाया।

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Representative Results

इस प्रतिनिधि प्रयोग का उद्देश्य मस्तिष्क संबंधी विकलांगता डेनियल (डीए) तनाव और TMEV की बीन तनाव से प्रेरित तुलना करने के लिए किया गया था। वर्तमान अध्ययन के प्रयोजनों के लिए, 32 महिला SJL चूहों के एक समूह, TMEV साथ intracranially संक्रमित थे या तो डीए तनाव (एन = 16) या सेम तनाव (एन 16 =), और उनके नैदानिक ​​लक्षण समय के साथ निगरानी की गई। 20 चूहों के एक अतिरिक्त समूह दिखावा इलाज किया गया था (यानी, नमकीन घोल intracranially इंजेक्ट किया गया था) और के रूप में स्वस्थ नियंत्रण समूह में कार्य किया।

Rotarod प्रदर्शन परीक्षण TMEV संक्रमित चूहों और नकली नियंत्रण में जीर्ण रोग प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चूहे को व्यक्तिगत रूप से कान में चिह्नित और TMEV के इंजेक्शन से पहले और उसके बाद वास्तविक परीक्षण प्रोटोकॉल है कि 125 दिनों तक चली लिए सप्ताह में दैनिक अनुकूलन प्रोटोकॉल के अधीन थे। प्रत्येक परीक्षण के दिन, समय चलने के लिए, तिवारी की लंबाई के रूप में परिभाषित किया गयामुझे माउस रॉड पर रुके थे, उस दिन के लिए 3 परीक्षण का मतलब के रूप में प्रत्येक माउस के लिए व्यक्तिगत रूप से जमा हो गया था। Rotarod डेटा भी NFI के रूप में और दिखावा सामान्यीकृत adjNFI के रूप में व्यक्त किया जाता है।

जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3 ए, TMEV के साथ संक्रमण नकारात्मक चूहों के चल रहे बार प्रभावित किया। एक दोहराया उपायों दो तरह एनोवा (एफ = 3.26, पी <0.0001) TMEV संक्रमण (एफ = 56.76, पी <0.0001) की एक महत्वपूर्ण प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से समय की एक महत्वपूर्ण प्रभाव है और एक समय उपचार बातचीत (एफ = पता चला 8.065, पी <0.0001)। निम्नलिखित Dunnett के एकाधिक तुलना परीक्षण से पता चला है कि TMEV संक्रमित चूहों के दोनों समूहों शाम चूहों की तुलना में काफी कम NFI मूल्यों था (पी 0.01 ≤, चित्रा 3 बी)। अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण दिन पर अनुवर्ती के अंत तक शुरू + 61 पीआई था (चित्रा 3 बी)। कोई फर्क नहीं सह नहीं थाबीन तनाव और सभी समय बिंदुओं पर डीए तनाव से संक्रमित लोगों (चित्रा -3 सी p> 0.5) से संक्रमित चूहों में विकलांगता प्रगति mparing।

आकृति 1
चित्रा 1:। Intracranial इंजेक्शन intracranial इंजेक्शन करने के लिए, माउस गैस anesthetized और एक ठोस सतह पर रोका है। अप करने के लिए 30 μl सुरक्षित रूप से माउस मस्तिष्क में इंजेक्ट कर रहे हैं। इंजेक्शन के स्थल लगभग सिर्फ midline बंद आंख और कान के बीच लाइन और आधा रास्ता तय करना है। एक 30 जी सुई सीधे कपाल में घुसा, और एक इंसुलिन सिरिंज आसानी से मस्तिष्क में भी गहराई का विस्तार से सुई को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2:। Rotarod उपकरण rotarod परीक्षण एक मानक neurobehavioral परख जिसमें चूहों एक घूर्णन छड़ी पर चलाने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है और यह धीरे-धीरे ऊपर गति कितनी देर तक वे रॉड पर रह सकते हैं के लिए समय पर कर रहे है। छड़ी एक पिंजरे मंजिल से ऊपर निलंबित कर दिया है, और चूहों स्वाभाविक रूप से जमीन पर गिरने से बचने के लिए छड़ी पर रहने की कोशिश करो। साधन के आधार पर रॉड से ड्रॉप। ए) चूहों को कोई चोट एक मानक rotarod तंत्र निरंतर या को तेज गति के साथ एक मोटर चालित छड़ी के होते हैं का कारण बनता है। बी) पैनलों अलग गलियों में रॉड विभाजित है, प्रत्येक के लिए अनुकूल एक व्यक्ति जानवर। 4 चूहों की कुल संख्या प्रत्येक परीक्षण। सी के दौरान परीक्षण किया जा सकता है) रॉड में 1.18 है। (व्यास में लगभग 3 सेमी), और इसकी सतह knurled है, एक बेहतर पकड़ पाने के लिए चूहों की इजाजत दी। माउस के पतन के ठीक एक तस्वीर किरण ने पता लगाया है किस्वचालित रूप से छड़ी पर खर्च समय की मात्रा रिकॉर्ड। प्रयोगात्मक डेटा एक कंप्यूटर के बाद चूहों सभी रॉड से गिर गया है में दर्ज की गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। TMEV संक्रमित चूहों और नकली नियंत्रण में rotarod प्रदर्शन टेस्ट rotarod परीक्षण दिखावा, डीए संक्रमित की मोटर समारोह, और बीन संक्रमित चूहों को मापने के लिए किया गया था। समय (सेक) (ए) चल रहा है इसके अलावा, rotarod आंकड़े यह भी एक स्नायविक समारोह सूचकांक (एनएफआई) (बी), और एक दिखावा सामान्यीकृत समायोजित NFI (adjNFI) (सी) के रूप में व्यक्त किया गया। विलंबता एक त्वरक rotarod से गिर करने के लिए प्रति दिन तीन परीक्षणों में मापा गया था। डेटा मतलब (SEM) का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। बीएलUE चक्र, एन = 16 बीन संक्रमित चूहों; लाल वर्गों, एन = 16 डीए संक्रमित चूहों; काले त्रिकोण, एन = 20 दिखावा इलाज नियंत्रित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कुछ सीमाओं के बावजूद, rotarod प्रदर्शन परीक्षण मोटर समारोह और TMEV-आयोडीन अल्पता विकार में शिथिलता के साथ ही चूहों में विकलांगता प्रगति पर औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।

