Summary
Vi presenterar ett protokoll för att studera mänskliga endotel-pericyte interaktioner i musen med en variation av matris gel kontakten angiogenes analys.
Introduction
Angiogenes är den process genom vilken nya blodkärl bildas från ett befintligt vaskulära nätverket 1 och är i fokus för pågående forskning inom många områden som sträcker sig från normal utveckling till sjukdomen. Denna dynamiska process involverar proliferation och migration av endotelceller (ECS) och rekrytering av pericyter att konstruera en vaskulär rör som är riktad mot den plats som behöver syre och näringstillförsel 2. För att studera denna process kräver en lika dynamisk analys, framför allt en som kan sammanfatta den tredimensionella karaktären av röret bildning. In vitro 3D matrisanalyser har utvecklats för att tillgodose detta behov och har fungerat bra för att tillåta forskare att definiera diskreta steg i tid och rum där angiogenes sker 3, 4, 5, 6. Men dessa in vitro 3D matrismodeller begränsad till att studera icke-perfusion fartyg end saknar därför kritiska komponenter som är relevanta för angiogenesprocessen (t.ex. cirkulerande tillväxt och hämmande faktorer, onaturlig spänning / krafter över kärlbädden) och misslyckas med att simulera den komplexa miljö som finns i levande vävnad. Att ta itu med denna begränsning har flera in vivo angiogenesanalyser utvecklats 7, inklusive matrisgel kontakten analys som kommer att vara i fokus för vår rapport 8, 9.
Matrisen gel plug-analysen är en väletablerad in vivo angiogenesanalys som tilltalar forskare eftersom det ger en robust plattform för att testa roller olika celler och ämnen i angiogenes. Matrisgel är ett kommersiellt tillgängligt basalmembran-lösning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkom-cellinje som stelnar till en gel-liknande material vid 37 ° C. Matrisen gel kan blandas med celler och / eller substanser, såsom tillväxtfaktorer och Injected subkutant i musen. Värd EC invaderar kontakten under 14 dagar, bildar en vaskulär nätverk, och blir perfusion med värdens blod. Hittills har matris gel plug-analyser fokuserat på studier av endotelceller beteende under angiogenes, dock, såvitt vi vet inga ansträngningar har ännu gjorts för att avgöra om denna analys kan användas för att co-kultur endotelceller och pericyter att studera hur dessa två celltyper samverkar under angiogenes. Specifikt är värdefull för att studera sjukdomar där blodkärl förlust är patologisk, inklusive mikrovaskulära ischemi och perifer kärlsjukdom 10, 11, 12 förstå sambandet mellan EC och pericyter.
Här beskriver vi ett protokoll som introducerar pericyter humant ursprung till matrisen gelblandningen tillsammans med mänsklig EC och fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). Denna blandning kan sedan injiceras subkutant in ryggen på SCID-möss för att möjliggöra bildandet av fullt fungerande, pericyte belagda, hybrid fartyg. Vår protokoll beskriver hur man förbereder matris gel pluggar innehållande humana EC antingen med eller utan mänskliga pericyter, placering i SCID-möss och hur man kan analysera histologiska sektioner för kritiska angiogenes ändpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Stanford University School of Medicine.
OBS: Djur är under bedövning med 3% förångare isofluran och 3% leverans av O2 gas. Användning av veterinär salva på ögonen kan bidra till att förhindra torrhet under narkos.
1. Cellberedning
- Väx humana endotelceller och pericyte cellkulturer i 100 mm plattor med 10 ml av den lämpliga media. Ersätt 10 ml färskt medium var 2 - 3 dagar tills cellerna når 80% konfluens.
- Kultur endotelceller (ECS) i fullständig endotelial cellmedium (ECM) som kompletterats med företag som levereras 5% fetalt bovint serum (FBS), 10% penicillin / streptomycin och 10% endotelial celltillväxtsupplement.
- Kultur pericyter i fullständig pericyte media (PM) kompletterat med bolag levererade 2% FBS, 10% penicillin / streptomycin och 10% pericyte tillväxtsupplement.
- Förbereda cellblandningar
- Beräkna det erforderliga antalet cell för de experimentella och kontrollgrupper.
