Summary
نقدم بروتوكول لدراسة التفاعلات البطانية-خلية حوطية الإنسان في الماوس باستخدام الاختلاف من هلام مصفوفة المكونات الأوعية الدموية الفحص.
Introduction
الأوعية الدموية هي العملية التي من خلالها يتم تشكيل أوعية دموية جديدة من شبكة الأوعية الدموية الموجودة من قبل (1) وهو محور البحوث الجارية في العديد من مجالات تتراوح من التطور الطبيعي للمرض. وتنطوي هذه العملية الديناميكية انتشار وهجرة الخلايا البطانية (ECS) وتوظيف pericytes لبناء أنبوب الأوعية الدموية التي يتم توجيهها نحو الموقع الذي يحتاج الأكسجين والمواد الغذائية تسليم 2. لدراسة هذه العملية تتطلب الفحص الديناميكي على قدم المساواة، والأهم من واحد يمكن أن ألخص طبيعة ثلاثية الأبعاد من تشكيل الأنبوب. في المختبر وتم وضع المقايسات مصفوفة 3D لتلبية هذه الحاجة، وقد عملت بشكل جيد السماح للباحثين لتحديد الخطوات المنفصلة في المكان والزمان الذي الأوعية الدموية يحدث 3، 4، 5، 6. ومع ذلك، فإن هذه في المختبر 3D نماذج مصفوفة تقتصر على دراسة السفن غير perfused لد بالتالي تفتقر إلى العناصر الأساسية ذات الصلة في عملية تكوين الأوعية الدموية (على سبيل المثال، وتعميم النمو والعوامل المثبطة والتوتر غير طبيعي / القوات عبر السرير الوعائي) وتفشل في محاكاة بيئة معقدة موجودة في الأنسجة الحية. لمعالجة هذا القيد، وقد وضعت عدة في الجسم الحي المقايسات الأوعية الدموية 7، بما في ذلك جل مصفوفة المكونات الفحص التي ستكون محور تقريرنا 8 و 9.
فحص مصفوفة هلام المكونات هو في الجسم الحي الأوعية الدموية فحص الراسخة التي تناشد الباحثين، حيث أنه يوفر منصة قوية لاختبار أدوار الخلايا والمواد المختلفة في الأوعية الدموية. هلام مصفوفة هو متاح تجاريا حل الغشاء القاعدي الذي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خط الخلية الماوس ساركوما أن يتصلب إلى مادة هلامية عند 37 درجة مئوية. هلام مصفوفة يمكن أن تكون مختلطة مع خلايا و / أو المواد، مثل عوامل النمو، وإنجيالمديرية تحت الجلد في الماوس. وسوف المضيف ECS تغزو المكونات أكثر من 14 يوما، تشكيل شبكة الأوعية الدموية، وتصبح مع perfused دم العائل. حتى الآن، وقد ركزت المقايسات المكونات هلام مصفوفة حصرا على دراسة السلوك الخلايا البطانية خلال الأوعية الدموية، ولكن، لعلمنا انه لم يتم يبذل أي جهد لتحديد ما إذا كان هذا الاختبار يمكن استخدام الخلايا البطانية للمشاركة في الثقافة وpericytes لدراسة كيفية تفاعل هذين النوعين من الخلايا اثنين خلال الأوعية الدموية. على وجه التحديد، فهم العلاقة بين ECS وpericytes هو قيمة لدراسة الأمراض حيث فقدان الأوعية الدموية هي مرضية، بما في ذلك نقص التروية الدموية الدقيقة وأمراض الأوعية الدموية الطرفية 10، 11، 12.
هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يدخل pericytes المستمدة من الإنسان إلى خليط جل مصفوفة جنبا إلى جنب مع ECS البشري وعامل نمو الخلايا الليفية (bFGF). هذا الخليط ويمكن بعد ذلك يتم حقن تحت الجلد طن ظهر من الفئران SCID للسماح تشكيل، خلية حوطية المغلفة، والسفن الهجينة تعمل بكامل طاقتها. يصف بروتوكول لدينا كيفية إعداد سدادات هلام مصفوفة تحتوي على ECS الإنسان إما مع أو بدون pericytes الإنسان، والتنسيب في الفئران SCID وكيفية تحليل المقاطع النسيجية بالنسبة لنهايات الأوعية الدموية الحرجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: إجراءات التي تجرى على الحيوانات وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة ستانفورد كلية الطب.
ملاحظة: الحيوانات تحت التخدير مع 3٪ الأيزوفلورين المرذاذ والعرض 3٪ من غاز O 2. استخدام مرهم التعليم والتدريب المهني في العيون قد تساعد على منع جفاف بينما تحت التخدير.
1. خلية التحضير
- تنمو الخلايا البطانية وخلية خلية حوطية الثقافات الإنسانية في لوحات 100 ملم مع 10 مل من وسائل الإعلام المناسبة. استبدال 10 مل من متوسطة جديدة كل 2-3 أيام حتى خلايا تصل إلى 80٪ confluency.
- ثقافة الخلايا البطانية (ECS) في الكامل وسائل الاعلام الخلايا البطانية (ECM) تستكمل مع شركة زودت 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10٪ البنسلين / الستربتومايسين و 10٪ تكملة نمو الخلايا البطانية.
- pericytes ثقافة في وسائل الإعلام خلية حوطية الكامل (PM) تستكمل مع شركة الموردة 2٪ FBS، 10٪ البنسلين / الستربتومايسين و 10٪ ملحق نمو خلية حوطية.
- تحضير المزيج من الخلايا
- حساب العدد المطلوب من الخلايا للمجموعات التجريبية والضابطة.
ملاحظة: كل المكونات في المجموعة التجريبية يحتوي على مليون (1 × 10 6) ECS البشري ومائتي ألف (2 × 10 5) pericytes. لمجموعة المراقبة، كل المكونات يحتوي على 1.2 مليون ECS الإنسان فقط. السيطرة على المجموعة السلبية لها جل مصفوفة فقط. وينبغي أن تتضمن كل مجموعة أربعة على الأقل المقابس، الأمر الذي يتطلب اثنين من الفئران كما يمكن حقن المقابس في كل جانب من أسفل الماوس مرة أخرى. هناك ثلاثة شمعات بمثابة ثلاث نسخ للتجربة ويمكن استخدام رابع في حالة واحدة فشل. إعداد الخلايا الإضافية 25٪ لتتناسب مع حجم إضافي من هلام. - جمع وعدد الخلايا من لوحات الثقافة.
- لفصل الخلايا، وإزالة وسائل الإعلام ويغسل مرة واحدة مع 1X درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل 0.25٪ التربسين / 2.21 ملي EDTA، واحتضان لمدة 1 دقيقة. غسل الخلايا قبالة لوحة بإضافة 2مل المتوسطة وجمع في أنبوب 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- أجهزة الطرد المركزي العدد المناسب من الخلايا في بيليه في 400 x ج لمدة 5 دقائق. وبالنسبة للمجموعة التجريبية، الطرد المركزي على حد سواء ECS وpericytes أسفل معا في بيليه واحد.
- حساب العدد المطلوب من الخلايا للمجموعات التجريبية والضابطة.
2. مصفوفة تحضير هلام
- ذوبان الجليد من هلام مصفوفة تماما في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو طوال الليل للحصول على حل متجانسة. لا يلزم الاختلاط.
- هلام قسامة مصفوفة في أنابيب 1.5 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- قبل البرد العقيمة 1.5 مل أنابيب و 28 G 1 المحاقن سم مكعب الأنسولين في 4 درجات مئوية. تنبيه: حافظ هلام مصفوفة على الجليد في جميع الأوقات.
