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Biology

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Published: December 19, 2016 doi: 10.3791/54617

Summary

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

Introduction

Die Angiogenese ist der Prozess , durch den neue Blutgefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz gebildet werden 1 und steht im Mittelpunkt der laufenden Forschung in vielen Bereichen von der normalen Entwicklung von Krankheiten reichen. Dieser dynamische Prozess beinhaltet die Proliferation und Migration von endothelialen Zellen (ECs) und die Rekrutierung von Perizyten eines Gefäßrohr zu konstruieren , die in Richtung auf die Seite gerichtet ist , die zwei Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr benötigt. Zur Untersuchung dieser Prozess einen ebenso dynamischen Test erfordert, vor allem eine, die die dreidimensionale Natur der Schlauchbildung rekapitulieren kann. In - vitro - 3D - Matrix - Assays wurden entwickelt , um diesen Bedarf zu adressieren und gearbeitet haben und Forscher zu ermöglichen , die einzelnen Schritte in Raum und Zeit zu definieren , in denen die Angiogenese Platz 3 nimmt, 4, 5, 6. Allerdings sind diese in vitro 3D - Matrix - Modelle beschränkt auf das Studium nicht-durchbluteten Gefäßen eined fehlt daher kritische Komponenten relevant für die Prozess der Angiogenese (zB Wachstum zirkulierenden und hemmenden Faktoren, unnatürliche Spannung / Kräfte über das Gefäßbett) und nicht die komplexe Umwelt in lebendem Gewebe zu simulieren. Um dieser Einschränkung, mehrere in - vivo - Angiogenese - Assays wurden 7 entwickelt, einschließlich der Matrix Gelpfropfen Assay, der im Mittelpunkt unseres Berichts wird 8, 9.

Die Matrix Gelpfropfen Assay ist ein etabliertes in vivo - Angiogenese - Test, der den Forschern anspricht , wie es eine robuste Plattform bietet die Rollen von verschiedenen Zellen und Substanzen in die Angiogenese zu testen. Matrix-Gel ist ein kommerziell erhältlicher Basalmembran Lösung, die von dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom-Zelllinie sekretiert wird, die bei 37 ° C in ein gelartiges Material erstarrt. Die Matrix-Gel kann mit Zellen und / oder Substanzen, wie Wachstumsfaktoren, gemischt werden und injesubkutan in die Maus cted. Der Host-ECs wird den Stecker über 14 Tage überfallen, ein Gefäßnetz bilden und mit dem Blut des Wirts durchblutet sind. Bislang Matrix Gelpfropfen Assays ausschließlich auf die Untersuchung der endothelialen Zellverhalten während der Angiogenese konzentriert sich jedoch auf bestem Wissen ist keine Anstrengung noch aus, um festzustellen, ob dieser Assay zur Kokultur Endothelzellen und Perizyten verwendet werden können, zu untersuchen, wie sich diese beiden Zelltypen während der Angiogenese zusammenwirken. Insbesondere ist wertvoll zwischen ECs und Perizyten die Beziehung Verständnis für Krankheiten zu studieren , wo Blutgefäßverlust pathologisch, einschließlich mikrovaskulären Ischämie und periphere Gefäßerkrankungen 10, 11, 12.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Perizyten Menschen stamm an die Matrix Gelmischung zusammen mit menschlichen ECs und Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) einführt. Diese Mischung kann dann i subkutan injiziert werdenn die dorsum von SCID-Mäusen die Bildung von voll funktionsfähig, pericyte beschichtet, Hybridgefäße zu ermöglichen. Unser Protokoll beschreibt, wie Matrix Gelpfropfen, die menschliches ECs vorzubereiten entweder mit oder ohne menschliches pericytes, Platzierung in SCID-Mäuse und wie die histologischen Schnitte für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren.

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Protocol

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Stanford University School of Medicine zugelassen.

HINWEIS: Die Tiere sind unter anesthetization mit 3% Verdampfer Isofluran und 3% Zufuhr von O 2 -Gas. Die Verwendung von Tierarzt Salbe auf die Augen kann helfen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.

