Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Published: December 19, 2016 doi: 10.3791/54617

Summary

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

Introduction

Angiogenese is het proces waardoor nieuwe bloedvaten worden gevormd uit een reeds bestaande vasculaire netwerk 1 en is het onderwerp van onderzoek in vele gebieden, variërend van normale ontwikkeling ziekten. Dit dynamische proces omvat de proliferatie en migratie van endotheelcellen (EC) en de aanwerving van pericytes een vasculaire buis die is gericht op de site die zuurstof en voedingsstoffen levering 2 moet construeren. Studeren vereist deze werkwijze een even dynamische test, vooral degene die de driedimensionale aard van vaatvorming kan herhalen. In vitro 3D matrix assays ontwikkeld om deze behoefte en goed gefunctioneerd om onderzoekers de discrete stappen in ruimte en tijd waarin angiogenese plaatsvindt 3, 4, 5, 6 definiëren. Echter, deze in vitro 3D matrixmodellen beperkt tot het bestuderen van niet-geperfuseerde vaten ind daarom geen kritische componenten die relevant zijn voor het proces van angiogenese (bijv circulerende groei en remmende factoren, onnatuurlijke spanningen / krachten over het vasculaire bed) en niet aan de complexe omgeving aanwezig in levend weefsel te simuleren. Om deze beperking te pakken zijn verscheidene in vivo angiogenese assays ontwikkeld 7, waaronder de matrixgel plug assay die de focus van ons rapport 8, 9 zijn.

De matrix gel plug test is een gevestigde in vivo angiogenese assay dat een beroep op de onderzoekers omdat het een robuust platform om de rol van de verschillende cellen en stoffen bij angiogenese te testen. Matrixgel is een commercieel verkrijgbare basaalmembraan oplossing die wordt afgescheiden door de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma cellijn die stolt tot een gel-achtig materiaal bij 37 ° C. De gel matrix kan worden gemengd met cellen en / of stoffen, zoals groeifactoren en injesubcutaan cted in de muis. De gastheer EC zal de plug binnenvallen meer dan 14 dagen, vormen een vasculair netwerk, en raken perfusie met bloed van de gastheer. Tot op heden zijn matrixgel plug assays uitsluitend gericht op de studie van endotheelcellen gedrag tijdens angiogenese echter om ons beste weten geen inspanningen nog uitgevoerd om te bepalen of deze assay kan worden gebruikt voor co-kweek endotheelcellen en pericyten te bestuderen hoe deze twee celtypen interactie tijdens angiogenese. Specifiek, inzicht in de relatie tussen EC en pericyten is waardevol voor het bestuderen van ziekten waarbij bloedvat verlies pathologisch, waaronder microvasculaire ischemie en perifere vaatziekte 10, 11, 12.

We beschrijven een protocol dat humaan afgeleide pericytes introduceert de matrixgel mengsel samen met humane EC en fibroblast groeifactor (bFGF). Dit mengsel kan vervolgens subcutaan in het dorsale gedeelte van SCID muizen om de vorming van volledig functioneel, pericyte gecoat, hybride schepen toe te staan. Ons protocol beschrijft hoe matrix gel pluggen die humane EC met of zonder menselijke pericytes, plaatsing in SCID muizen en hoe de histologische secties voor kritische angiogenese eindpunten te analyseren voor te bereiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Stanford University School of Medicine.

LET OP: De dieren zijn onder verdoving met 3% verdamper isofluraan en 3% levering van O 2 gas. Het gebruik van vet zalf op de ogen kan helpen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose.