- مزيج هلام مصفوفة البارد مع bFGF في نسبة حجم 1: 100 (تركيز النهائي من bFGF = 0.5 ميكروغرام / مل. bFGF حل سهم = 50 ميكروغرام / مل) بعد خلط حل هلام مصفوفة من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات، واحتضان على الجليد ل30 - 60 دقيقة بefore الاختلاط مع الخلايا في الخطوة 3.1.
ملاحظة: ذوبان الجليد في الأسهم bFGF قبل الاختلاط. حساب عدد من المقابس حاجة للحقن. على سبيل المثال، كل المكونات يتطلب 200 هلام ميكرولتر المصفوفة. لذلك، وإعداد 25٪ هلام اضافية.
3. مزيج مصفوفة هلام مع خلايا
- لكل مجموعة، resuspend الكرية الخلية (التي تحتوي على عدد الخلايا المناسب) مع حجم المحسوبة من هلام مصفوفة تحتوي على bFGF. المزيج بلطف لتجنب رغوة وترك في أنبوب 15 مل على الجليد حتى يتم إعداد الفئران للحقن.
4. إعداد ماوس
- تخدير 1 الفئران SCID لمدة 5 دقائق في 3٪ الأيزوفلورين بالإضافة إلى O 2 3٪ في غرفة الاستقراء. التركيز على المجموعة التجريبية واحد، أو 2 الفئران، في وقت واحد.
- إزالة الماوس من غرفة الاستقراء، ومكان على الجانب البطني سادة التدفئة أسفل وبسرعة إرفاق فوهة خطم لوجه الماوس، عبر نظام غير إعادة التنفس لتوريد التخدير في جميع أنحاء إنجيالإجراء ction. التبديل تدفق الغاز من غرفة تحريض على نظام عدم إعادة التنفس وانخفاض ضغط الغاز إلى 1.5٪ الأيزوفلورين و 1.5٪ O 2.
- إزالة الشعر من المنطقتين هند الجانبية (حوالي سم قطرها 1) مع ماكينة حلاقة أو كريم إزالة الشعر.
- مسح منطقة الجلد مع لوحة الكحول 70٪.
- عودة الماوس إلى غرفة الاستقراء وكرر الخطوات من 4،2-4،4 مع الماوس الثاني.
5. مصفوفة جل حقن
- إعداد الماوس واحد للحقن عن طريق ربط لنظام عدم إعادة التنفس ووضع على الجانب البطني سادة التدفئة أسفل.
- تحميل هلام مصفوفة إلى قبل المبردة 28 G 1 سم مكعب حقنة الانسولين الماوس في وقت واحد.
- تحميل حجم 500 ميكرولتر كاملة من هلام مصفوفة لاثنين من المقابس (200 ميكرولتر لكل المكونات بالإضافة إلى 25٪ إضافية) في حقنة.
- تأكد لحقن هلام مصفوفة في الفئران بعد 3 دقائق من تحميل الخلايا في حقنة لمنع مLLS من الاستقرار إلى جانب حقنة ومنع هلام مصفوفة من ترسيخ داخل الحقنة.
- رفع الجلد مرة أخرى لتحديد مساحة تحت الجلد، ثم حقن 200 ميكرولتر من هلام مصفوفة ببطء وبشكل متساو في الفضاء تحت الجلد الخلفي الخلفي للقفص الصدري.
- إزالة إبرة الحقن ببطء، والحرص على منع هلام مصفوفة من تسرب من موقع الحقن. وهناك عثرة تشكل في موقع الحقن. مسح موقع الحقن مع وسادة الكحول.
- تكرار الحقن الخطوات 5،2-5،5 على الجانب الآخر من الخلف الماوس، ثم ترك الماوس على ظهرها لمدة 1 دقيقة للسماح للدبق من هلام مصفوفة على لوحة الحرارة.
- الخطوط العريضة كل من المطبات باستخدام علامة دائمة لتحديد عثرة بعد 14 يوما. بعد نمو بعض الشعر مرة أخرى، وسوف يكون من الأسهل العثور عثرة.