Rotarod परीक्षण पहले मूषक 11 में न्यूरोलॉजिकल घाटा मापने के लिए एक उपकरण के रूप में 1957 में वर्णित किया गया था। कृन्तकों घूर्णन गति में वृद्धि के साथ, एक घूर्णन छड़ी पर चलना है, और जमीन पर गिरने से बचने की कोशिश की है। विलंबता गिर करने के लिए दर्ज की गई और मोटर समारोह के लिए एक मात्रात्मक अंत बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है: अधिक स्नायविक हानि जानवरों है, जल्दी ही वे रॉड गिर। पारंपरिक दृश्य स्कोरिंग सिस्टम पर इस परीक्षण के स्पष्ट लाभ यह है कि यह एक उद्देश्य चर कि विकलांगता 3 प्रगति पर चिकित्सा और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के प्रभाव को यों तो सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पन्न करता है। इस तरह के ठीक refle के रूप में दृश्य स्कोरिंग सिस्टमएक्स परीक्षण चूहों में हरकत क्षमताओं का आकलन करने के लिए एक सरल और अधिक तेजी से परीक्षण किया जा रहा है के रूप में पसंद किया जा सकता है। हालांकि, इन प्रणालियों rotarod प्रदर्शन परीक्षण की तरह एक और मात्रात्मक परीक्षण की परिशुद्धता की कमी है, और वे इसलिए प्राकृतिक इतिहास या हल्के और प्रगतिशील स्नायविक हानि के साथ चूहों के प्ररूपी परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, ठीक पलटा परीक्षण की तरह दृश्य परीक्षण विशेष रूप से चूहों कि भी जवान या बहुत प्रभावित rotarod पर परीक्षण किया जा रहे हैं करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।

आदेश rotarod परीक्षण की विकृत आकलन से बचने के लिए, परीक्षण मानकों (यानी, आकार, गति, और घूर्णन छड़ी के त्वरण, पशु को दिया प्रशिक्षण की राशि, और अंतिम डाटा प्रोसेसिंग) को ध्यान से 3 दोहराया जाना चाहिए। आज, rotarod प्रदर्शन का परीक्षण अभी भी सबसे अधिक इस्तेमाल मोटर व्यवहार परीक्षण है, अभी तक वहाँ आदर्श परीक्षण मानकों पर थोड़ा आम सहमति इष्टतम परिणामों का उत्पादन होता है। हमें मिलTMEV-आयोडीन अल्पता विकार है कि चूहों में 1.6 करने के लिए 1.18 से रॉड व्यास का इस्तेमाल किया है के साथ अध्ययन करता है। (3 से 4 सेमी) 12,13, निर्धारित गति 5 से 10 rpm / मिनट की गति दरों में 5 से 10 आरपीएम 12,13 के दर, और 12-14। हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या मस्तिष्क संबंधी मतभेदों के बारे में निष्कर्ष अन्य परीक्षण की स्थिति के लिए सामान्यीकरण होगा। वर्तमान प्रोटोकॉल है कि अनुकूलित और इस तरह rotarod परीक्षण का उपयोग एमएस के TMEV-आयोडीन अल्पता विकार माउस मॉडल में प्रगतिशील मस्तिष्क संबंधी विकलांगता के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कर रहे थे विशिष्ट परीक्षण के मापदंडों की सिफारिशों प्रदान करता है। विशेष रूप से, चूहों में एक rotarod मोटर समारोह के अध्ययन पर तैयार कर पहले, यह सिफारिश की है कि संभावित महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर-बीच में दूसरों, आधारभूत प्रदर्शन और निष्क्रिय रोटेशन-जा माना जाता है।