1. Celbereiding

  1. Groeien humane endotheliale en pericyte celkweken in 100 mm platen met 10 ml van de geschikte media. Vervang 10 ml vers medium om de 2-3 dagen tot cellen te bereiken 80% samenvloeiing.
    1. Kweek endotheelcellen (EC) in alle endotheliale celmedium (ECM) aangevuld met bedrijf leverde 5% foetaal runderserum (FBS), 10% penicilline / streptomycine en 10% endotheelcel supplement.
    2. Cultuur pericyten in volledige pericyte media (PM), aangevuld met bedrijf leverde 2% FBS, 10% penicilline / streptomycine en 10% pericyte groei supplement.
    3. Bereid cel mengsels
      1. Bereken het vereiste aantal cellen voor de experimentele en controlegroepen.
        OPMERKING: Elke plug in de experimentele groep bevat één miljoen (1 x 10 6) humane EC en tweehonderdduizend (2 x 10 5) pericytes. Voor de controlegroep, elke plug bevat slechts 1,2 miljoen menselijk EC. De negatieve controle groep heeft slechts matrix gel. Elke groep ten minste vier stekkers, die twee muizen vereisen pluggen kan worden geïnjecteerd in elke zijde van een muis onderrug. Drie connectors zouden dienen als triplo voor het experiment en de vierde kan worden gebruikt wanneer één uitvalt. Bereid 25% extra cellen om de extra volume van de gel aan te passen.
      2. Verzamelen en cellen tellen vanaf kweekplaten.
        1. Om cellen los, verwijder media en eenmaal wassen met kamertemperatuur 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijderen PBS, voeg 1 ml 0,25% trypsine / 2,21 mM EDTA, en incubeer gedurende 1 min. Was de cellen van de plaat door toevoeging van 2ml medium en het verzamelen in een 15 ml buis.
        2. Celtelling met een hemocytometer volgens de instructies van de fabrikant.
        3. Centrifugeer de geschikte aantal cellen in een korrel bij 400 xg gedurende 5 minuten. Voor de experimentele groep, centrifuge zowel EC en pericytes beneden samen in een pellet.

    2. Matrix gelbereiding

    1. Ontdooien matrix gel volledig bij 4 ° C gedurende 4 uur of een nacht om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. Mengen niet vereist.
    2. Aliquot matrix gel in 1,5 ml buisjes en bewaar bij 4 ° C.
    3. Pre-chill steriele 1,5 ml buizen en 28 G 1 cc insuline spuiten bij 4 ° C. Let op: Houd matrix gel op ijs te allen tijde.
    4. Meng koude matrixgel met bFGF in een volumeverhouding van 1: 100 (eindconcentratie van bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF voorraadoplossing = 50 ug / ml) Na menging matrixgel oplossing en neer te pipetteren meerdere malen, incubeer op ijs gedurende 30 - 60 min before mengen met de cellen in stap 3,1.
      LET OP: Ontdooi de voorraad bFGF voor het mengen. Bereken het aantal pluggen nodig voor injectie. Bijvoorbeeld, elke plug vereist 200 pl matrix gel. Daarom bereiden 25% extra gel.

    3. Meng Matrix Gel met cellen

    1. Voor elke groep, resuspendeer de celpellet (die geschikte aantal cellen) met de berekende hoeveelheid matrix gel met bFGF. Meng voorzichtig om schuimvorming te voorkomen en laat in de 15 ml buis op ijs tot muizen worden voorbereid voor injectie.

    4. Mouse Voorbereiding

    1. Verdoven 1 SCID muizen gedurende 5 minuten in 3% Isofluraan plus 3% O 2 in een inductie kamer. Focus op een experimentele groep of 2 muizen per keer.
    2. Verwijder de muis uit de inductie kamer, plaats op een verwarmingselement ventrale zijde naar beneden en snel bevestig een snuit pijpje in het gezicht van de muis via een niet-rebreathing systeem om de anesthesie te leveren gedurende de Injectie procedure. Zet de gasstroom uit de inductie kamer naar de open systeem en laat de gasdruk tot 1,5% isofluraan en 1,5% O2.
    3. Verwijder haar van beide laterale achterste regio's (ongeveer 1 cm diameter) met een scheerapparaat of ontharingscrème.
    4. Veeg de huid met een 70% alcohol pad.
    5. Zet de muis om de inductie kamer en herhaal de stappen 4,2-4,4 met de tweede muis.