6. مصفوفة جل التوصيل العزلة: 14 أيام بعد الحقن
- الموت ببطء الفئران إنسانية من خلال تعريض الحيوانالصورة ل> 5 دقائق من استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم للتأكد من الموت.
- إزالة المكونات هلام مصفوفة من الخلف الفأر.
- إزالة الشعر بلطف إنمائها حول موقع الحقن حيث يقع سد بتكرار الخطوة 4.3. خط علامة تدل على حجم عثرة الأصلية تحت الجلد.
- استئصال المكونات جنبا إلى جنب مع المحيط طبقات الجلد والعضلات تعلق على الجانبين العلوي والسفلي من المكونات، على التوالي.
- باستخدام مقص جراحي غرامة، وجعل شق على الحدود ملحوظ من المكونات التي هي عمودي على الجلد وقطع طريق لعضلة تحت المكونات. ثم، وقطع بعناية حول محيط سد على طول الحدود ملحوظ.
- إزالة المكونات، والحفاظ عليها تقع بين طبقات الجلد والعضلات. شطف فورا في كوب صغير مع برنامج تلفزيوني 1X ليغسل الدم الزائد. المكونات هو الآن على استعداد لتكون ثابتة (الخطوة التالية، 6.3).
- إصلاح PLUز في 4٪ امتصاص العرق.
- وضع المكونات بأكمله، بما في ذلك طبقات الجلد والعضلات، في أنبوب 50 مل مع 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة دون هزاز. في اليوم التالي، ونقل المكونات إلى 25 مل من الايثانول 70٪ لمدة 24 ساعة أخرى قبل تضمين البارافين.
ملاحظة: التعامل مع امتصاص العرق بحذر. البس القفازات.
- وضع المكونات بأكمله، بما في ذلك طبقات الجلد والعضلات، في أنبوب 50 مل مع 25 مل من 4٪ لامتصاص العرق لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة دون هزاز. في اليوم التالي، ونقل المكونات إلى 25 مل من الايثانول 70٪ لمدة 24 ساعة أخرى قبل تضمين البارافين.
7. البارافين عملية مصفوفة جل التوصيل
- إعداد المكونات لتضمين البارافين.
- توجيه المكونات كما هو مبين في الشكل 1A. وضع المكونات في الكاسيت النسيج بحيث الجانب من المكونات يواجه صعودا وكل من طبقات الجلد والعضلات مرئية على سطح كتلة الأنسجة التي سيتم قطع لأول مرة خلال باجتزاء.
- تضمين البارافين المكونات وفقا لالبارافين تضمين البروتوكولات القياسية (13).
- قطع 8-10 ميكرون أبواب سميكة الخروج من كتلة الأنسجة وجبل على المجهر الشرائح أكوردينغ إلى البارافين باجتزاء البروتوكولات القياسية (13).
- تخزين الشرائح في مكان بارد وجاف في درجة حرارة الغرفة لتصبح جاهزة للتلوين.
8. أقسام وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين وصمة عار (H & E) 13
- دي paraffinize أقسام الأنسجة عن طريق تمرير الشرائح من خلال 100٪ الزيلين مرتين، الإيثانول بنسبة 100٪، و 95٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول و1X أخيرا في برنامج تلفزيوني، كل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ترك الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X حتى الخطوة التالية.
- ماصة 100 ميكرولتر H & E حل على قسم واحتضان لمدة 1-5 دقائق، أو حتى وجود تباين واضح بين نوى الزرقاء والسيتوبلازم الوردي في زنزانة كما ينظر تحت المجهر ضوء تستقيم في 10X التكبير. يجب الحرص على عدم ترك أي حل H & E تلمس الهدف.
- غسل H & E حل الخروج من الشريحة التي كتبها التغميس الشريحة في كوب كبير من ماء الصنبور، ثم ضع الشريحة في رف في كوب والاحمرار مع المياه الجارية لمدة 2 دقيقة.
- مولقد إلى الخطوة 9.8 لتحميل الشرائح.