सबसे पहले, के बारे में आधारभूत प्रदर्शन: प्रयोग और असंक्रमित चूहों समय के साथ अपनी मोटर प्रदर्शन में सुधार, अंत में कई दिनों या हफ्तों 8,9 में एक स्थिर पठार तक पहुंच गया। इस वें हैमोटर सीखने की सामान्य प्रक्रिया के ई नतीजा है। हालांकि, इस सुधार स्थायी नहीं है, और यदि चूहों कई दिनों के लिए अप्रशिक्षित छोड़ दिया जाता है, घूर्णन छड़ी पर अपनी मोटर प्रदर्शन तेजी से 9 छोड़ देंगे। इसलिए, एक आधारभूत प्रदर्शन दृढ़ संकल्प के रूप में अच्छी तरह से एक शारीरिक मोटर प्रदर्शन बूंद के बीच और बिगड़ती के रूप में एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कारण, एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप के बाद मोटर सीखने और वास्तविक वसूली के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है।

हमारे अनुकूलित rotarod प्रोटोकॉल तीव्र इन्सेफेलाइटिस, जो होता है के बीच करने के लिए + 45 डीपीआई (यानी 15 से TMEV-आयोडीन अल्पता विकार चूहों को प्रशिक्षित करने में उम्मीद के भीतर + 3 करने के लिए + 12 डीपीआई, और देर से पुरानी demyelinating रोग है, जो + 30 से करने के लिए विकसित + 40 डीपीआई) 15। यह प्रगतिशील माइलिन रहित का एक परिणाम के रूप में मोटर प्रदर्शन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार जल्दी इन्सेफेलाइटिस के कारण किसी भी योगदान घाटे शामिल नहीं है। आदर्श रूप में, rotarod प्रशिक्षण से पहले किया जाना चाहिएरोग प्रेरण। हालांकि, क्रम में सीएनएस के एक पुराने संक्रमण विकसित करने के लिए, SJL चूहों 16 साल की उम्र के अपने 7 वें सप्ताह से पहले वायरस को इंजेक्शन के साथ किया जाना है। चूंकि यह आम तौर पर जानवरों की उम्र है कि rotarod परीक्षण 8 से 26 सप्ताह 17 पर, एक प्रभावी प्रशिक्षण सत्र TMEV संक्रमण से पहले चूहों में पूरा नहीं किया जा सकता है किया जा सकता है कि स्वीकार किया जाता है।

प्रशिक्षण और आधारभूत प्रदर्शन मूल्यांकन भी कम प्रेरणा, कम बेसल प्रदर्शन, और कम कौशल सीखने के प्रभाव को बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रत्येक जानवर अलग है, और इन मतभेदों को एक मोटर प्रदर्शन के मूल्यांकन में विचार किया जाना चाहिए। यह सबसे अच्छा एक आधारभूत प्रदर्शन सामान्यीकृत सूचकांक, यह भी एक NFI रूप में जाना जाता का उपयोग करके remedied है। इस सूचकांक में भी प्रदर्शन उतार चढ़ाव है कि अलग-अलग परीक्षण सत्र के दौरान चूहों में मनाया जा सकता है के लिए खातों। प्रदर्शन परिवर्तनशीलता व्यवहार परीक्षण में एक आम समस्या है, मुख्य रूप प्रयोगात्मक बाहर कारकों की वजह से हैप्रोटोकॉल, इस तरह के रूप में कम प्रेरणा और जानवर के अतीत के अनुभवों। मतलब प्रत्येक माउस के पिछले तीन बार के अंक के लिए बार चल वितरण की केंद्रीय प्रवृत्ति उम्मीद है कि अगर प्रदर्शन स्थिर बनी हुई है के एक अनुमान प्रदान करता है। इस दिन के लिए दिन के व्यक्तिगत प्रदर्शन परिवर्तनशीलता के लिए खातों। गंभीर स्नायविक विकलांगता तो, कम से कम या 0.3 के बराबर की NFI मूल्यों से परिभाषित जबकि अपेक्षाकृत अप्रभावित चूहों रन बनाए हैं साथ NFI से अधिक या 0.7 के बराबर महत्व देता है। दुर्भाग्य से, इस रणनीति पूरी तरह से समस्या यह है कि प्रेरक परिवर्तन मोटर प्रदर्शन प्रभावित हो सकता है दूर नहीं करता है। आगे इस समस्या का समाधान करने के लिए, चूहों (44.5 से 60 सेमी) इस तरह के प्रशिक्षण के लिए पहले हल्के भोजन के अभाव या में 23.5 करने के लिए 17.5 समायोज्य गिरने ऊंचाइयों की वजह से गिरने का डर वृद्धि हुई के रूप में विशिष्ट प्रेरित सुविधाओं, के अलावा के साथ प्रशिक्षित किया जा सकता है।।