    5. Matrix Gel Injection

    1. Bereid een muis voor injectie door het aanbrengen van de niet-rebreathing systeem en het op de verwarming pad ventrale zijde naar beneden.
    2. Laad de matrix gel in een voorgekoeld 28 G 1 cc insulinespuit één muis tegelijk.
      1. Laad de volledige 500 pl volume matrixgel twee pluggen (200 gl per plug plus 25% extra) in de spuit.
      2. Zorg ervoor dat de matrix gel in de muizen te injecteren binnen 3 minuten van het laden van de cellen in de spuit om de ce voorkomenlls van de afwikkeling naar de kant van de spuit en te voorkomen matrixgel stollen binnenzijde van de spuit.
    3. Til de achterkant huid om subcutane ruimte te vinden, dan injecteer 200 ul van de matrix gel langzaam en gelijkmatig in de subcutane ruimte van de achterkant posterior van de ribbenkast.
    4. Verwijder de injectienaald langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat matrix gel lekt uit de injectieplaats. Een bult zal vormen op de injectieplaats. Veeg de injectieplaats met een doekje met alcohol.
    5. Tweede injectie stappen 5,2-5,5 aan de andere kant van de rug muis, laat de muis op de rug voor 1 min tot gelering van de gel matrix op het vuur pad mogelijk.
    6. Schetsen beide bulten met behulp van een permanent marker om de bult te identificeren na 14 dagen. Na wat haar terug groeit, zal het makkelijker zijn om de bult te vinden.

    6. Matrix Gel Plug Isolatie: 14 dagen na de injectie

    1. Euthanaseren de muizen op humane wijze door het blootstellen van het diers tot> 5 min van inhalatie van kooldioxide, gevolgd door cervicale dislocatie gedood verzekeren.
    2. Verwijder de matrix gel stekker uit de rug van de muis.
      1. Verwijder voorzichtig regrown haar rond de plaats van injectie, waar de stekker zich bevindt, herhaalt u stap 4.3. De markering lijn geeft het formaat van het origineel bult onder de huid.
      2. Uitsnijden de plug samen met de omringende huid en spierlagen bevestigd aan de boven- en onderkant van de plug respectievelijk.
        1. Met behulp van fijne chirurgische schaar, een insnijding op de gemarkeerde rand van de plug die loodrecht op de huid en doorsnijden de spieren onder de plug. Vervolgens knip voorzichtig rond de omtrek van de plug op de gemarkeerde rand.
        2. Trek de stekker, het houden van het ingeklemd tussen de huid en spieren lagen. Onmiddellijk spoelen in een kleine beker met 1x PBS weg te wassen overtollige bloed. De plug kan nu worden vastgesteld (volgende stap 6,3).
    3. Bevestig de plug in 4% paraformaldehyde.
      1. Plaats het gehele plug met schil en spierlagen, in een 50 ml buis met 25 ml 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur zonder schokken. De volgende dag, de overdracht van de stekker in 25 ml 70% ethanol nog 24 uur voor inbedden in paraffine.
        OPMERKING: ga paraformaldehyde met de nodige voorzichtigheid. Draag handschoenen.

    7. Paraffine Verwerk de Matrix Gel Plug

    1. Maak de stekker voor paraffine inbedding.
      1. Richt de stekker zoals weergegeven in figuur 1a; de stekker in een weefselcassette dat de zijde van de stekker naar boven en zowel de huid als spierlagen zichtbaar over het oppervlak van het weefsel blok dat eerst wordt gesneden tijdens het snijden.
    2. Paraffine insluiten de stekker volgens standaard paraffine inbedding protocollen 13.
    3. Snijd 8-10 urn dik secties af van het weefsel blok en monteren op microscoopglaasjes AccorDing standaard paraffine snijden protocollen 13.
    4. Bewaar de dia's in een koele en droge plaats bij kamertemperatuur totdat klaar voor kleuring.