OBS: Varje plugg i försöksgruppen innehåller en miljon (1 x 10 6) human EC och tvåhundratusen (2 x 10 5) pericyter. För kontrollgruppen, varje plugg innehåller endast 1,2 miljoner människor EC. Den negativa kontrollgruppen har endast matris gel. Varje grupp bör omfatta minst fyra pluggar, som skulle kräva två möss som pluggar kan injiceras i vardera sidan av en mus nedre ryggparti. Tre pluggar skulle fungera som tre exemplar för experimentet och den fjärde skulle kunna användas i fall man misslyckas. Förbered 25% extra celler för att matcha den extra volym gel. - Samla in och räkna cellerna från odlingsplattor.
- För att ta bort celler, ta bort media och tvätta en gång med rumstemperatur 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS, tillsätt 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, och inkubera i 1 minut. Tvätta cellerna från plattan genom att tillsätta 2ml medium och samla i en 15 ml tub.
- Räkna cell med användning av en hemocytometer enligt tillverkarens instruktioner.
- Centrifugera det lämpliga antalet av celler i en pellet vid 400 xg under 5 min. För den experimentella gruppen, centrifug både EC och pericyter ner tillsammans till en pellet.
- Beräkna det erforderliga antalet cell för de experimentella och kontrollgrupper.
2. Matrix Gel Preparation
- Tina upp matrisgel fullständigt vid 4 ° C under 4 h eller över natten för att erhålla en homogen lösning. Ingen blandning krävs.
- Alikvotera matris gel i 1,5 ml rör och förvaras vid 4 ° C.
- Pre-chill sterila 1,5 ml rör och 28 G 1 cc insulinsprutor vid 4 ° C. Varning: Håll matris gel på is hela tiden.
- Blanda kall matrisgel med bFGF vid ett volymförhållande av 1: 100 (slutlig koncentration av bFGF = 0,5 | j, g / ml; bFGF stamlösning = 50 | ig / ml) Efter blandning matrisgel lösning genom att pipettera upp och ned flera gånger, inkubera på is för 30-60 min böre blandning med cellerna i steg 3,1.
OBS: Tina lager bFGF före blandning. Beräkna antalet pluggar som behövs för injektion. Till exempel, kräver varje plugg 200 pl matrisgel. Därför förbereda 25% extra gel.
3. Blanda Matrix Gel med Celler
- För varje grupp, resuspendera cellpelleten (innehållande lämpligt antal celler) med den beräknade volymen av matrisgel innehållande bFGF. Blanda försiktigt för att undvika skumning och lämna i 15 ml rör på is tills möss bereds för injektion.
4. Mus Framställning
- Söva 1 SCID-möss för 5 min i 3% isofluran plus 3% O2 i en induktionskammare. Fokusera på en experimentgrupp, eller 2-möss, vid en tidpunkt.
- Ta musen från induktionskammare, plats på en värmedyna ventrala sidan nedåt och snabbt fästa en nos munstycke till musen ansikte via en icke-återandningssystem för att leverera anestesi hela InjeInsatser förfarande. Växla gasflödet från induktionskammaren till den icke-återandningssystem och sänka gastrycket till 1,5% isofluran och 1,5% O2.
- Ta bort hår från båda sidoområdena hind (cirka 1 cm i diameter) med en rakapparat eller hårborttagningskräm.
- Torka av huden med en 70% våtservetten.
- Återgå musen till induktionskammaren och upprepa steg från 4,2 till 4,4 med den andra musen.
5. Matrix Gel Injection
- Förbered en mus för injektion genom att binda till det icke-återandningssystem och utsläppande på värmedyna ventrala sidan nedåt.
- Ladda matrisgel in i en pre-kyld 28 G 1 cc spruta insulin en mus åt gången.
- Ladda ner hela 500 pl volym av matris gel för två pluggar (200 mikroliter per plugg plus 25% extra) i sprutan.
- Se till att injicera matrisen gelen i mössen inom tre minuter att ladda cellerna i sprutan för att förhindra cells från sedimentering vid sidan av sprutan och för att förhindra matrisgel stelnar inuti sprutan.
- Lyfta tillbaka huden för att lokalisera subkutana utrymmet, sedan injicera 200 ul av matrisgel långsamt och jämnt in i det subkutana utrymmet i den bakre bakre delen av bröstkorgen.
- Ta bort injektionsnålen långsamt, var noga med att förhindra matris gel från att läcka ut från injektionsstället. En bula bildas vid stället för injektion. Torka injektionsstället med en spritsudd.
- Upprepa injektionen steg 5,2-5,5 på den andra sidan av musens rygg, sedan lämna musen på rygg under 1 min för att medge gelning av matrisgel på värmedynan.
- Disposition båda gupp med hjälp av en permanent markör för att identifiera knölen efter 14 dagar. Efter växer lite hår tillbaka, blir det lättare att hitta knölen.
6. Matrix Gel Plug Isolering: 14 dagar efter injektion
- Euthanize mössen humant genom att exponera djurets till> 5 min av inhalation av koldioxid följt av cervikal dislokation att säkerställa döden.
- Ta bort matrisgel kontakten från musen rygg.
- Ta försiktigt regrown hår runt injektionsstället där kontakten ligger genom att upprepa steg 4,3. Markören linjen anger storleken på original bula under huden.
- Excidera pluggen tillsammans med den omgivande huden och muskellager fästa på de övre och undre sidorna av pluggen, respektive.
- Med fina kirurgiska saxar, göra ett snitt på den markerade gränsen av pluggen som är vinkelrät mot huden och skär igenom till muskeln under pluggen. Då, försiktigt skära runt periferin av pluggen längs den markerade gränsen.
- Ta bort pluggen, att hålla det inklämt mellan huden och muskelskikt. Skölj genast i en liten bägare med 1x PBS för att tvätta bort överflödigt blod. Pluggen är nu klar att fixeras (nästa steg, 6,3).
- Fäst plug i 4% paraformaldehyd.
- Placera hela pluggen, inklusive hud- och muskellager, i ett 50 ml rör med 25 ml 4% paraformaldehyd under 24 h vid rumstemperatur utan gunga. Nästa dag, överför i kontakten i 25 ml av 70% etanol under ytterligare 24 h före paraffininbäddning.
OBS: Hantera paraformaldehyd med försiktighet. Använd handskar.
- Placera hela pluggen, inklusive hud- och muskellager, i ett 50 ml rör med 25 ml 4% paraformaldehyd under 24 h vid rumstemperatur utan gunga. Nästa dag, överför i kontakten i 25 ml av 70% etanol under ytterligare 24 h före paraffininbäddning.
7. Paraffin Process Matrix Gel Plug
- Insticksprogrammet förbereds för paraffininbäddning.
- Orientera kontakten som visas i figur 1a; Placera kontakten i ett vävnadskassett så att den sida av pluggen uppåt och både hud och muskellager syns över ytan av vävnaden block som kommer att minska först under snittning.
- Paraffin bädda pluggen enligt standard paraffin bädda protokoll 13.
- Skär 8 - 10 um tjocka sektioner av vävnadsblocket och montera på objektglas enligding med standardparaffinsektioneprotokoll 13.
- Förvara bilderna i en sval och torr plats vid rumstemperatur tills redo för färgning.
8. Stain Sektioner med hematoxylin och eosin Stain (H & E) 13
- De-paraffinize vävnadssnitt genom att passera objektglasen genom 100% xylen två gånger, 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol och slutligen 1 x PBS, vardera under 5 min vid rumstemperatur. Lämna glasen i 1x PBS till nästa steg.
- Tillsätt 100 pl H & E lösningen på sektionen och inkubera i 1-5 min eller tills det finns tydlig kontrast mellan blå kärnor och rosa cytoplasma i en cell som visas under en upprätt ljusmikroskop vid 10X förstoring. Var noga med att inte låta någon H & E lösning röra målet.
- Tvätta H & E lösning bort från bilden genom att doppa bilden i en stor bägare med kranvatten, sedan placera bilden i ett rack i bägaren och spola med rinnande vatten under 2 minuter.
- move till steg 9,8 för att montera bilderna.
9. Bets andra bilder för mänskliga kapillärer och pericyter
- De-paraffinize vävnadssnitt genom att passera objektglasen genom 100% xylen två gånger, 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol och slutligen 1 x PBS, vardera under 5 min vid rumstemperatur. Lämna glasen i 1x PBS till nästa steg.
- Koka avsnitten i antigenåtervinning lösning.
- I en 2 liter bägare, förbereda kokande antigenåtervinning lösning med användning av 1x citratbuffert (pH 7,0) vid 95 ° C på ett värmeblock.
- När kokning, placera glasen i en metall rack och dränka i kokande antigenåtervinning lösning under 20 minuter.
- Försiktigt bort bägaren från värmeblocket med bilderna fortfarande nedsänkta och låt lösningen sakta återgå till rumstemperatur under ca 30 minuter.
- Placera glasen i 1x PBS tills nästa steg.
- Blockera de avsnitt i blockeringsbuffert (1x PBS, 5% getserum, 00,3% Triton X-100).
- Rita en hydrofob cirkel runt kanterna på varje sektion med en PAP penna.
- Placera glasen i en fukt bricka med destillerat vatten i botten av facket.
- Pipettera 100 | il blockeringsbuffert till sektionerna varvid tillses att allt av vävnaden är täckt av vätska (kan kräva mer än 100 | j, l).
- Inkubera sektioner med blockerande buffert under 1 h.
- Inkubera sektioner med primär antikropp.
- Bered en lösning med två primära antikroppar för att undersöka varje avsnitt för CD31 (EC) och glatt muskulatur aktin (pericyter) i spädningsbuffert (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
OBS: Här är anti-CD31 koncentration 01:50 och anti-glatt muskulatur aktin koncentration är 1: 300. - Inkubera sektionerna över natten vid 4 ° C med 100 fil primära antikroppar i en fukt fack som innehåller destillerat vatten.
- Bered en lösning med två primära antikroppar för att undersöka varje avsnitt för CD31 (EC) och glatt muskulatur aktin (pericyter) i spädningsbuffert (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
- Tvätta bilderna tre gånger i 1x PBST (1 x PBS + 0,1% TWEEN20) under 5 minuter varje tvätt.
- Inkubera sektioner med sekundär antikropp.
- Bered en lösning med en fluorofor konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp att känna igen anti-CD31 kaninantikropp utspädd i utspädningsbuffert.
- OBS! Glattmuskelaktin primära antikroppen är redan konjugerad med en CY3 fluorofor, så ingen sekundär antikropp färgning behövs. Get-anti-kanin sekundär antikroppskoncentration är 1: 250.
- Inkubera sektionerna under 1 timme med 100 | j, l sekundär antikropp i luftfuktighet fack innehållande destillerat vatten.
- Bered en lösning med en fluorofor konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp att känna igen anti-CD31 kaninantikropp utspädd i utspädningsbuffert.
- Tvätta bilderna tre gånger i 1x PBST under 5 minuter varje tvätt.
- Montera bilderna.
- Pipettera 2 - 3 droppar (~ 40-60 l) av antifade monteringslösning med DAPI nukleär färgning på varje avsnitt.
- Placera försiktigt ett nej. 1,5 täckglas över sektionerna och monteringslösning, vilket gör att vätskan att spridas ut över sektionerna och kantertäckglaset. Använd försiktigt ett finger för att trycka ut luftbubblor som kan vara placerade över sektionen.
- Låt bilderna torka minst 1 timme före användning.
10. Kvantifiera kapillärtäthet och struktur 14
- Räkna antalet kapillärer i H & E färgade snitt, uttryckt som # / mm 2.
- Förvärva bilder av fyra olika områden på en upprätt ljusmikroskop enligt 40X förstoring.
OBS: Kapillärer identifieras som rör fyllda med röda blodkroppar. - Alternativt, i stället för att manuellt räkna kapillärer, använd bildanalysmjukvara (t.ex. Wimasis bildanalys) att kvantifiera olika angiogenes parametrar såsom fartygsnummer, genomsnittliga fartygets längd och diameter, och förgreningar.
- Förvärva bilder av fyra olika områden på en upprätt ljusmikroskop enligt 40X förstoring.
- Analysera kapillärstruktur i immunofluorescerande färgade sektioner.
- Förvärva bilder av fyra olika områden på ett inverterat fluorescensmikroskopmed FITC och TxRed filter kub.
- Använd en FITC kub bilden EC av excitation vid 488 nm våglängd och använda en TxRed kub till bild pericyter genom excitering vid 594 nm våglängd.
- Förvärva bilder av fyra olika områden på ett inverterat fluorescensmikroskopmed FITC och TxRed filter kub.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant H & E och immunofluorescerande färgning av matris gel plug sektioner visas i Figur 2. Avsnitten från EG bara pluggar visa vissa fartyg som oftast inte perfuserade med blod (Figur 2 uppe till vänster, svarta pilar) medan pluggar som innehåller både EC och pericyter visar flera perfunderad fartyg med större diameter och fullständig pericyte täckning, vilket framgår av positiv SMA färgning i direkt anslutning till CD31-positiva EC. Dessa resultat tyder på att pericyter spelar en viktig roll i begynnande blodkärlsbildning och att denna dynamiska process kan rekapituleras och enkelt analyseras i en in vivo-modell.
Figur 1. Vävnads orientering när Inbäddad i en Tissue kassett. Efter matrisgel kontakten (gul) isoleras, är detmellan musens muskel (lila) och hud (grön) skikt. Pluggen är placerad i vävnaden kassetten såsom visas, så att alla tre skikten kan ses över ytan som ska skäras först vid snittning. A) Utsikt från toppen av kassetten, B) Sedd från sidan av kassetten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant H & E (övre raden) och Immunofluorescens (nedersta raden) i Matrix Gel. Bilder visar utseendet på EC enbart (vänster bilder) och ECS plus friska pericyter (PC) (höger bilder). Humant och murint EC är märkta i grönt (botten bilder) och pericyter (α glatt muskulatur aktin (αSMA)) är märkta i rött (nere till höger), och kärnor ärfärgas blå med DAPI-infärgning. Skala är 25 pm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Matrisen gel plug-analys har visat sig vara en praktisk och kraftfull metod för att utvärdera genreglering i angiogenes, angiogena och antiangiogena föreningar in vivo, och att komplettera in vitro-tester. Här beskriver vi i detalj en ny matris gel plug-analys av humant angiogenes som undersöker samspelet mellan endotelceller och pericyter under kärlbildningen.
Det finns några nya och viktiga steg i detta protokoll. Celler i låg passage (passage 1-4) är att föredra, eftersom unga celler kommer att vara mer livskraftig under 14-dagars experimentell miljö. Antalet endotelceller som används är minst en miljon och förhållandet mellan EG pericyte är 5: 1; kommer dock ökat pericyte cellantalet öka sin täckning på kapillärer. För den experimentella gruppen ensamma endotelceller, bör det totala antalet celler injicerade vara summan av endotelceller och pericyter, som är 1,2 miljoner, därföre, är det totala cellantalet per plug konsekvent. Det är viktigt att beräkna de lämpliga mängderna av cellantal och matris gelvolym. Den grundläggande formeln är 1,2 miljoner celler i 200 pl matrisgel. Dessutom före injektion, hålla pipettspetsar, sprutor, matrisgel, och cellpellets på is vid alla tidpunkter. Eftersom matris gel är viskösa och i syfte att undvika luftbubblor bildas under cellsuspension, skär ca 1 cm från av spetsen av 1 ml pipettspetsar för att möjliggöra bättre flöde. Blanda inte matrisgel med celler tills möss är färdig att injiceras. Varje plugg injektion bör ta mindre än en minut. En mus kan bära två pluggar, en på vardera sidan av dess rygg. När utvinna pluggarna se till att hålla kontakten inklämt mellan muskeln och hudlagren, sedan matrisen gel pluggen kommer att vara väl samlas efter isolering.
Nackdelarna med den matrisgel pluggen analys är att det är tidskrävande, kostsamt och innebär omständliga och ömtåliga steg såsom injection och plugg isolering. Om dessa åtgärder skulle misslyckas, skulle resultatet bli förstörd och processen måste upprepas igen med nya möss och material.
Emellertid är data reproducerbar och ger flexibilitet när det gäller experimentell design. Exempelvis skulle tillväxtfaktorer eller hämmare administreras till proppen på olika stadier av vaskulär utveckling, som kan användas för validering drog. Vidare är inkorporering av andra celltyper, såsom tillväxtfaktorer hämmade celler, transfekterade cellinjer eller tumörcellinjer, in i matrisgel pluggen en annan möjlighet för att manipulera den endoteliala cellfenotyp under angiogenes. Vår protokoll utnyttjar denna flexibilitet och introducerar humant ursprung pericyter tillsammans med EC för att möjliggöra bildandet av fullt fungerande, pericyte omfattas, hybrid fartyg in vivo. Vår protokoll beskrivs också hur man analyserar de histologiska sektioner från dessa pluggar för kritiska angiogenes endpoints, inklusive rörnummer och rörlängden, med dessa två celltyper som är närvarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28 G 1 cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