9. وصمة عار الشرائح أخرى للالشعيرات الدموية الإنسان وPericytes
- دي paraffinize أقسام الأنسجة عن طريق تمرير الشرائح من خلال 100٪ الزيلين مرتين، الإيثانول بنسبة 100٪، و 95٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول و1X أخيرا في برنامج تلفزيوني، كل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ترك الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X حتى الخطوة التالية.
- تغلي المقاطع في حل استرجاع مستضد.
- في دورق 2 لتر، وإعداد المغلي مستضد حل استرجاع باستخدام عازلة سيترات 1X (7.0 درجة الحموضة) في 95 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
- مرة واحدة المغلي، ووضع الشرائح في رف معدني ويغرق في حل استرجاع الغليان مستضد لمدة 20 دقيقة.
- إزالة بعناية كوب من كتلة التدفئة مع الشرائح لا تزال مغمورة والسماح الحل للعودة ببطء إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- ضع الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X حتى الخطوة التالية.
- منع المقاطع في عرقلة العازلة (برنامج تلفزيوني 1X، 5٪ الماعز المصل، 00.3٪ تريتون X-100).
- رسم دائرة مسعور حول حواف كل قسم مع القلم PAP.
- ضع الشرائح في صينية الرطوبة مع الماء المقطر في أسفل الدرج.
- وتغطي ماصة 100 ميكرولتر عازلة تمنع على الأقسام والتأكد من جميع الأنسجة عن طريق السوائل (قد تتطلب أكثر من 100 ميكرولتر).
- احتضان المقاطع مع عازلة تمنع لمدة 1 ساعة.
- احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية.
- يعد حل واحد مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية للتحقيق في كل قسم لCD31 (ECS) والأكتين العضلات الملساء (pericytes) المخفف في المخزن التخفيف (برنامج تلفزيوني 1X، 1٪ BSA، 0.3٪ تريتون X-100).
ملاحظة: هنا، تركيز مكافحة CD31 هو 01:50 ومكافحة سلس تركيز العضلات الأكتين هو 1: 300. - احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 100 الأجسام المضادة الأولية ميكرولتر في علبة الرطوبة التي تحتوي على الماء المقطر.
- يعد حل واحد مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية للتحقيق في كل قسم لCD31 (ECS) والأكتين العضلات الملساء (pericytes) المخفف في المخزن التخفيف (برنامج تلفزيوني 1X، 1٪ BSA، 0.3٪ تريتون X-100).
- غسل الشرائح ثلاث مرات في 1X PBST (برنامج تلفزيوني 1X + 0.1٪ TWEen20) لمدة 5 دقائق كل غسل.
- احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية.
- يعد حل مع fluorophore الماعز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية للاعتراف مكافحة CD31 أرنب الأجسام المضادة المخفف في المخزن التخفيف.
- ملاحظة: يتم مترافق والعضلات الملساء الأجسام المضادة الأولية الأكتين بالفعل مع fluorophore CY3، لذلك لا حاجة لتلوين الأجسام المضادة الثانوية. الماعز المضادة أرنب تركيز الأجسام المضادة الثانوية 1: 250.
- احتضان أقسام لمدة 1 ساعة مع 100 الضد الثانوية ميكرولتر في علبة الرطوبة التي تحتوي على الماء المقطر.
- يعد حل مع fluorophore الماعز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية للاعتراف مكافحة CD31 أرنب الأجسام المضادة المخفف في المخزن التخفيف.
- غسل الشرائح ثلاث مرات في 1X PBST لمدة 5 دقائق كل غسل.
- جبل الشرائح.
- ماصة 2-3 قطرات (~ 40 - 60 ميكرولتر) من antifade حل المتصاعدة مع تلطيخ النووي دابي على كل قسم.
- وضع بلطف لا. 1.5 زلة تغطية على أقسام وحل المتصاعدة، مما يسمح للسائل أن انتشرت على الأقسام وعلى حوافانزلاق الغطاء. استخدام بلطف الإصبع للضغط من خارج فقاعات الهواء التي قد تكون موجودة على القسم.