    8. Stain secties met hematoxyline en eosine Stain (H & E) 13

    1. De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia's door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap.
    2. Pipet 100 pi H & E oplossing op de sectie en incubeer gedurende 1-5 min, of totdat er een duidelijke contrast tussen blauw kernen en roze cytoplasma in een cel als bekeken onder een rechtopstaande lichtmicroscoop bij 10x vergroting. Wees voorzichtig niet te laten H & E oplossing te raken de doelstelling.
    3. Wash H & E oplossing off van de dia door dunking de dia in een grote beker van leidingwater, plaats dan de dia in een rek in de beker en spoelen met stromend water gedurende 2 minuten.
    4. Move stap 9.8 op de objectglaasjes monteren.

    9. Stain Andere Slides for Human haarvaten en pericytes

    1. De-paraffinize de weefselcoupes door het passeren van de dia's door 100% xyleen tweemaal, 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en tenslotte 1x PBS, elk gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Laat objectglaasjes in 1x PBS tot de volgende stap.
    2. Kook de secties in antigen retrieval oplossing.
      1. In een 2 L beker bereiden kokende antigeenterugtrekking oplossing met 1 x citraatbuffer (pH 7,0) bij 95 ° C op een verwarmingsblok.
      2. Eenmaal koken, plaats de dia's in een metalen rek en onder te dompelen in de kokende antigen retrieval oplossing gedurende 20 min.
      3. Haal het bekerglas van de verwarming blok met de glijbanen nog steeds onder water en laat de oplossing langzaam terug naar kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
      4. Plaats de dia's in 1x PBS tot de volgende stap.
    3. Blokkeer de secties in het blokkeren van buffer (1x PBS, 5% Goat Serum, 00,3% Triton X-100).
      1. Teken een hydrofobe cirkel rond de randen van elke sectie met een PAP pen.
      2. Plaats de objectglaasjes in een vochtige bak met gedestilleerd water op de bodem van de bak.
      3. Pipetteer 100 ui blokkerende buffer op de secties zorgt ervoor dat alle van het weefsel is bedekt met vloeistof (kan meer dan 100 ul vereist).
      4. Incubeer secties met blokkerende buffer gedurende 1 uur.
    4. Incubeer secties met primair antilichaam.
      1. Bereid een oplossing met twee primaire antilichamen de verschillende onderdelen voor CD31 (EC) en gladde spier actine (pericyten) verdund in verdunningsbuffer (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100) probe.
        OPMERKING: Hier, anti-CD31 concentratie 01:50 en anti-gladde spier actine concentratie 1: 300.
      2. Incubeer de secties overnacht bij 4 ° C met 100 gl primaire antilichamen in een vochtige bak met gedestilleerd water.
    5. Was de dia driemaal 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) gedurende 5 minuten elke wasbeurt.
    6. Incubeer secties met secundair antilichaam.
      1. Bereid een oplossing met een fluorofoor geconjugeerd geit anti-konijn secundair antilichaam aan het anti-CD31 antilichaam van konijn verdund in verdunningsbuffer herkennen.
        1. OPMERKING: De gladde spier actine primaire antilichaam is geconjugeerd met een al CY3 fluorofoor, dus geen secundair antilichaam kleuring nodig. Goat-anti konijn secundair concentratie antilichaam 1: 250.
      2. Incubeer de secties gedurende 1 uur met 100 ul secundair antilichaam in de luchtvochtigheid bak met gedestilleerd water.
    7. Was de dia's drie keer in 1x PBST gedurende 5 minuten elke wasbeurt.
    8. Monteer de dia's.
      1. Pipetteer 2-3 druppels (~ 40 - 60 pl) van antifade bevestigingsoplossing met DAPI kleuring van kernen op elke sectie.
      2. Plaats voorzichtig een nee. 1,5 dekglas via secties en montage oplossing, waardoor de vloeistof verspreid over de delen en de randen vanhet deksel slip. Voorzichtig gebruik van een vinger uit te drukken luchtbellen die over de sectie kan worden gevestigd.
      3. Laat de dia's drogen gedurende ten minste 1 uur voordat het.

