Summary
हम मैट्रिक्स जेल प्लग angiogenesis परख के विभिन्नता का उपयोग कर माउस में मानव endothelial-pericyte बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Introduction
एंजियोजिनेसिस प्रक्रिया है जिसके द्वारा नए रक्त वाहिकाओं कई सामान्य विकास से बीमारी को लेकर क्षेत्रों में एक पूर्व मौजूदा संवहनी नेटवर्क 1 से बनते हैं और चल रहे अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है। इस गतिशील प्रक्रिया प्रसार और endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) और pericytes एक नाड़ी ट्यूब कि साइट है कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की डिलिवरी 2 की जरूरत की ओर निर्देशित है का निर्माण करने की भर्ती के पलायन शामिल है। अध्ययन करने के लिए इस प्रक्रिया को एक समान रूप से गतिशील परख, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि एक ट्यूब गठन के तीन आयामी प्रकृति पुनरावृत्ति कर सकते हैं की आवश्यकता है। इन विट्रो में 3 डी मैट्रिक्स assays इस जरूरत को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है और अच्छी तरह से काम किया है शोधकर्ताओं स्थान और समय में असतत चरणों में जो angiogenesis 3 जगह, 4, 5, 6 लेता है परिभाषित करने के लिए अनुमति देने के लिए। हालांकि, इन विट्रो में 3 डी मैट्रिक्स मॉडल गैर-भरकर रखा वाहिकाओं एक अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैंडी इसलिए angiogenesis प्रक्रिया के लिए प्रासंगिक महत्वपूर्ण घटक की कमी है (जैसे, संवहनी बिस्तर भर में विकास और निरोधात्मक कारकों, अप्राकृतिक तनाव / बलों घूम) और असफल रहते ऊतक में मौजूद जटिल माहौल अनुकरण। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, कई विवो angiogenesis assays विकसित किया गया है 7, मैट्रिक्स जेल प्लग परख जो हमारी रिपोर्ट 8, 9 का ध्यान केंद्रित किया जाएगा शामिल है।
मैट्रिक्स जेल प्लग परख एक अच्छी तरह से स्थापित इन विवो angiogenesis परख है कि शोधकर्ताओं के लिए अपील के रूप में यह angiogenesis में अलग कक्षों और पदार्थों की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है। मैट्रिक्स जेल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली समाधान है कि Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा सेल लाइन है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जेल की तरह सामग्री में solidifies द्वारा स्रावित होता है। मैट्रिक्स जेल में इस तरह वृद्धि कारक है, और Inje के रूप में कोशिकाओं और / या पदार्थ, के साथ मिलाया जा सकता हैमाउस में subcutaneously cted। मेजबान ईसीएस 14 दिनों में प्लग आक्रमण करेंगे, एक संवहनी नेटवर्क के रूप में, और मेजबान के खून से भरकर रखा हो जाते हैं। तिथि करने के लिए, मैट्रिक्स जेल प्लग assays के लिए विशेष रूप से angiogenesis के दौरान endothelial सेल व्यवहार के अध्ययन पर, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा कोई प्रयास अभी तक बना दिया गया है निर्धारित करने के लिए इस परख करने के लिए सह-संस्कृति endothelial कोशिकाओं और pericytes इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या ध्यान केंद्रित किया है हालांकि, कैसे इन दो प्रकार की कोशिकाओं angiogenesis के दौरान बातचीत का अध्ययन। विशेष रूप से, ईसीएस और pericytes के बीच के रिश्ते को समझने के रोगों जहां रक्त वाहिका नुकसान वैकृत है, microvascular ischemia और परिधीय रोग 10, 11, 12 सहित अध्ययन के लिए मूल्यवान है।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि मानव ईसीएस और fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) के साथ मैट्रिक्स जेल मिश्रण करने के लिए मानव व्युत्पन्न pericytes परिचय का वर्णन है। इस मिश्रण को तो subcutaneously मैं इंजेक्शन जा सकता हैn SCID चूहों की पीठ पूरी तरह कार्यात्मक, pericyte लेपित, संकर वाहिकाओं के गठन की अनुमति है। हमारी प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मैट्रिक्स जेल के साथ या मानव pericytes, एस.सी.आई.डी चूहों और कैसे महत्वपूर्ण angiogenesis समापन के लिए histological वर्गों का विश्लेषण करने में प्लेसमेंट के बिना मानव ईसीएस युक्त प्लग तैयार करने के लिए।
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Protocol
आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
नोट: पशु 3% vaporizer isoflurane और ओ 2 गैस के 3% की आपूर्ति के साथ anesthetization तहत कर रहे हैं। आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करते हैं जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने में मदद कर सकता है।
1. सेल तैयार
- उचित मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ 100 मिमी प्लेट में मानव endothelial और pericyte सेल संस्कृतियों के लिए आगे बढ़ें। ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर बदलें हर 2 - 3 दिनों कोशिकाओं तक 80% confluency तक पहुँचने।
- संस्कृति endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) पूरा endothelial सेल मीडिया (ईसीएम) कंपनी के साथ पूरक में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% endothelial सेल के विकास के पूरक की आपूर्ति की।
- पूरा pericyte मीडिया (प्रधानमंत्री) कंपनी के साथ पूरक में संस्कृति pericytes 2% FBS, 10% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% pericyte विकास के पूरक की आपूर्ति की।
- सेल मिश्रण तैयार करें
- प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के लिए सेल के लिए आवश्यक संख्या की गणना।
नोट: प्रयोगात्मक समूह में प्रत्येक एक लाख प्लग (1 x 10 6) मानव ईसीएस और दो लाख (2 x 10 5) pericytes शामिल हैं। नियंत्रण समूह के लिए, प्रत्येक प्लग 12 लाख मानव ईसीएस ही होता है। नकारात्मक नियंत्रण समूह मैट्रिक्स जेल ही है। प्रत्येक समूह के कम से कम चार प्लग, जो दो चूहों की आवश्यकता होगी के रूप में प्लग एक माउस की पीठ के निचले हिस्से के प्रत्येक पक्ष में इंजेक्ट किया जा सकता शामिल करना चाहिए। तीन प्लग प्रयोग के लिए तीन प्रतियों के रूप में काम करेगा और चौथे मामले एक विफल रहता है में इस्तेमाल किया जा सकता है। जेल की अतिरिक्त मात्रा मैच के लिए 25% अतिरिक्त कोशिकाओं को तैयार। - लीजिए और संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं की गिनती।
- कोशिकाओं को अलग करने के लिए, मीडिया को हटाने और कमरे के तापमान 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धो लें। पीबीएस निकालें, 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin / 2.21 मिमी EDTA जोड़ने के लिए, और 1 मिनट के लिए सेते हैं। थाली से दूर 2 जोड़कर कोशिकाओं को धो लेंमिलीलीटर मध्यम और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या।
- 5 मिनट के लिए 400 XG पर एक गोली में कक्षों की उपयुक्त संख्या अपकेंद्रित्र। प्रयोगात्मक समूह, सेंट्रीफ्यूज दोनों ईसीएस और नीचे एक साथ एक गोली में pericytes के लिए।
- प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के लिए सेल के लिए आवश्यक संख्या की गणना।
2. मैट्रिक्स जेल तैयारी
- 4 घंटा या एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स जेल पूरी तरह से बाहर गला लें। कोई मिश्रण की आवश्यकता है।
- 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में अशेष मैट्रिक्स जेल और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- पूर्व ठंड बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और 28 जी 1 से 4 डिग्री सेल्सियस पर सीसी इंसुलिन सीरिंज। सावधानी: हर समय बर्फ पर मैट्रिक्स जेल रखें।
- 1 के एक मात्रा के अनुपात में bFGF के साथ ठंड मैट्रिक्स जेल मिक्स: 100 (bFGF के अंतिम एकाग्रता = 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल, bFGF शेयर समाधान = 50 माइक्रोग्राम / एमएल) कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मैट्रिक्स जेल समाधान मिश्रण के बाद, बर्फ पर सेते के लिए 30 - 60 मिनट खefore 3.1 कदम में कोशिकाओं के साथ मिश्रण।
नोट: मिश्रण से पहले शेयर bFGF गला लें। इंजेक्शन के लिए आवश्यक प्लग की संख्या की गणना। उदाहरण के लिए, प्रत्येक प्लग 200 μl मैट्रिक्स जेल की आवश्यकता है। इसलिए, 25% अतिरिक्त जेल तैयार करते हैं।
कोशिकाओं के साथ 3. मिक्स मैट्रिक्स जेल
- प्रत्येक समूह के लिए, सेल गोली मैट्रिक्स bFGF युक्त जेल की गणना की मात्रा के साथ (उचित सेल नंबर युक्त) resuspend। धीरे मिक्स झाग से बचने और जब तक चूहों इंजेक्शन के लिए तैयार कर रहे हैं बर्फ पर 15 मिलीलीटर ट्यूब में छोड़ने के लिए।
4. माउस तैयारी
- एक प्रेरण कक्ष में 3% Isoflurane में 5 मिनट से अधिक 3% ओ 2 के लिए 1 SCID चूहों anesthetize। एक प्रयोगात्मक समूह, या 2 चूहों पर ध्यान दें, एक समय में।
- नीचे एक हीटिंग पैड उदर पक्ष पर प्रेरण कक्ष से माउस निकालें, जगह और जल्दी से एक गैर rebreathing प्रणाली Inje भर संज्ञाहरण की आपूर्ति करने के माध्यम से माउस के चेहरे पर एक थूथन नोक देते हैंction प्रक्रिया। गैर rebreathing व्यवस्था करने के लिए प्रेरण कक्ष से गैस का प्रवाह स्विच और 1.5% isoflurane और 1.5% ओ 2 के लिए गैस के दबाव को कम।
- एक शेवर या बालों को हटाने क्रीम के साथ दोनों पार्श्व हिंद क्षेत्रों (लगभग 1 सेमी व्यास) से बाल निकालें।
- एक 70% शराब पैड के साथ त्वचा क्षेत्र साफ कर लें।
- दूसरी माउस के साथ 4.4 - प्रेरण कक्ष करने के लिए माउस लौटें और दोहराने 4.2 कदम।
5. मैट्रिक्स जेल इंजेक्शन
- गैर rebreathing व्यवस्था करने के लिए संलग्न और नीचे हीटिंग पैड उदर पक्ष पर रखकर इंजेक्शन के लिए एक माउस तैयार करें।
- एक पूर्व ठंडा 28 जी 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज एक समय में एक माउस में मैट्रिक्स जेल लोड।
- दो प्लग (प्लग प्रति 200 μl प्लस 25% अतिरिक्त) सिरिंज में लिए मैट्रिक्स जेल की पूरी 500 μl मात्रा लोड।
- बनाओ सिरिंज में कोशिकाओं लोड सीई को रोकने के लिए 3 मिनट के भीतर चूहों में मैट्रिक्स जेल इंजेक्षन करने के लिए सुनिश्चित करेंसिरिंज के किनारे बसने और सिरिंज के अंदर solidifying से मैट्रिक्स जेल से रोकने के लिए lls।
- चमड़े के नीचे अंतरिक्ष का पता लगाने के लिए, तो रिब पिंजरे के पीछे पीछे के चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में धीरे-धीरे और समान रूप से मैट्रिक्स जेल के 200 μl इंजेक्षन वापस त्वचा लिफ्ट।
- इंजेक्शन सुई धीरे धीरे निकालें, इंजेक्शन स्थल के बाहर लीक से मैट्रिक्स जेल को रोकने के लिए सावधान किया जा रहा। एक टक्कर इंजेक्शन के स्थल पर बनेगी। एक शराब पैड के साथ इंजेक्शन साइट को साफ कर लें।
- दोहराएँ इंजेक्शन 5.2 कदम - 5.5 माउस की पीठ के दूसरे पक्ष पर है, तो अपनी पीठ पर माउस छोड़ने के 1 मिनट गर्मी पैड पर मैट्रिक्स जेल का जमाना अनुमति देने के लिए।
- एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर 14 दिनों के बाद टक्कर की पहचान करने के लिए दोनों धक्कों को रेखांकित करें। बाद में कुछ बाल वापस बढ़ता है, यह टक्कर लगाने के लिए आसान हो जाएगा।
6. मैट्रिक्स जेल प्लग अलगाव: इंजेक्शन के बाद 14 दिन
- पशु उजागर करके नम्रता से चूहों euthanizes> 5 कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद मौत को आश्वस्त करने के मिनट के लिए।
- माउस के पीछे से मैट्रिक्स जेल प्लग निकालें।
- धीरे इंजेक्शन साइट है जहाँ प्लग 4.3 चरण दोहरा द्वारा चारों ओर स्थित है regrown बालों को हटा दें। मार्कर लाइन त्वचा के नीचे मूल टक्कर के आकार को इंगित करता है।
- त्वचा और मांसपेशियों की परतों में क्रमश: प्लग के ऊपर और नीचे के हिस्से पर संलग्न आसपास के साथ-साथ प्लग आबकारी।
- ठीक शल्य कैंची का प्रयोग, प्लग त्वचा को सीधा है कि के रूप में चिह्नित की सीमा पर एक चीरा बनाने और प्लग के नीचे मांसपेशियों के माध्यम से कटौती। फिर, ध्यान से चिह्नित सीमा पर प्लग की परिधि के आसपास काट दिया।
- प्लग निकालें, यह त्वचा और मांसपेशियों की परतों के बीच sandwiched रखे हुए हैं। इसके तत्काल बाद 1x पीबीएस के साथ एक छोटे से बीकर में कुल्ला अतिरिक्त रक्त दूर धोने के लिए। प्लग (अगला कदम है, 6.3) अब तय होने के लिए तैयार है।
- Plu फिक्स4% paraformaldehyde में जी।
- कमाल के बिना कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के 25 मिलीलीटर के साथ त्वचा और मांसपेशियों की परतों सहित पूरे प्लग, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। अगले दिन, आयल embedding से पहले एक और 24 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के 25 मिलीलीटर में प्लग हस्तांतरण।
नोट: सावधानी के साथ paraformaldehyde संभाल लेना। दस्ताने पहनें।
- कमाल के बिना कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के 25 मिलीलीटर के साथ त्वचा और मांसपेशियों की परतों सहित पूरे प्लग, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। अगले दिन, आयल embedding से पहले एक और 24 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के 25 मिलीलीटर में प्लग हस्तांतरण।
7. आयल प्रक्रिया मैट्रिक्स जेल प्लग
- आयल embedding के लिए प्लग तैयार करें।
- के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया प्लग ओरिएंट; एक ऊतक कैसेट में प्लग इतनी जगह है कि प्लग की ओर का सामना करना पड़ रहा है और दोनों त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों परतों ब्लॉक की सतह कि सेक्शनिंग के दौरान पहली कटौती की जाएगी भर में दिखाई दे रहे हैं।
- पैराफिन मानक आयल embedding प्रोटोकॉल 13 के अनुसार प्लग एम्बेड।
- ऊतक ब्लॉक के बंद 10 माइक्रोन मोटी वर्गों और माउंट पर माइक्रोस्कोप एक्कोर स्लाइड - 8 कटडिंग मानक आयल सेक्शनिंग प्रोटोकॉल से 13।
- धुंधला के लिए तैयार है जब तक कमरे के तापमान पर एक शांत सूखी जगह में स्लाइड स्टोर।
8. hematoxylin और eosin दाग (एच एंड ई) के साथ दाग धारा 13
- दो बार 100% xylene के माध्यम से स्लाइड गुजर द्वारा डी-paraffinize ऊतक वर्गों, 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और अंत में 1x पीबीएस, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक। अगले चरण तक 1x पीबीएस में स्लाइड्स छोड़ दें।
- खंड पर पिपेट 100 μl एच ई समाधान और सेते हैं 1 - 5 मिनट, या जब तक वहाँ एक सेल 10X बढ़ाई पर एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा के रूप में नीले और गुलाबी नाभिक कोशिका द्रव्य के बीच स्पष्ट विपरीत है। किसी भी एच ई समाधान उद्देश्य को छूने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- धो एच ई समाधान नल के पानी की एक बड़ी बीकर में स्लाइड dunking से स्लाइड के बंद, फिर बीकर में एक रैक में स्लाइड जगह और 2 मिनट के लिए पानी चल रहा है के साथ फ्लश।
- मोकदम के लिए 9.8 स्लाइड माउंट करने के लिए किया है।
मानव केशिकाओं और pericytes के लिए 9. दाग अन्य स्लाइड्स
- दो बार 100% xylene के माध्यम से स्लाइड गुजर द्वारा डी-paraffinize ऊतक वर्गों, 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल और अंत में 1x पीबीएस, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक। अगले चरण तक 1x पीबीएस में स्लाइड्स छोड़ दें।
- प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में वर्गों उबाल लें।
- एक 2 एल बीकर में, पुनः प्राप्ति समाधान 1x साइट्रेट बफर का उपयोग (7.0 पीएच) उबलते प्रतिजन 95 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर तैयार करते हैं।
- एक बार जब उबलते, एक धातु रैक में स्लाइड्स जगह है और 20 मिनट के लिए उबलते प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में डूब।
- ध्यान से स्लाइड अभी भी जलमग्न साथ हीटिंग ब्लॉक से बीकर निकालें और समाधान धीरे बारे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लौटने के लिए अनुमति देते हैं।
- 1x पीबीएस में स्लाइड्स अगले चरण तक रखें।
- अवरुद्ध बफर में वर्गों (1x पीबीएस, 5% बकरी सीरम, 0 ब्लॉक.3% ट्राइटन X-100)।
- एक पैप कलम के साथ प्रत्येक अनुभाग के किनारों के आसपास एक हाइड्रोफोबिक चक्र ड्रा।
- ट्रे के तल पर आसुत जल के साथ एक नमी ट्रे में स्लाइड रखें।
- यकीन है कि ऊतक के सभी वर्गों पर पिपेट 100 μl अवरुद्ध बफर तरल पदार्थ से कवर किया जाता है (100 से अधिक μl आवश्यकता हो सकती है)।
- 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध साथ वर्गों सेते हैं।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं।
- CD31 (ईसीएस) और चिकनी पेशी actin (pericytes) कमजोर पड़ने बफर में पतला के लिए प्रत्येक अनुभाग (1x पीबीएस, 1% बीएसए, 0.3% ट्राइटन X-100) की जांच के लिए दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक समाधान तैयार है।
नोट: यहाँ, विरोधी CD31 एकाग्रता 1:50 है और विरोधी चिकनी पेशी actin एकाग्रता 1: 300। - आसुत जल से युक्त एक नमी ट्रे में 100 μl प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर वर्गों सेते हैं।
- CD31 (ईसीएस) और चिकनी पेशी actin (pericytes) कमजोर पड़ने बफर में पतला के लिए प्रत्येक अनुभाग (1x पीबीएस, 1% बीएसए, 0.3% ट्राइटन X-100) की जांच के लिए दो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक समाधान तैयार है।
- 1x PBST (1x पीबीएस + 0.1% TWE में स्लाइड्स तीन बार धोएंen20) 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए।
- माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं।
- विरोधी CD31 खरगोश एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में पतला पहचान करने के लिए एक fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक समाधान तैयार है।
- नोट: चिकनी पेशी actin प्राथमिक एंटीबॉडी पहले से ही एक CY3 fluorophore साथ संयुग्मित है, तो कोई माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला की जरूरत है। 250: बकरी-विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता 1 है।
- आर्द्रता आसुत जल से युक्त ट्रे में 100 μl माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए वर्गों को सेते हैं।
- विरोधी CD31 खरगोश एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में पतला पहचान करने के लिए एक fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक समाधान तैयार है।
- स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए 1x PBST में तीन बार धोएं।
- स्लाइड माउंट।
- पिपेट 2 - प्रत्येक खंड पर DAPI परमाणु धुंधला के साथ antifade बढ़ते समाधान की - (60 μl ~ 40) 3 बूँदें।
- धीरे से एक कोई जगह नहीं है। वर्गों और बढ़ते समाधान, द्रव वर्गों पर बाहर फैल करने की इजाजत दी पर और के किनारों को 1.5 कवर पर्चीकवर पर्ची। धीरे हवा के बुलबुले कि खंड पर स्थित हो सकता है बाहर प्रेस करने के लिए एक उंगली का उपयोग करें।
- स्लाइड को संभालने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए सूखी हैं।
10 यों केशिका घनत्व और संरचना 14
- एच एंड ई दाग वर्गों में केशिकाओं की संख्या की गणना, # / 2 मिमी के रूप में व्यक्त किया।
- 40x बढ़ाई के तहत एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप पर चार विभिन्न क्षेत्रों की तस्वीरें मोल।
नोट: केशिकाओं लाल रक्त कोशिकाओं के साथ भरा ट्यूबों के रूप में पहचाने जाते हैं। - वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल गिनती केशिकाओं के बजाय, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, Wimasis छवि विश्लेषण) का उपयोग इस तरह के पोत संख्या, औसत पोत की लंबाई और व्यास, और शाखा अंक के रूप में विभिन्न मापदंडों के angiogenesis यों की।
- 40x बढ़ाई के तहत एक ईमानदार प्रकाश माइक्रोस्कोप पर चार विभिन्न क्षेत्रों की तस्वीरें मोल।
- immunofluorescent दाग वर्गों में केशिका संरचना का विश्लेषण।
- एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर चार विभिन्न क्षेत्रों की तस्वीरें मोलFITC और TxRed फिल्टर क्यूब के साथ।
- 488 एनएम तरंगदैर्ध्य पर उत्तेजना द्वारा छवि ईसीएस के लिए एक FITC घन का प्रयोग करें और 594 एनएम तरंगदैर्ध्य पर उत्तेजना द्वारा छवि pericytes के लिए एक TxRed घन का उपयोग करें।
- एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर चार विभिन्न क्षेत्रों की तस्वीरें मोलFITC और TxRed फिल्टर क्यूब के साथ।
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Representative Results
प्रतिनिधि एच ई और immunofluorescent मैट्रिक्स जेल प्लग वर्गों का धुंधला चुनाव आयोग से चित्रा में दिखाया जाता है 2. धारा केवल प्लग कुछ वाहिकाओं है कि ज्यादातर रक्त (चित्रा 2 ऊपर छोड़ दिया, काला तीर) युक्त प्लग जबकि साथ perfused नहीं कर रहे हैं दोनों ईसीएस और pericytes कई भरकर रखा प्रदर्शन प्रदर्शन बड़े व्यास और पूरा pericyte कवरेज, के रूप में सकारात्मक एसएमए धुंधला तुरंत CD31 पॉजिटिव ईसीएस से सटे इसका सबूत के साथ जहाजों। इन परिणामों का सुझाव है कि pericytes नवजात रक्त वाहिनियों के गठन में और इस गतिशील प्रक्रिया recapitulated किया जा सकता है और आसानी से एक में vivo मॉडल में विश्लेषण किया है कि एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
चित्रा 1. ऊतक अभिविन्यास जब एक ऊतक कैसेट में एंबेडेड। बाद मैट्रिक्स जेल प्लग (पीला) अलग है, यह हैमाउस की मांसपेशियों (बैंगनी) और त्वचा (हरा) परतों के बीच में। प्लग ऊतक कैसेट में रखा रूप में दिखाया गया है, ताकि सभी तीन परतों सतह कि सेक्शनिंग के दौरान पहली कटौती की जाएगी भर में देखा जा सकता है। ए) कैसेट की ओर से कैसेट, बी) दृश्य के ऊपर से देखने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. प्रतिनिधि एच ई (शीर्ष पंक्ति) और मैट्रिक्स जेल के immunofluorescence (नीचे पंक्ति)। छवियाँ अकेले ईसीएस की उपस्थिति (बाएं चित्र) और ईसी के साथ साथ स्वस्थ pericytes (पीसी) (सही चित्र) दिखा। मानव और murine ईसीएस हरे (नीचे चित्र) में चिह्नित कर रहे हैं और pericytes (α चिकनी पेशी actin (αSMA)) लाल (नीचे सही) में चिह्नित कर रहे हैं, और नाभिक हैंदाग DAPI दाग के साथ नीले रंग की। स्केल 25 माइक्रोन है। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन 8 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मैट्रिक्स जेल प्लग परख angiogenesis, विवो में एन्जियोजेनिक और antiangiogenic यौगिकों में जीन विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए, और इन विट्रो परीक्षण के पूरक के लिए एक सुविधाजनक और शक्तिशाली विधि साबित हो गया है। यहाँ, हम मानव angiogenesis के एक उपन्यास मैट्रिक्स जेल प्लग परख है कि पोत गठन के दौरान endothelial कोशिकाओं और pericytes के बीच बातचीत की जांच में विस्तार से वर्णन है।
इस प्रोटोकॉल में कुछ उपन्यास और महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। कम बीतने (1 बीतने - 4) में कोशिकाओं को बेहतर कर रहे हैं क्योंकि युवा कोशिकाओं को 14 दिन की प्रयोगात्मक सेटिंग के दौरान और अधिक व्यावहारिक होगा। endothelial इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या कम से कम एक लाख है और pericyte करने के लिए चुनाव आयोग के अनुपात 5: 1; हालांकि, वृद्धि हुई pericyte सेल नंबर केशिकाओं पर अपने कवरेज में वृद्धि होगी। अकेले endothelial कोशिकाओं की प्रयोगात्मक समूह के लिए, इंजेक्शन कोशिकाओं की कुल संख्या endothelial कोशिकाओं और pericytes का योग है, जो 12 लाख है, की वजह से किया जाना चाहिएई, प्लग प्रति कुल सेल नंबर अनुरूप है। यह सेल नंबर और मैट्रिक्स जेल मात्रा की उचित मात्रा की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है। मूल सूत्र मैट्रिक्स जेल के 200 μl में 1.2 मिलियन कोशिकाओं है। इसके अलावा, इंजेक्शन से पहले, pipet सुझावों, सीरिंज, मैट्रिक्स जेल, और सेल छर्रों बर्फ पर हर समय रहते हैं। चूंकि मैट्रिक्स जेल चिपचिपा और व्यवस्था, सेल निलंबन के दौरान गठन हवा के बुलबुले से बचने के लिए 1 मिलीलीटर pipet सुझावों की नोक के बंद के बारे में 1 सेमी कटौती बेहतर प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए है। कोशिकाओं के साथ मैट्रिक्स जेल मिश्रण जब तक चूहों इंजेक्शन जा करने के लिए तैयार नहीं हैं। प्रत्येक प्लग इंजेक्शन कम से कम एक मिनट लेना चाहिए। एक माउस दो प्लग, अपनी पीठ के प्रत्येक पक्ष पर एक ले जा सकता है। प्लग निकालने प्लग मांसपेशियों और त्वचा की परतों के बीच sandwiched रखने के लिए सुनिश्चित कर लें, तो मैट्रिक्स जेल प्लग में अच्छी तरह से अलगाव के बाद एकत्र किया जाएगा।
मैट्रिक्स जेल प्लग परख की कमियां हैं यह समय लगता है, महंगा है, और इस तरह के injec के रूप में कठिन और नाजुक कदम शामिल है किtion और प्लग अलगाव। इन चरणों का असफल रहे थे, तो परिणाम बर्बाद हो जाएगा और इस प्रक्रिया को नया चूहों और सामग्री के साथ फिर से दोहराया जा करना होगा।
हालांकि, डेटा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और प्रयोगात्मक डिजाइन के मामले में लचीलापन प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, विकास के कारकों या अवरोधकों संवहनी विकास के विभिन्न चरणों, जो दवा सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर प्लग को नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के विकास से गिरफ्तार कर लिया कोशिकाओं, ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों या ट्यूमर सेल लाइनों के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, मैट्रिक्स जेल प्लग में, के समावेश angiogenesis के दौरान endothelial सेल phenotype जोड़ तोड़ के लिए एक और संभावना है। हमारी प्रोटोकॉल इस लचीलेपन का इस्तेमाल करता है और ईसी के साथ-साथ मानव व्युत्पन्न pericytes का परिचय पूरी तरह कार्यात्मक, pericyte कवर, विवो में संकर वाहिकाओं के गठन की अनुमति है। हमारी प्रोटोकॉल का भी वर्णन कैसे ट्यूब सहित, महत्वपूर्ण angiogenesis समापन के लिए इन प्लग से histological वर्गों का विश्लेषण करने के लिएसंख्या और ट्यूब लंबाई, इन दो सेल उपस्थित प्रकार के साथ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
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