- السماح للشرائح الجافة لا يقل عن 1 ساعة قبل المناولة.
10. تحديد شعري كثافة والهيكل 14
- حساب عدد من الشعيرات الدموية في H & E أقسام الملون، كما أعرب عن # / مم 2.
- الحصول على الصور من أربعة حقول مختلفة على مجهر الضوء تستقيم تحت 40X التكبير.
يتم تحديد الشعيرات الدموية مثل أنابيب مليئة خلايا الدم الحمراء: ملاحظة. - بدلا من ذلك، بدلا من الشعيرات الدموية العد والفرز يدويا، استخدام برمجيات تحليل الصور (على سبيل المثال، Wimasis تحليل الصور) لقياس المعلمات الأوعية الدموية المختلفة مثل عدد السفن، ومتوسط طول السفينة وقطر، ونقاط فرع.
- الحصول على الصور من أربعة حقول مختلفة على مجهر الضوء تستقيم تحت 40X التكبير.
- تحليل بنية الشعرية في أقسام مناعي الملون.
- الحصول على الصور من أربعة حقول مختلفة على المجهر الفلورسنت المقلوبمع FITC وTxRed مرشح مكعب.
- استخدام مكعب FITC إلى صورة ECS من الإثارة في 488 نانومتر الطول الموجي واستخدام مكعب TxRed إلى pericytes الصورة عن طريق الإثارة في 594 نانومتر الطول الموجي.
- الحصول على الصور من أربعة حقول مختلفة على المجهر الفلورسنت المقلوبمع FITC وTxRed مرشح مكعب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد ممثل H & E ومناعي تلطيخ أقسام المكونات هلام مصفوفة في الشكل 2. أقسام من المفوضية الأوروبية المقابس فقط عرض بعض السفن التي في الغالب لا مع perfused الدم (الشكل 2 أعلى اليسار، السهام السوداء) في حين المقابس تحتوي على كل ECS وpericytes عرض العديد من perfused سفن بأقطار أكبر وتغطية خلية حوطية كاملة، كما يتضح من تلطيخ SMA إيجابي متاخم لECS-CD31 إيجابي. وتشير هذه النتائج إلى أن pericytes تلعب دورا كبيرا في تشكيل الأوعية الدموية الوليدة وأن هذه العملية الحيوية يمكن تلخيصها وتحليلها في نموذج في الجسم الحي بسهولة.
الشكل 1. الأنسجة التوجيه عندما جزءا لا يتجزأ في الأنسجة كاسيت. بعد عزل المكونات هلام مصفوفة (الصفراء)، فمنبين العضلات الماوس، (اللون الأرجواني) والجلد (الأخضر) طبقات. يتم وضع المكونات في الكاسيت النسيج كما هو موضح بحيث يمكن أن ينظر إلى جميع الطبقات الثلاث عبر السطح من شأنها أن تقطع لأول مرة خلال باجتزاء. أ) المنظر من أعلى كاسيت، B) عرض من جانب الكاسيت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الممثل H & E (الصف العلوي) والمناعي (الصف السفلي) من مصفوفة جل. تظهر الصور ظهور ECS وحدها (الصور اليسرى) وECS بالإضافة إلى pericytes صحية (كمبيوتر) (الصور اليمنى). وصفت الإنسان والفئران ECS في الخضراء (الصور أسفل) وpericytes (α سلسة الأكتين العضلات (αSMA)) وصفت باللون الأحمر (أسفل اليمين)، ونوى همالملون الأزرق مع وصمة عار دابي. المقياس هو 25 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من منشور السابق 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت المصفوفة هلام المكونات الاختبار لتكون وسيلة مريحة وقوية لتقييم تنظيم الجينات في الأوعية الدموية، والمركبات عائية وantiangiogenic في الجسم الحي، ولتكملة في المختبر الاختبارات. هنا، نحن تصف بالتفصيل رواية هلام مصفوفة المكونات فحص من الأوعية الدموية البشري الذي يحقق التفاعل بين الخلايا البطانية وpericytes خلال تشكيل السفينة.