    10. Kwantificeer capillaire dichtheid en structuur 14

    1. Tel het aantal capillairen in H & E gekleurde coupes, uitgedrukt als # / mm 2.
      1. Verwerven foto's van vier verschillende velden op een rechtopstaande lichtmicroscoop onder 40x vergroting.
        OPMERKING: Haarvaten geïdentificeerd als buizen gevuld met rode bloedcellen.
      2. In plaats van handmatig tellen capillairen gebruikt beeldanalyse software (bijv Wimasis Image Analysis) om verschillende parameters zoals angiogenese vaartuignummer, gemiddelde duur vaartuig en diameter, en vertakkingspunten kwantificeren.
    2. Analyseer capillaire structuur in immunofluorescentie-gekleurde coupes.
      1. Verwerven foto's van vier verschillende velden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoopmet FITC en TxRed filter kubus.
        1. Gebruik een FITC kubus afbeelding EC door excitatie bij 488 nm golflengte en gebruik een TxRed kubus afbeelding pericyten door excitatie bij 594 nm golflengte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vertegenwoordiger H & E en immunofluorescentie kleuring van matrix gel plug secties worden weergegeven in figuur 2. De artikelen van EG uitsluitend stekkers weer enkele schepen die meestal niet worden geperfuseerd met bloed (Figuur 2 linksboven, zwarte pijlen), terwijl pluggen die zowel EC en pericytes tonen verschillende geperfundeerde schepen met grotere diameters en complete pericyte dekking, zoals blijkt uit de positieve SMA kleuring direct grenzend aan CD31-positief EC. Deze resultaten suggereren dat pericyten een belangrijke rol spelen in de vorming ontluikende bloedvat dat dit dynamische proces kunnen zij herinnerd en eenvoudig in een in vivo model geanalyseerd.

Figuur 1
Figuur 1. Tissue Orientation wanneer ingebed in een Tissue Cassette. Nadat de matrix gel plug (geel) is geïsoleerd, is hetin tussen de spieren van de muis (paars) en de huid (groen) lagen. De plug wordt in het weefsel cassette zoals getoond, zodat de drie lagen kunnen worden gezien in het oppervlak eerst worden gesneden tijdens het snijden. A) Uitzicht vanaf de top van de cassette, B) Uitzicht vanaf de zijkant van de cassette. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiger van H & E (bovenste rij) en immunofluorescentie (onderste rij) van Matrix Gel. Beelden tonen het uiterlijk van EC alleen (links beelden) en EC plus gezonde pericytes (Pc) (rechts afbeeldingen). Mensen en muizen EC worden gelabeld in groen (onderste foto) en pericyten (α gladde spier actine (αSMA)) worden gelabeld in het rood (rechtsonder), en kernengebrandschilderde blauw met DAPI vlek. Schaal is 25 pm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De matrix gel plug bepaling blijkt een gemakkelijke en krachtige methode om genregulatie in angiogenese, angiogene en anti-angiogene verbindingen in vivo te evalueren en in vitro testen kunnen vullen. Hier beschrijven we in detail een nieuwe matrix gel plug assay van humane angiogenese die de interactie tussen endotheliale cellen en pericyten onderzoekt bij bloedvatvorming.