1. Zellpräparation

  1. Wachsen humanen Endothel- und Perizyten Zellkulturen in 100 mm-Platten mit 10 ml der geeigneten Medien. Ersetzen Sie 10 ml frisches Medium alle 2 - 3 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz.
    1. Kultur Endothelzellen (ECs) in kompletten endothelialen Zellmedien (ECM), ergänzt mit Firma geliefert 5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Penicillin / Streptomycin und 10% endothelialen Zellwachstumsergänzung.
    2. Kultur pericytes in komplette pericyte Medien (PM), ergänzt mit Unternehmen lieferte 2% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin und 10% pericyte Wachstum zu ergänzen.
    3. Bereiten Zellgemischen
      1. Berechne die erforderliche Anzahl von Zellen für die Versuchs- und Kontrollgruppen.
        HINWEIS: Jeder Stecker in der experimentellen Gruppe enthält eine Million (1 × 10 6) menschlichen ECs und zweihunderttausend (2 x 10 5) pericytes. Für die Kontrollgruppe enthält jeder Stecker 1,2 Millionen menschliche ECs nur. Die negative Kontrollgruppe hat nur Matrix-Gel. Jede Gruppe sollte mindestens vier Stecker umfassen, die zwei Mäuse erfordern würde, als Stecker können in jeder Seite eine Maus unteren Rücken injiziert werden. Drei Stecker würde als dreifacher Ausfertigung für das Experiment dienen und das vierte im Fall verwendet werden könnte, ausfällt. Bereiten Sie 25% mehr Zellen das zusätzliche Volumen des Gels entsprechen.
      2. Sammeln und Zählen Zellen aus Kulturplatten.
        1. Zum Abnehmen Zellen, entfernen Medien und waschen Sie einmal mit Raumtemperatur 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen PBS, 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, und nach 1 min. Wash-Zellen von der Platte durch 2 Hinzufügenml Medium und sammeln sich in einem 15-ml-Tube.
        2. Zählzelle einer Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
        3. Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen zu einem Pellet bei 400 xg für 5 min. Für die Versuchsgruppe, Zentrifuge sowohl ECs und Perizyten nach unten zusammen in einem Pellet.

    2. Matrix Gelzubereitung

    1. Auftauen Matrix Gel vollständig bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht eine homogene Lösung zu erhalten. Kein Mischen erforderlich.
    2. Aliquotieren Matrix Gel in 1,5-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C.
    3. Pre-Chill-sterile 1,5 ml-Röhrchen und 28 G 1 cc Insulinspritzen bei 4 ° C. Vorsicht: Halten Sie Matrix-Gel auf Eis zu allen Zeiten.
    4. Mischen Sie kalt Matrix-Gel mit bFGF bei einem Volumenverhältnis von 1: 100 (Endkonzentration von bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF Stammlösung = 50 & mgr; g / ml) Nach dem Mischen Matrix-Gel-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, Inkubation auf Eis für 30 - 60 min before Mischen mit den Zellen in Schritt 3.1.
      HINWEIS: auftauen Lager bFGF vor dem Mischen. Berechnen Sie die Anzahl der Stecker für die Injektion benötigt. Zum Beispiel erfordert jeder Stopfen 200 & mgr; l Matrix Gel. Daher 25% Extra-Gel herzustellen.

    3. Mix Matrix Gel mit Zellen

    1. Für jede Gruppe Zellpellet mit dem berechneten Volumen der Matrix-Gel mit bFGF (geeignete Zellzahl enthält). Vorsichtig mischen Schäumen zu vermeiden und in der 15-ml-Röhrchen auf Eis belassen, bis Mäuse zur Injektion hergestellt werden.

    4. Maus-Vorbereitung

    1. Anesthetize 1 SCID - Mäuse für 5 min in 3% Isofluran plus 3% O 2 in einer Induktionskammer. Konzentrieren Sie sich auf eine experimentelle Gruppe oder 2-Mäuse, zu einer Zeit.
    2. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer, auf ein nach unten Bauchseite Heizkissen und schnell eine Schnauze Düse mit der Maus Gesicht über eine nicht-Rückatmungssystem befestigen Anästhesie während des inje zu liefernction Verfahren. Schalten Sie den Gasstrom aus der Induktionskammer zu dem Nicht-Rückatmungssystem und senken den Gasdruck auf 1,5% Isofluran und 1,5% O 2.
    3. Entfernen Sie Haare aus den beiden seitlichen Hinter Regionen (etwa 1 cm Durchmesser) mit einem Rasierapparat oder Enthaarungscreme.
    4. Wischen Sie den Hautbereich mit einer 70% igen Alkohol-Pad.
    5. Bringen Sie die Maus an die Induktionskammer und wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,4 mit der zweiten Maus.

    5. Matrix-Gel-Injektion

    1. Bereiten Sie eine Maus für die Injektion von der Nichtrückatmungssystem befestigt und nach unten auf das Heizkissen Bauchseite platzieren.
    2. Legen Sie das Matrix-Gel in eine vorgekühlte 28 G 1 cc-Insulinspritze eine Maus zu einem Zeitpunkt.
      1. Laden Sie die komplette 500 & mgr; l Volumen der Matrix-Gel für zwei Stecker (200 ul pro Stecker plus 25% extra) in die Spritze.
      2. Achten Sie darauf, die Matrix-Gel in die Mäuse innerhalb von 3 Minuten des Ladens der Zellen in die Spritze zu injizieren, um die ce zu verhindernlls aus zur Seite der Spritze Absetzen und Matrix Gel zu verhindern Innenseite der Spritze verfestigt.
    3. Heben Sie die Rückenhaut subkutanen Raum zu lokalisieren, zu injizieren dann 200 & mgr; l der Matrix Gel langsam und gleichmäßig in den subkutanen Raum von der Rückseite hinteren Teil des Brustkorbs.
    4. Entfernen Sie die Injektionsnadel langsam, wobei darauf geachtet, Matrix Gel zu verhindern, dass ein Auslaufen der Injektionsstelle. Eine Beule wird bei der Injektionsstelle bilden. Wischen Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer.
    5. Wiederholen Sie die Schritte Injektion 5,2-5,5 auf der anderen Seite der Maus zurück, dann mit der Maus auf dem Rücken lässt 1 min Gelieren der Matrix-Gel auf dem Heizkissen zu ermöglichen.
    6. Skizzieren Sie die beiden Höcker einen Permanent-Marker mit der Beule nach 14 Tagen zu identifizieren. Nachdem ich einige Haare wieder wächst, wird es leichter sein, die Beule zu finden.

    6. Matrix Gelpfropfen Isolation: 14 Tage nach der Injektion

    1. Euthanize die Mäuse auf humane Weise durch das Tier ausgesetzts bis> 5 min Kohlendioxid Inhalation durch zervikale Dislokation gefolgt Tod zu gewährleisten.
    2. Entfernen Sie die Matrix Gelpfropfen auf der Rückseite der Maus.
      1. Entfernen Sie vorsichtig nachgewachsenen Haare um Injektionsstelle, wo der Stecker durch Wiederholen von Schritt 4.3 befindet. Die Markierungslinie zeigt die Größe der ursprünglichen Beule unter der Haut.
      2. Excise den Stecker zusammen mit den umgebenden Haut und Muskelschichten angebracht auf den oberen und unteren Seiten des Steckers sind.
        1. Mit feinen chirurgischen Schere, machen einen Einschnitt an der markierten Grenze des Steckers, die senkrecht zur Haut ist und geschnitten, um den Muskel unterhalb der Stecker durch. Dann sorgfältig entlang der markierten Rand um den Umfang des Stopfens geschnitten.
        2. Ziehen Sie den Stecker, halten es zwischen der Haut und Muskelschichten eingebettet ist. sofort gründlich in einem kleinen Becher mit 1x PBS überschüssiges Blut abzuwaschen. Der Stecker ist nun bereit, festgelegt werden (nächster Schritt, 6.3).
    3. Befestigen Sie die plug in 4% Paraformaldehyd.
      1. Platzieren Sie den gesamten Stecker, einschließlich der Haut und Muskelschichten, in einem 50-ml-Röhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne zu schaukeln. Am nächsten Tag übertragen Sie den Stecker in 25 ml 70% Ethanol für weitere 24 Stunden vor der Paraffineinbettung.
        HINWEIS: Die beim Umgang Paraformaldehyd mit Vorsicht. Trag Handschuhe.

    7. Paraffin Prozess der Matrix Gelpfropfen

    1. Bereiten Sie den Stecker für die Paraffineinbettung.
      1. Richten Sie den Stecker wie in 1a gezeigt; Platzieren Sie den Stecker in eine Gewebekassette, so dass die Seite des Steckers nach oben zeigt und die beiden Haut und Muskelschichten sind über die Oberfläche des Gewebeblocks sichtbar, die zuerst während des Schneidens geschnitten wird.
    2. Paraffin einbetten den Stecker nach Standardparaffineinbettung Protokolle 13.
    3. Schneiden Sie 8 - 10 & mgr; m dicke Abschnitte aus der Gewebeblock und montieren auf Mikroskop accor gleitetding Standard Paraffin sectioning Protokolle 13.
    4. Lagern Sie die Folien in einem kühlen, trockenen Ort bei Raumtemperatur, bis sie bereit für die Färbung.

    8. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin - Färbung (H & E) 13

    1. De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt.
    2. Je 100 & mgr; l H & E-Lösung auf den Abschnitt und Inkubation für 1 bis 5 min, oder bis es klare Kontrast zwischen blauen Kernen und rosa Zytoplasma in einer Zelle, wie bei 10-facher Vergrößerung unter einem aufrechten Lichtmikroskop betrachtet. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, jede H & E-Lösung das Ziel berühren.
    3. Wash H & E-Lösung von Dunking die Folie in einen großen Becher Leitungswasser, dann legen Sie die Folie in einem Rack in den Becher und bündig mit fließendem Wasser für 2 Minuten von der Folie ab.
    4. Move 9,8 Schritt die Folien zu montieren.

    9. Stain Andere Folien für Menschen Kapillaren und Perizyten

    1. De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt.
    2. Kochen Sie die Abschnitte in Antigen-Retrieval-Lösung.
      1. In einem 2-Liter-Becher, bereiten Antigen-Retrieval-Lösung unter Verwendung von 1x Citratpuffer (pH 7,0) bei 95 ° C auf einem Heizblock Sieden.
      2. Nach dem Kochen legen Sie die Folien in einem Metallgestell und unterzutauchen für 20 Minuten in die siedende Antigen-Retrieval-Lösung.
      3. Entfernen Sie vorsichtig den Becher aus dem Heizblock mit den noch unter Wasser gleitet und die Lösung zu langsam für etwa 30 min auf Raumtemperatur zurück.
      4. Legen Sie die Folien in 1x PBS bis zum nächsten Schritt.
    3. Blockieren Sie die Abschnitte in Blockierungspuffer (1x PBS, 5% Ziegenserum, 00,3% Triton X-100).
      1. Zeichnen Sie einen hydrophoben Kreis um die Ränder eines jeden Abschnitts mit einem PAP Stift.
      2. Legen Sie die Folien in einer Luftfeuchtigkeit Schale mit destilliertem Wasser auf dem Boden des Fachs.
      3. Je 100 & mgr; l Blockierungspuffer auf die Abschnitte dafür, dass das gesamte Gewebe von Flüssigkeit bedeckt ist (kann mehr als 100 & mgr; l erfordern).
      4. Inkubieren Abschnitte mit Puffer für 1 h blockiert.
    4. Inkubieren Abschnitte mit dem primären Antikörper.
      1. Vorbereitung einer Lösung mit zwei primären Antikörpern jeden Abschnitt Sonde für CD31 (ECs) und smooth muscle actin (Perizyten) verdünnt in Verdünnungspuffer (1 × PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
        HINWEIS: Hier, anti-CD31-Konzentration ist 01.50 und anti-Glattmuskelaktin Konzentration ist 1: 300.
      2. Inkubieren der Abschnitte über Nacht bei 4 ° C mit 100 & mgr; l primärer Antikörper in einer Feuchtigkeitsfach destilliertes Wasser enthält.
    5. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) für jeweils 5 min waschen.
    6. Inkubieren Abschnitte mit sekundären Antikörper.
      1. Vorbereitung einer Lösung mit einem Fluorophor konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper der Anti-CD31-Kaninchen-Antikörper in Verdünnungspuffer verdünnt, zu erkennen.
        1. HINWEIS: Die Glattmuskelaktin primären Antikörper bereits mit einem Cy3 Fluorophor konjugiert ist, so ist keine sekundäre Antikörper-Färbung benötigt. Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperkonzentration beträgt 1: 250.
      2. Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h mit 100 ul sekundären Antikörper in der Feuchtigkeit Fach destilliertes Wasser enthält.
    7. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST für jeweils 5 min waschen.
    8. Montieren Sie die Dias.
      1. Pipette 2 - 3 Tropfen (~ 40 - 60 & mgr; l) von Antifade Montagelösung mit DAPI Kernfärbung auf jedem Abschnitt.
      2. Sanft legen Sie eine Nr. 1.5 Deckglas über die Abschnitte und Montagelösung, so dass die Flüssigkeit über die Abschnitte, um sich auszubreiten und zu den Ränderndas Deckglas. Verwenden Sie vorsichtig mit einem Finger zu drücken aus Luftblasen, die über den Abschnitt befinden können.
      3. Lassen Sie die Folien für mindestens 1 Stunde trocknen, bevor Handhabung.

    10. Quantify Kapillar - Dichte und Struktur 14

    1. Zähle die Anzahl der Kapillaren in H & E gefärbte Schnitte, ausgedrückt als # / mm 2.
      1. Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern an einem aufrechten Lichtmikroskop unter 40-facher Vergrößerung.
        HINWEIS: Die Kapillaren als Rohre mit roten Blutkörperchen gefüllt identifiziert.
      2. Alternativ kann anstelle der manuellen Zählen Kapillaren verwenden Bildanalysesoftware (zB Wimasis Image Analysis) verschiedene Angiogenese Parameter wie Gefäßzahl, mittlere Fahrzeuglänge und Durchmesser und Verzweigungspunkte zu quantifizieren.
    2. Analysieren kapillare Struktur in Immunofluoreszenz-gefärbten Schnitten.
      1. Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskopmit FITC und TxRed Filterwürfel.
        1. Verwenden Sie ein FITC Würfel Bild ECs durch Anregung bei 488 nm Wellenlänge und mit einem TxRed Würfel Bild pericytes durch Anregung bei 594 nm Wellenlänge.

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Representative Results

Repräsentative H & E und Immunfluoreszenzanfärbung von Matrix Gelpfropfen Abschnitte sind in Abbildung 2 Abschnitte von EG nur Stecker einige Schiffe angezeigt werden gezeigt, die meist nicht durchblutet (Abbildung 2 oben links, schwarze Pfeile) , während Stecker , die sowohl ECs und Perizyten Anzeige mehrere perfundierter Schiffe mit größerem Durchmesser und vollständige pericyte Abdeckung, wie durch positive SMA Färbung unmittelbar angrenzend an CD31-positive ECs belegt. Diese Ergebnisse legen nahe , dass pericytes eine wesentliche Rolle spielen in im Entstehen begriffenen Blutgefäßbildung und dass dieser dynamische Prozess kann rekapituliert und leicht in einem in - vivo - Modell analysiert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Gewebe Ausrichtung Wenn die Kassette in einem Gewebe eingebettet. Nachdem die Matrix Gelpfropfen (gelb) isoliert ist, istzwischen den Muskel-Maus (lila) und die Haut (grün) Schichten. Der Stopfen wird in der Gewebekassette angeordnet, wie gezeigt, so daß alle drei Schichten über die Oberfläche zu sehen ist, die zuerst geschnitten werden während des Schneidens. A) Blick von der Spitze der Kassette, B) Blick von der Seite der Kassette. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative H & E (obere Reihe) und Immunfluoreszenz (untere Reihe) von Matrix - Gel. Bilder zeigen das Aussehen von ECs allein (linkes Bild) und ECs und gesund pericytes (PC) (rechte Bilder). Humanen und murinen ECs sind grün (unten Bilder) markiert und Perizyten (α Glattmuskelaktin (αSMA)) sind in rot (unten rechts) markiert und Kerneblau gefärbt mit DAPI-Färbung. Maßstab ist 25 um. Diese Zahl wurde 8 aus einer früheren Veröffentlichung geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Matrix Gelpfropfen Assay hat eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Bewertung der Genregulation in Angiogenese, angiogene und antiangiogene Verbindungen in vivo erwiesen, und in vitro - Tests zu ergänzen. Hier beschreiben wir im Detail eine neuartige Matrix Gelpfropfen Test der menschlichen Angiogenese, die die Interaktion zwischen Endothelzellen und Perizyten während Gefäßbildung untersucht.

Es gibt einige neuartige und wichtige Schritte in diesem Protokoll. Die Zellen in niedrigen Passage (Passage 1 - 4) sind zu bevorzugen, weil die jungen Zellen während der 14-tägigen Versuchs Einstellung mehr rentabel sein wird. Die Anzahl der Endothelzellen verwendet, ist mindestens einer Million und das Verhältnis von EC zu pericyte 5: 1; jedoch wird erhöht pericyte Zellzahl seiner Berichterstattung über Kapillaren erhöhen. Für die experimentelle Gruppe von Endothelzellen allein injiziert die Gesamtzahl der Zellen sollte die Summe von Endothelzellen und Perizyten sein, die 1,2 Millionen ist, dafüre, die Gesamtzellzahl pro Stecker konsistent ist. Es ist wichtig, die geeignete Mengen an Zellzahlen und Matrix Gelvolumen zu berechnen. Die Grundformel beträgt 1,2 Millionen Zellen in 200 & mgr; l Matrix Gels. Darüber hinaus vor der Injektion zu halten Pipettenspitzen, Spritzen, matrix-Gel, und die Zellpellets auf Eis zu allen Zeiten. Da Matrix-Gel ist zähflüssig und um Luftblasen bilden, während der Zellsuspension, schneiden etwa 1 cm aus der Spitze von 1 ml Pipettenspitzen zu vermeiden, für eine bessere Strömung zu ermöglichen. Mix-Matrix-Gel nicht mit Zellen bis Mäuse bereit sind, injiziert werden. Jedes Plug-Injektion sollte weniger als eine Minute. Eine Maus kann zwei Stecker tragen, eine auf jeder Seite des Rückens. Beim Extrahieren der Stecker sicher, den Stecker zwischen den Muskel und Haut-Schichten angeordnet zu halten, dann wird die Matrix Gelpfropfen gut nach der Isolierung gesammelt werden.

Die Nachteile der Matrix Gelpfropfen Assay sind, dass es zeitaufwendig, kostspielig und erfordert langwierige und heikle Schritte wie INJECtion und Stecker Isolation. Wenn diese Schritte ausfallen, würden die Ergebnisse ruiniert und würde der Prozess muss wieder mit neuen Mäusen und Materialien wiederholt werden.

Jedoch ist die Daten reproduzierbar und bietet Flexibilität bei der Versuchsplanung. Zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren konnten mit dem Stecker in verschiedenen Stadien der vaskulären Entwicklung verabreicht werden, die für die Arzneimittel Validierung verwendet werden kann. Weiterhin Inkorporation von anderen Zelltypen, wie beispielsweise wachstums arretierten Zellen, transfizierten Zellinien oder Tumorzelllinien, in die Matrix Gelpfropfen ist eine weitere Möglichkeit, die endothelialen Zell-Phänotyp während der Angiogenese für die Manipulation. Unser Protokoll nutzt diese Flexibilität und führt Menschen stamm pericytes zusammen mit ECs Bildung zu ermöglichen voll funktionsfähiger, pericyte bedeckt, Hybridgefäße in vivo. Unser Protokoll beschreibt auch, wie die histologischen Schnitten von diesen Stecker für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren, einschließlich RohrAnzahl und Rohrlänge, mit diesen beiden Zelltypen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS (Phosphate buffered saline) Corning 21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA Corning 25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit Sciencell 1001 includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit Sciencell 1201 includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) Peprotech 100-18B stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix BD 356237
28 G 1 cc Insluin Syringe BD 329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice The Jackson Laboratory 5557 NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile BD Biosciences 352096
PAP pen Life Technologies 8899
hemocytometer ThermoFisher Scientific 02-671-6
Nair hair removal cream Walmart
anti-human CD31 primary antibody LifeSpan Biosciences LS-B4737 working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody Sigma C6198 working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green ThermoFisher Scientific A-11008 working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution Cell Signaling 8961S
microscope slides VWR 48300-047
no. 1.5 cover slips Thermo Fisher Scientific 12-544-D
citrate buffer 10x Millipore 21545
extra fine surgical scissors Fine Science Tools 14084-08
Formalin (paraformaldehyde) Thermo Fisher Scientific 245-685
Tissue cassettes Simport M492-12
goat serum Dako X0907

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References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
  4. Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
  5. Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
  6. Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
  7. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
  8. Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
  9. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
  10. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
  11. Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
  12. Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
  13. Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
  14. Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).

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Yuan, K., Orcholski, M. E., Huang,More

Yuan, K., Orcholski, M. E., Huang, N. F., de Jesus Perez, V. A. In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse. J. Vis. Exp. (118), e54617, doi:10.3791/54617 (2016).

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