هناك بضع خطوات جديدة وحاسمة في هذا البروتوكول. الخلايا في مرور منخفض (مرور 1-4) هي الأفضل لأن خلايا شابة ستكون أكثر قدرة على البقاء أثناء الإعداد تجريبي لمدة 14 يوما. عدد الخلايا البطانية المستخدم هو الحد الأدنى من مليون ونسبة من المفوضية الأوروبية لخلية حوطية هي 5: 1؛ ومع ذلك، فإن زيادة عدد الخلايا خلية حوطية تعزيز تغطيتها في الشعيرات الدموية. لصالح المجموعة التجريبية من الخلايا البطانية وحده، يجب أن يكون العدد الكلي للخلايا حقن مجموع الخلايا البطانية وpericytes، وهو 1.2 مليون، لذلكه، وإجمالي عدد الخلايا في المكونات هو ثابت. ومن المهم لحساب الكميات المناسبة من أعداد الخلايا وحجم جل المصفوفة. الصيغة الأساسية هي 1.2 مليون الخلايا في 200 ميكرولتر من هلام مصفوفة. وبالإضافة إلى ذلك، قبل الحقن، والحفاظ على نصائح الماصة، والمحاقن، هلام مصفوفة، والكريات الخلايا على الجليد في جميع الأوقات. منذ هلام مصفوفة هو لزج ومن أجل تجنب فقاعات الهواء تشكيل خلال تعليق خلية، وقطع حوالي 1 سم الخروج من غيض من 1 مل نصائح الماصة للسماح لتدفق أفضل. لا تخلط هلام مصفوفة مع خلايا الفئران حتى جاهزة للحقن. كل حقن المكونات يجب أن يأخذ أقل من دقيقة واحدة. واحد الماوس يمكن أن تحمل اثنين من المقابس، واحدة على كل جانب من ظهرها. عندما تجعل استخراج المقابس للحفاظ على يقين المكونات تقع بين العضلات وطبقات الجلد، ثم المكونات هلام مصفوفة وسيتم جمع جيدا بعد العزلة.
سلبيات الفحص مصفوفة هلام المكونات هي أنها مضيعة للوقت ومكلفة، وينطوي على خطوات شاقة وحساسة مثل injecنشوئها والعزلة المكونات. إذا كانت هذه الخطوات أن تفشل، فإن النتائج سوف تكون مدمرة وسيكون لها عملية لتكرارها مرة أخرى مع الفئران والمواد الجديدة.
ومع ذلك، فإن البيانات غير قابلة للتكرار، ويوفر المرونة من حيث التصميم التجريبي. على سبيل المثال، عوامل النمو أو مثبطات يمكن أن تدار على المكونات في مراحل مختلفة من التنمية الأوعية الدموية، والتي يمكن استخدامها من أجل التحقق من المخدرات. وعلاوة على ذلك، إدماج أنواع أخرى من الخلايا، مثل الخلايا القبض على النمو، وخطوط الخلايا transfected أو خطوط الخلايا السرطانية، في المكونات هلام مصفوفة هو إمكانية أخرى لمعالجة النمط الظاهري الخلايا البطانية خلال الأوعية الدموية. لدينا بروتوكول يستخدم هذه المرونة ويدخل pericytes المستمدة الإنسان جنبا إلى جنب مع ECS للسماح تشكيل، خلية حوطية مغطاة، والسفن الهجينة تعمل بكامل طاقتها في الجسم الحي. يصف بروتوكول لدينا أيضا كيفية تحليل المقاطع النسيجية من هذه المقابس بالنسبة لنهايات الأوعية الدموية الهامة، بما في ذلك أنبوبعدد وطول الأنبوب، مع هذين النوعين من الخلايا اثنين الحالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