दूसरा, निष्क्रिय घुमाव के बारे में या पाशन: vali करने के लिए शायद सबसे महत्वपूर्ण खतराrotarod डेटा की dity निष्क्रिय घुमाव उठता है कि जब माउस पर जुड़े हुए हैं और निष्क्रिय रूप में बारी बारी रॉड 18 बदल जाता है सकते हैं की घटना है। हालांकि निष्क्रिय रोटेशन विशेष रूप से मोटर समन्वय समस्याओं का सामना चूहों में rotarod पर मनाया जाता है, यह मुकाबला व्यवहार देर रॉड, जो मोटर घाटे की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है गलत तरीके से होगा गिरने में हो सकता है। इसलिए, परेशान मोटर समन्वय के एक माध्यमिक उपाय है, जो डेटा विश्लेषण में विचार किया जाना चाहिए, समय की संख्या की गणना माउस से गिरने के बिना छड़ी के चारों ओर मुड़ता है। इसके अलावा, निष्क्रिय रोटेशन इस तरह के रॉड से 18 के व्यास, गति और त्वरण डिग्री के रूप में कार्य मापदंडों से दृढ़ता से प्रभावित है। निष्क्रिय रोटेशन के जोखिम को कम करने के लिए कोई सही समाधान है, तो के रूप में कम स्पष्ट लकीरें रहे हैं, लेकिन एक संभव संकल्प एक बड़ा व्यास के साथ एक छड़ी का उपयोग हो सकता है (3.15 में करने के लिए यानी, 1.18। (3 से 8 सेमी)) या थोड़ा माउस की चपेट कम। </ P>

Rotarod प्रदर्शन परीक्षण की एक सीमा है कि मोटर आकलन एक छोटी अवलोकन समय तक ही सीमित है। इसके अलावा, प्रकाश अंधेरे चक्र में अलग अलग समय बिंदुओं पर परीक्षण के व्यवहार परीक्षण 19 के परिणाम को बदल सकता है। इस प्रकार, आदेश में इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, कई कंपनियों अभिनव घर पिंजरे विश्लेषण प्रणाली है कि कृंतक व्यवहार के 24/7 निगरानी प्रदान विकसित कर रहे हैं। ये निगरानी प्रणाली निश्चित रूप से नवीनतम और सबसे रोमांचक प्रौद्योगिकी कृंतक व्यवहार अनुसंधान में उपलब्ध प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन अभी भी बहुत महंगा है और हमेशा अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हैं।

सारांश में, rotarod प्रदर्शन परीक्षण TMEV-आयोडीन अल्पता विकार, प्रगतिशील एमएस के एक murine मॉडल में मस्तिष्क संबंधी विकलांगता की लंबी अवधि के मूल्यांकन के लिए एक अपेक्षाकृत सरल, सस्ता, और अच्छी तरह से विशेषता परीक्षण है। पारंपरिक नैदानिक ​​लक्षण अधिक सिस्टम स्कोर इस परीक्षण के लाभ यह है कि यह योग्यता के रूप में करने के लिए एक उद्देश्य चर उत्पन्न करता हैविभिन्न दवाओं, स्थिति, और मोटर समारोह पर प्रक्रियाओं के प्रभाव ntify। जैसा कि ऊपर वर्णित है, कुछ सरल उपाय को लागू करने से rotarod प्रदर्शन परीक्षण की मजबूती को देखते हुए, इस प्रक्रिया का आकलन करने के खिलाफ जो एक आधारभूत (1) प्रगतिशील एमएस और (2) इसकी उपयोगिता को TMEV-आयोडीन अल्पता विकार माउस मॉडल की प्रासंगिकता प्रदान करता है ऐसे एमएस के रूप में प्रगतिशील स्नायविक शर्तों के उपचार के उद्देश्य से उपचारों के परीक्षण के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old Envigo #052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer Harvard Apparatus #340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc BD #328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software Columbus Instruments #0890M

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 117 विकलांगता प्रगति मल्टीपल स्केलेरोसिस Theiler के वायरस के मॉडल demyelinating रोग rotarod न्यूरोलॉजिकल सूचकांक
मापने मल्टीपल स्केलेरोसिस के एक माउस मॉडल में प्रगतिशील मस्तिष्क संबंधी विकलांगता
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Gilli, F., Royce, D. B., Pachner, A. … More

Gilli, F., Royce, D. B., Pachner, A. R. Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (117), e54616, doi:10.3791/54616 (2016).

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