Er zijn een paar nieuwe en kritische stappen in dit protocol. Cellen in lage passage (passage 1-4) de voorkeur omdat jonge cellen tijdens de 14-daagse experimentele setting meer levensvatbaar is. Het aantal endotheelcellen gebruikt minimaal een miljoen en de verhouding van EG pericyte is 5: 1; zal echter toegenomen aantal pericyte cel de dekking te verbeteren op capillairen. Voor de experimentele groep van endotheliale cellen alleen, moet het totale aantal cellen geïnjecteerd de som van endotheliale cellen en pericyten, die 1.200.000, zijn daarvoore, het totale aantal cellen per plug consistent. Het is belangrijk om de juiste hoeveelheden aantal cellen en matrix gelvolume berekenen. De basisformule is 1,2 miljoen cellen in 200 pl matrix gel. Bovendien, vóór de injectie houden pipetpunten, spuiten, matrix gel en celpellets op ijs te allen tijde. Aangezien matrixgel viskeus en om luchtbellen vormen tijdens celsuspensie voorkomen, gesneden ongeveer 1 cm van de punt van 1 ml pipet tips om een ​​betere doorstroming. Niet mengen matrix gel met cellen tot muizen zijn klaar om te worden geïnjecteerd. Elke plug injectie moet minder dan een minuut duren. Één muis kunnen twee pluggen, aan weerszijden van de rug te dragen. Bij het verwijderen van de stekkers zorg ervoor dat de stekker ingeklemd tussen de spieren en huidlagen te houden, dan is de matrix gel stekker zal worden goed opgevangen na isolatie.

De nadelen van de matrix gel plug assay is dat het tijdrovend, kostbaar en omvat vervelend en delicate stappen zoals injectie en plug isolement. Als deze stappen zou mislukken, zouden de resultaten worden geruïneerd en het proces zou moeten worden herhaald met nieuwe muizen en materialen.

Echter, de data is reproduceerbaar en biedt flexibiliteit in termen van experimentele opzet. Zo kunnen groeifactoren of remmers worden toegediend aan de plug in verschillende stadia van vasculaire ontwikkeling, die kan worden gebruikt voor drug validatie. Bovendien opnemen van andere celtypen, zoals groei gearresteerd cellen, getransfecteerde cellijnen en tumorcellijnen, in de matrix gel plug is een andere mogelijkheid voor het manipuleren van de endotheelcel tijdens angiogenese fenotype. Ons protocol maakt gebruik van deze flexibiliteit en introduceert mensen afgeleide pericytes samen met de EC om de vorming van volledig functioneel, pericyte bedekt, hybride schepen in vivo mogelijk te maken. Ons protocol beschrijft ook hoe de histologische coupes van deze pluggen te analyseren voor kritische angiogenese eindpunten, met inbegrip van de buisaantal en de lengte van de buis, met deze twee celtypen aanwezig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS (Phosphate buffered saline) Corning 21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA Corning 25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit Sciencell 1001 includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit Sciencell 1201 includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) Peprotech 100-18B stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix BD 356237
28 G 1 cc Insluin Syringe BD 329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice The Jackson Laboratory 5557 NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile BD Biosciences 352096
PAP pen Life Technologies 8899
hemocytometer ThermoFisher Scientific 02-671-6
Nair hair removal cream Walmart
anti-human CD31 primary antibody LifeSpan Biosciences LS-B4737 working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody Sigma C6198 working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green ThermoFisher Scientific A-11008 working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution Cell Signaling 8961S
microscope slides VWR 48300-047
no. 1.5 cover slips Thermo Fisher Scientific 12-544-D
citrate buffer 10x Millipore 21545
extra fine surgical scissors Fine Science Tools 14084-08
Formalin (paraformaldehyde) Thermo Fisher Scientific 245-685
Tissue cassettes Simport M492-12
goat serum Dako X0907

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
  4. Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
  5. Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
  6. Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
  7. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
  8. Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
  9. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
  10. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
  11. Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
  12. Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
  13. Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
  14. Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).

Tags

Cellular Biology angiogenese endotheelcellen pericyten matrix gel plug,
<em>In vivo</em> studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, K., Orcholski, M. E., Huang,More

Yuan, K., Orcholski, M. E., Huang, N. F., de Jesus Perez, V. A. In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse. J. Vis. Exp. (118), e54617, doi:10.3791/54617 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter