Abstract
העובר החומוס מספק מודל חוליות מעולה שיכול לשמש כדי לנתח שאלות התפתחותיות בצורה ישירה. הנגישות ואת החוסן שלה לאחר התערבות כירורגית הם עוצמות ניסיוני מפתח. צלחות נציץ היו המחסומים הראשונים השתמשו כדי למנוע התחלת ניצן איבר חומוס 1. פרוטוקולים המשתמשים רדיד אלומיניום כמו מחסום בלתי חדיר כדי ניצן זרוע או אינדוקצית ניצן רגל או חניכה מתוארות. אנו משלבים את הטכניקה הזו עם לרוחב הזרקה אל המחסום אקסוגני גורמי אנדוגניים מועמד אספקה שנחסמו על ידי הגדר. התוצאות מנותחות באמצעות הכלאה באתרו של ביטוי גנים לאחר מכן. ההתמקדות העיקרית שלנו היא על עצמו את התפקיד של איתות החומצה הרטינואית אינדוקציה וייזום מאוחר יותר של פני השטח העובר חומוס hindlimb. אנו משתמשים BMS 493 (אגוניסט ההופכי של קולטני חומצה רטינואית (RAR)) חרוזים ספוגים המושתל mesoderm הצלחת לרוחב (LPM) לחקות את ההשפעה ברהפרייה ממוקם בין somites (מקור של חומצה רטינואית (RA)) ואת LPM שממנו ניצנים איבר לגדול. גרסאות מותאמות של פרוטוקולים אלה יכולים לשמש גם כדי לענות על שאלות אחרות על מוצאם והעיתוי של רמזים אינדוקטיביים. בתנאי באזור של עובר החומוס נגיש בשלב ההתפתחותי הרלוונטי, מחסום יכול להיות ממוקם בין שתי רקמות והשינויים סוגרים בפיתוח למדו. דוגמאות ניתן למצוא את הסיומת המוח המתפתח, ציר בפיתוח איברים, כגון אינדוקציה בכבד או בכליות.
Introduction
embryologists הקלסית בטכניקות גופניות באופן מסורתי לחקור את מנגנוני שליטת התפתחות עוברית. ב -1960 ו -1970 חוקרים פיתחו טכניקות שהשתמשו מחסומים בלתי חדירים מוכנס בין רקמות של העובר המתפתח כדי להדגים את החשיבות של אותות אינדוקטיבי במהלך embryogenesis. האינטרס שלנו הוא בפיתוח איבר חוליות ובמיוחד אילו אירועים מקדימים תולדת ניצן איבר. לדוגמא, החדרת מחסום יכולה למנוע תולדת ניצן איבר ההתרחשות בצד אחד של עובר אפרוח אך מאפשר לה להמשיך בדרך כלל בצד הנגדי, unoperated. חומרים המשמשים לייצור מחסומים אלו השתנו; למשל, צלחות נציץ 1 טנטלום רדיד 2. מחסומים אלה מפרידים את המזודרם צלחת לרוחב ביעילות (LPM), שממנו צורות ניצן איבר, מן somites התגבשה מתוך mesoderm הפרקסיאלית. טכניקות השתלת כירורגים להוכיח כי שנינות קשר הדוקותh את somites חיוני אם ייזום ניצן איבר הוא להתרחש LPM 3 4. בשנות ה -80 וה -90 ביולוגים התפתחותיים גילו diffusible מולקולות איתות כי הם חיוניים בשליטה תהליכים התפתחותיים. חרוזים ספוגים מולקולות איתות אלה יכולים להיות מושתלים באזורים הספציפיים של העובר ולייצר שינויי התפתחות עוברית. לדוגמא, חומצה רטינואית (RA) נלקחת על ידי חרוזי חילוף יונים הוא שוחרר על פני תקופה של 24 שעות כאשר מושתלים לתוך עובר אפרוח והוא יכול לייצר שכפול תמונת ראי של הספרות 5. חרוזי אקרילי הפרין המכילים חלבון FGF יכולים ליזום תולדת ניצן איבר מן interlimb LPM 6.
לאחרונה גנטיקת עכבר והדגים לקחה את מחקר חניכת איבר חוליות לעידן חדש (הנסקרת ב 7). ישנן ראיות טובות כי נוכח RA ב somites לפני תחילת ניצן איבר היא האות diffusible החיונית הנדרשת על ידי LPM ליזום ניצני איבר. רצינו לנצל את הנגישות ואת החוסן ניסיוני של עובר החומוס לנתח את שפעת ההשתלה מחסום על ביטוי גני LPM בערך בזמן חניכת ניצן איבר. עיבוד לרומן של השיטה שלנו הוא לשלב מחסום אותות בלוקים מרקמות ציריות עם לרוחב הזרקה אל מחסום גורמי אנדוגניים מועמד אספקת אקסוגני שנחסמו על ידי הגדר. הפרוטוקולים הבאים הם אלו שפותחו כדי להקניט את מנגנוני אינדוקציה ניצן איבר וייזום.
לימוד ייזום איבר ניצן אומר שימוש בעוברים בראשית התפתחותם. ביצי תרנגולת חלון חוקרים רבות על ידי הסרה הראשונה חלק אלבומין דרך צק האוויר עם מחט מזרק. עובר, השוכן על גבי החלמון, אז תשקר נמוך בתוך הביצה. זהו יתרון עבור חלק מטכניקות, כגון electroporation, אבל יכולים להיות חסרון אם מניפולציה כירורגית של העובר היא רצויה.אנו מוצאים שיש העובר קרוב הפתח ביצה ככל האפשר מהווה יתרון.
שאלות להישאר לגבי אותות השולטים אינדוקציה ניצן איבר חוליות וייזום ואת הפרוטוקולים הבאים מתאימים לטפל בהם. אנחנו הראשונים לפתח פרוטוקול ההחדרה של מחסומים כדי למנוע תוצאת ניצן איבר חומוס בשלב מוקדם יותר מאשר בשלב 12 8. הגירסות מותאמות של פרוטוקולים אלה יכולים לשמש גם כדי לענות על שאלות אחרות על מוצאם והעיתוי של רמזים אינדוקטיביים שבו רקמת התרמה נגישה סמוכה אל primordium להיות מושרה. בתנאי באזור של העובר נגיש בשלב ההתפתחותי הרלוונטי, אז מחסום יכול להיות ממוקם בין שתי רקמות והשינויים סוגרים בפיתוח למדו. דוגמאות ניתן למצוא בהתפתחות המוח, הארכת ציר ואולי פיתוח איברים כגון אינדוקציה בכבד או בכליות.
Protocol
הפרוטוקול הבא משתמש עוברי תרנגולת בפחות מעשרה ימי דגירה. כל הניסויים בוצעו בהתאם בקינגס קולג 'בלונדון, בריטניה ואת הנחיות טיפול בבעלי חיים משרד הפנים בבריטניה.
1. חובה הכנה לפני צ'יק מבצע העובר
- אספו את מכשירי הניתוח הבאים הנדרשים לצורך פעילותה, להכנת זרעים לתיקון עובר חומוס: שני זוגות מלקחי שעני מס '5, זוג אחד של מלקחיים חזקים, למשל, סוג AA, מספריים מעוקלים עם להבי 2.5 סנטימטר, בוטה הסתיים מעוקל מלקחיים עם קצוות כ 0.5 ס"מ, וגם שני זוגות מלקחיים מס '4 שענים להשתמש בעת ביצוע מחסומי רדיד (1.6.3).
- הפוך סכין מיקרו פין מתכת (0.3 מ"מ לרוחב) חידד שימוש בשמן על אבן השחזה. באמצעות מיקרוסקופ משקפת, לחדד את קצה הסיכה כדי להב שטוח. מניחים את הסיכה בעל מחט ולהגן הקצה החד שלה מלהיות דפק ו denטד.
הערה: לנדן הסכין עם קצה פיפטה 1,000 μl היא אפשרות פשוטה לכך. - כן אתנול 70% בבקבוק לשטוף פלסטיק. השתמש להשפריץ זה על ממחטת נייר כדי לנגב את מכשירי ניתוח והסכין מיקרו לפני ואחרי השימוש לעקר ולנקות אותם.
- קנה 5 ס"מ רוחב ברור סרט דביק ו מנפק מתאים. מצא או לייצר לנוח מתאים להחזיק ביצת עוף יציבה על צידו.
- הפוך ופתרונות חנות חרוזים השריה.
- הכן פתרון 0.35 מ"ג / מ"ל של 4 פקטור גדילה פיברובלסטים (FGF4) חלבון מן 1 מ"ג / מ"ל המניות קפוא על ידי דילול אותו במים ולאחסן ב -20 ° C ב 30 aliquots μl.
- פתרונות הכן (או 0.05 או 0.1 מ"ג / מ"ל) של כל-trans-החומצה הרטינואית (ע"ר) מדולל sulfoxide דימתיל (DMSO) צינורות microcentrifuge כהה ממלאי 5 מ"ג / מ"ל. אחסן את המניות 100 aliquots μl ב -20 ° C.
- הכינו פתרונות (או 2.5 או 5 מ"ג / מ"ל) של BMS 493 (AG ההופכיonist של RARs) מדולל DMSO צינורות כהה microcentrifuge ממלאי 10 מ"ג / מ"ל. אחסן את המניות 100 aliquots μl ב -20 ° C.
- הפוך מחסום מרדיד אלומיניום.
הערה: הרדיד נהג להכין את המחסומים הוא לסכל קייטרינג סטנדרטי (נמדד על ידי מיקרומטר כמו 0.013 מ"מ עובי). כל רדיד אלומיניום המקומי יהיה מתאים סביר.- חותכים חתיכה מרובע 1 ס"מ של רדיד אלומיניום לעקר אותו על ידי מנגב אותו עם אתנול 70% על רקמה. מניחים אותו על צלחת פטרי פלסטיק סטרילי 6 ס"מ. מחק את המכסה ולעשות מכסה עבור המנה מרדיד.
הערה: פעולה זו תמנע את המחסומים חתך מאוחר יותר דבק את מכסה הפלסטיק של המנה בשל סטטי. - מניח את צלחת פטרי על גבי graticule בשלב (1 סנטימטר התפצל 100 חלקים) תחת מיקרוסקופ המשקפת עם הגדלה המוגדרת 1.6x. באמצעות אזמל קטן להב No.15, לחתוך רצועות של נייר כסף כדי רוחב מדויק, למשל, 0.7 מ"מ או 1.3 מ"מ.
- הפרד את הרדידרצועות באמצעות שני זוגות מלקחי שעני מס '4. לאחר מכן לבצע עיקול ישר זווית במרכז מכשול הרדיד כך שהיא דומה ציר הרוחב המבוקש.
הערה: צורה זו של מחסום נלקחת מתוך 9, 10. מחסום צירים נשאר מקום טוב יותר מאשר מחסום ישר ושטוח. מלקחי מס '4 הם יחסית בוטה משמשים כי הם אינם צפויים לבצע שקעים או ציונים ב מחסומי הרדיד. - בשורת המחסומים במרכז צלחת פטרי עם צד אחד שטוח נגד הצלחת והשני כלפי מעלה מתוך הצלחת, הזזת הרדיד נימול הנותר לצד אחד. הכן 20 או יותר מחסומים לפני יום המבצע. מניח את מכסת הרדיד מעל המנה ולאחסן מחסומי מקום שבו הם לא יפריעו.
הערה: גם דפיקה קלה יכולה להטות את המחסומים מעל או אומרת שהם להישאר עם סטטי הצדדים של המנה.
- חותכים חתיכה מרובע 1 ס"מ של רדיד אלומיניום לעקר אותו על ידי מנגב אותו עם אתנול 70% על רקמה. מניחים אותו על צלחת פטרי פלסטיק סטרילי 6 ס"מ. מחק את המכסה ולעשות מכסה עבור המנה מרדיד.
- דגירה ביצי תרנגולת מופרות על צדם על מגשי ביצים קרטון ב 38 °C עבור באורך המתאים של זמן עד יום המבצע כזה כי העוברים יהיו בשלב 8 הרצוי.
2. הכנת צ'יק עובר וחרוזים ביום מבצע
- 'חלון' מודגרות ביצי תרנגולת.
הערה: השיטה הבאה לפתיחת ביצים נחקקה על ידי דניס Summerbell (לא פורסם).- עם הביצה שוכבת על צידו, לנקב בקצה הקהה (סוף צק אוויר) של הביצה עם מלקחיים חזקים מהסוג AA מוודאים כי קרום הקליפה הפנימי נשבר. לשם הבנה זו המלקחיים בתוקף יחד ולהשתמש בתנועת נעיצה מבוקרת תוך כדי לחיצה על הביצה עם היד החופשית.
- קח את הביצה, עדיין שוכב על צידו, בשתי ידיו (אחד מכל צד) ולהפוך אותו דרך 180 מעלות לאורך הציר האופקי ולהחליף אותו במגש הביצה כזו שהצד עדיין עמד בראש עכשיו ליד המגש.
הערה: זו משחררת את העובר מן הקרומים פגז ויהיה אומר כי העובר הוא less עשוי להיחתך כשהפגז מעל עובר מוסר. - קח חתיכת סרט ברור כ מרובע 5 ס"מ ואת המקל הזה מקרוב על פני השטח העליון של הביצה כדי לעצור את קליפת הביצה מן מתפורר על העובר כאשר הביצית נפתח.
- השתמש במספריים מעוגלים לשבור בעדינות מבעד לשכבת ההגנה וממברנות שלה במרכז החלק העליון של הביצה, לעשות חור קטן מאוד עם להב אחד של המספריים כך האוויר יכול להיכנס ביצה על העובר (הנמצא ממש מתחת החלק העליון של הקליפה).
הערה: רק על ידי שבירת קרום המעטפת ולא לשבור את כל הקרומים המכסים את העובר, האוויר שנכנס ביצה יפרידו את העובר מן הקליפה ואת העובר יהיה לבוא לנוח על גבי החלמון על 0.5-1 ס"מ מן הקליפה . - השתמש במספריים מעוגלים כדי להגדיל את החור במעטפת למעגל בקוטר של כ 1 ס"מ. הסר את חתיכת קליפה שנכרת לכסות את החור הביצה עםחתיכת סרט ברור כ מרובע 5 ס"מ. כדי להסיר בקלות את הקלטת הזו, לחץ על קלטת לתקוע אותו רק על שפת החור, עוזב את הנותרים קלטת חינם. הקלטת חינם לאחר מכן ניתן תפס כדי unseal הביצה.
- עובר שלב
- לאחר דגירה ב 38 ° C (ראה שלב 1.7) ו חלונאית (שלב 2.1), השתמש במיקרוסקופ המשקפת לביים את העוברים חומוס פי 8. האם זה רק לפני ביצים חתומות הבאים חלונאית. כתוב את הבמה של כל עובר על קליפת הביצה. החזר את הביצים באינקובטור.
הערה: עובר בשלבים בין 8 ו -15 מתאימים לניסויי מכשול חרוזים. עובר נוטה יותר לשרוד אם הם לא הושארו מחוץ בחממה במשך יותר מדי זמן לפני הניתוח.
- לאחר דגירה ב 38 ° C (ראה שלב 1.7) ו חלונאית (שלב 2.1), השתמש במיקרוסקופ המשקפת לביים את העוברים חומוס פי 8. האם זה רק לפני ביצים חתומות הבאים חלונאית. כתוב את הבמה של כל עובר על קליפת הביצה. החזר את הביצים באינקובטור.
- חרוזים שריה טרם תחילת הפעולה.
- FGF4
- קח מספר חרוזי ג'ל כרומטוגרפיה זיקה (150-300 מיקרומטר) שנצמד סוף קצה פיפטה 1,000 μl והיהh אותם 1 מ"ל פוספט בופר (PBS) בצינור microcentrifuge להסיר את אזיד הם מאוחסנים. צנטריפוגה במשך 5 שניות, להשליך את PBS וחזור על התהליך פעמיים.
- משרים את חרוזי ג'ל בטיפת 30 μl של חלבון 0.35 מ"ג / מ"ל FGF4 על צלחת פטרי סטרילית על קרח למשך 30 דקות. פיק חרוזים כ 150 מיקרומטר קוטר עם מס '5 microforceps כדי להכניסו העובר.
הערה: ידית חרוזים שרף חילוף יונים שמשמש בשלבים הבאים עם מס '5 microforceps אחיזה אותם בעדינות מאוד בגלל החרוזים הם פריך יכול לנפץ אם לחצה חזק מדי. אזהרה זו חלה על 2.3.2-2.3.3 וכל פעולות חרוז שרף.
- RA
- הפשירו aliquot של מ"ג 0.05 או 0.1 / מ"ל כל-trans-RA מדולל DMSO ומניחים ירידה 100 μl על צלחת פטרי סטרילית (ס"מ קוטר 9), אשר כבר מכוסה בעבר בנייר כסף כדי להגן על RA מן האור. קח טיפ פיפטה 10 μl ולאסוף כמה חילוף יונים כלורידיחרוזים שרף על סופו להשרות אלה ירידה RA מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
- יש לשטוף את החרוזים שלוש טיפות רצופים של 100 μl בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) יוצבו באותו צלחת פטרי לפחות זה מזה 1 ס"מ.
הערה: החרוזים תופסים צבע אדום פנול מן DMEM. שיטה זו מבוססת על 5. - פיק חרוזים כ 100 מיקרומטר קוטר (חרוזים טווח בגודל 75-180 מיקרומטר כאשר רטוב) להכנסה לתוך העובר, באמצעות שקופיות מיקרוסקופ הבמה graticule תחת microforceps צלחת פטרי No.5 להחזיק את החרוזים. כאשר להרים החרוז מירידת 100 μl של DMEM, מלכתחילה במורד חרוז על צלחת הפטר ולהסיר כל DMEM הנותרים ממנו או על ידי לחיצה על החרוז מתוך הירידה או על ידי הצבת המלקחיים הסגורים ליד החרוז (נימים פעולה שואבת את הנוזל מן החרוז).
- BMS 493
- באשר RA (2.3.2), יש להשרות Exch יוןחרוזים ange שרף בטיפת 100 μl של 2.5 או 5.0 מ"ג / מ"ל BMS 493 ב DMSO בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף ב 100 טיפות μl של DMEM. פיק חרוזים כ 100 מיקרומטר קוטר להכנסה לתוך העובר.
- שליטת DMSO
- באשר RA (2.3.2), יש להשרות חרוזים שרף חילוף יונים בטיפת 100 μl של DMSO בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף ב 100 טיפות μl של DMEM. פיק חרוזים כ 100 מיקרומטר קוטר להכנסה לתוך העובר.
- FGF4
תפעול 3. גדר חרוזה
באיור 1. שרטוטים של צ'יק עובר שלבים שונים מציגים איפה חסמים או חרוזים צריכים להיות ממוקמים. (א) שלב 13 מראה מחסום סכמטי חומוס העובר עמדה (הקו הירוק) בין somites ו LPM בבית presumpרמת כנף מופרזת (somites 15-20). (ב) באותו סכמטית כמו ב (א), המציין היכן חרוז RA (עיגול אדום) צריך להיות ממוקם לפני הרכבתן מכשול. (ג) עמדה מראה מחסום סכמטי (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת (somites 26-32) בעובר בשלב 15. (ד) אותה סכמטית כמו (C), המציין היכן חרוז RA (עיגול אדום) צריך להיות ממוקם. (E) סכמטי המציין היכן BMS 493 חרוזים (עיגולים סגולים) צריך להיות ממוקם בתוך LPM של עובר שלב 15. (F) סכמטי בתרשים של עובר אפרוח שלב 9 המציין עמד מחסום (קו ירוק) בין mesoderm ו LPM presomitic ברמת האגף המשוערת. (G) סכמטי בתרשים של עובר בשלב 9 מראה את העמדות של מחסום (קו ירוק) חרוז RA (עיגול אדום). (H) סכמטי בתרשים של עובר אפרוח שלב 10 המוצגת מיקום מכשול (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת. (אני 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- גדר מוכנסת בשלב 13 כדי למנוע ייזום ניצן כנף.
- קח העובר בשלב 13 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף. הסר את השכבה העליונה של קלטת ברורה.
- בעזרת סכין מיקרו פלדה, עושים חתך דרך הממברנה vitelline והמזודרם צלחת לרוחב (LPM) סמוך somites 15 עד 20 (איור 1 א) בצד ימין של העובר (somites יש לא כל נוצר בשלב זה). חותכים סמוך ארבעה somites האחרון יצרו וממשיכים אורכי somite לחתוך שני caudally.
- תרימי את המכשול (0.7-1 מ"מ רוחב) עם microfo מס '5rceps בסוף הבולט מצלחת הפטר ולסובב את היד כדי להכניס את הקצה החופשי של המכשול לתוך החתך. המכשול בצורת הציר שוכב על הממברנה vitelline מעל LPM עם חצי ממנו בולט כלפי מטה דרך דיסטלי חתך את somites. סמוך ככל האפשר לאטום את הביצה עם קלטת ברורה ולהחזיר אותו אל האינקובטור.
הערה: סכין מלקחיים מיקרו להיות דביק על קשר עם קרום vitelline. חשוב לנגב אותם נקיים עם אתנול 70% לפני שתנסה מבצע שלאחר מכן. זה חל על כל תיאורי הפעולה העתידיים כדי חרוז השתלות. - אם חרוז הוא להיות מוכנס בשיתוף עם מחסום; ראשית, לקחת את החרוז הזה microforceps מס '5 ו להכניס אותו לתוך הפנים חתך של LPM בצד הדיסטלי של חתך ולאחר מכן הכנס את המכשול לתוך הפרוקסימלי חתך חרוז (איור 1B). חותם את הביצה ולהחזיר אותו מיד אל האינקובטור.
- גדר מוכנסת בשלב 15 עד למנוע התחלת ניצן רגל.
הערה: דוגמה את התוצאה של פעולה זו על גורם שעתוק Tbox 4 (Tbx4) ביטוי מוצג באיור 2 ד ו 2E.- קח העובר בשלב 15 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף. הסר את השכבה העליונה של קלטת ברורה.
- בעזרת סכין מיקרו פלדה עושים חתך דרך הממברנה vitelline ו LPM סמוך somites 26 עד 32 (איור 1 ג) על הצד הימני של העובר (somites יש לא כל נוצר בשלב זה). חותכים בצמוד שני somites האחרון יצרו וממשיכים אורכי somite לחתוך חמש caudally.
- תרים את המכשול (1.2-1.3 מ"מ רוחב) עם המס '5 microforceps בקצה אחד ולסובב המכשול להכניס את הקצה החופשי לתוך החתך. סמוך ככל האפשר לאטום את הביצה עם קלטת ברורהnd להחזיר אותו אל האינקובטור.
הערה: הציר בצורת מחסום שוכב על הממברנה vitelline מעל LPM עם חצי ממנו בולט כלפי מטה דרך דיסטלי חתך את somites. - אם חרוז הוא להיות מוכנס בשיתוף עם מחסום, ראשית, לקחת את החרוז הזה microforceps מס '5 ו להכניס אותו לתוך הפנים חתך של LPM בצד הדיסטלי של חתך ולאחר מכן הכנס את המכשול לתוך הפרוקסימלי החתך החרוז (1D איור). חותם את הביצה ולהחזיר אותו מיד אל האינקובטור.
- אם חרוז או חרוזים הם להיות מוכנס ללא מחסום, למשל, חרוזים BMS 493 לאזור הרגל בשלב 15, לא עושים את החתך הארוך (3.2.2.1). לעשות חתך קטן דרך הממברנה vitelline ולתוך LPM במיקום החרוז הוא יוצב. קח את חרוז microforceps מס '5 ו להכניס אותו לתוך החור LPM. לדחוף אותו עוד קצת עם הקצוות סגורים של מלקחיים (איור 1E).
- גדר מוכנסת בשלב 9 למנוע אינדוקצית ניצן כנף וייזום.
- קח שלב 8 או 9 העובר מן החממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדפת.
- בעזרת סכין מיקרו פלדה עושים חתך דרך הממברנה vitelline ו LPM לרוחב מקורי התכונה הראשונית, בסוף הזנב של העובר עולה בקנה אחד עם somites (איור 1F) כ -5 somite אורכים זמן רב.
- תרים את המכשול (0.7-1 מ"מ רוחב) עם microforceps מס '5 בסוף הבולט מצלחת הפטר ולסובב את היד כדי להכניס את הקצה החופשי של המכשול לתוך החתך. סמוך ככל האפשר לאטום את הביצה עם קלטת ברורה ולהחזיר אותו אל האינקובטור.
הערה: הציר בצורת מחסום שוכב על הממברנה vitelline מעל LPM עם חצי ממנו בולט כלפי מטה דרך החתך. - אם חרוז הוא להיות inserteד בשיתוף עם מחסום; ראשית, לקחת את החרוז הזה microforceps מס '5 ו להכניס אותו לתוך הפנים חתך של LPM בצד הדיסטלי של חתך ולאחר מכן הכנס את המכשול לתוך הפרוקסימלי חתך חרוז (איור 1G). חותם את הביצה ולהחזיר אותו מיד אל האינקובטור.
- קח שלב 8 או 9 העובר מן החממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדפת.
- גדר מוכנסת בשלב 10 כדי למנוע אינדוקציה וייזום ניצן רגל.
הערה: דוגמא את התוצאה של פעולה זו על ביטוי Tbx4 מוצגת באיור 2G.- קח העובר בשלב 10 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף.
- בעזרת סכין מיקרו פלדה עושים חתך דרך הממברנה vitelline ו LPM לרוחב התכונה הראשונית, בסוף הזנב של העובר עולה בקנה אחד עם somites (איור 1H) כ 6 somite אורכים זמן רב.
- תרים את המכשול (1.2מ"מ רוחב) עם microforceps מס '5 בסוף הבולט מצלחת הפטר ולסובב את היד כדי להכניס את הקצה החופשי של המכשול לתוך החתך. סמוך ככל האפשר לאטום את הביצה עם קלטת ברורה ולהחזיר אותו אל האינקובטור.
הערה: הציר בצורת מחסום שוכב על הממברנה vitelline מעל LPM עם חצי ממנו בולט כלפי מטה דרך החתך. - אם חרוז הוא להיות מוכנס ללא מחסום, למשל, חרוז BMS 493 לאזור הרגל בשלב 10, לעשות חתך קטן דרך הממברנה vitelline ולתוך LPM במיקום החרוז הוא יוצב. קח את חרוז microforceps מס '5 ו להכניס אותו לתוך החור LPM. לדחוף אותו עוד קצת עם הקצוות הסגורים של המלקחיים (איור 1 ט).
- קח העובר בשלב 10 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף.
- 24 שעות או יותר לאחר ההפעלה לבדוק את המיקום של המכשול בהשוואת ניצן האיבר הנגדי המתעוררים. לבטל את כל העוברים בו דווקא הקמת המכשול הוא בבירור לא opposITE באיבו איבר שמאל. במקרה זה המכשול כבר ממוצבת בצורה שגויה.
4. קציר עוברים, קיבוע והכנה Wholemount הכלאה באתרו (בכך)
- עובר קציר לפרסם פעולה.
- עובר קציר בשלב 19-23 כך מורפולוגיה איבר ניצן נראית בבירור בשני הצדדים השליטים פעלו נגדיים.
- במספריים מעוגלים באמצעות חור גדול בתוך קליפת הביצה. חותכים סביב העובר בעת החזקת כלי דם גדול בצד שמאל של העובר עם microforceps. השתמש אחיזה זו של כלי להסיר את העובר ומניחים אותו בצלחת פטרי של בופר פוספט (PBS) pH 7.3.
- תחת מיקרוסקופ משקפת, לנתח משם כלי עוברי נוסף ממברנות באמצעות שילוב של מספריים מעוקלים ולא. 5 microforceps. הסר את הראש באמצעות מספריים.
- עובר קציר בשלב 19-23 כך מורפולוגיה איבר ניצן נראית בבירור בשני הצדדים השליטים פעלו נגדיים.
- קיבוע של עובר לפרסם קציר.
- שימוש blun מעוקלמלקחיים t, להרים את העובר ומניחים אותו ב 5 מ"ל paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי שעות נדנדה ולאחר מכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתוך בקבוק זכוכית 20 מ"ל עם ראש מתברג.
זהירות: PFA הוא מפגע בריאותי. זהו גירוי מזיק, מאכל ואת אבקת יש למנוע מלבוא במגע עם העור, העיניים והריאות. השתמש ביגוד מגן אישי במנדף בעת הכנת הפתרון. ברגע שזה פתרון 4%, כפפות, הגנה וחקר העיניים חלוק מעבדה חייב להיות משוחק.
הערה: חשוב לקבל את העוברים למצב ביש במהירות הטובה ביותר לשמור על שלמות mRNA.
- שימוש blun מעוקלמלקחיים t, להרים את העובר ומניחים אותו ב 5 מ"ל paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי שעות נדנדה ולאחר מכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתוך בקבוק זכוכית 20 מ"ל עם ראש מתברג.
- הסרת מחסומים לפני wholemount הכלאה באתרה.
הערה: מחסומי מוסרים כי הם חדים ויכולים לגרום נזק עוברי כמו שהם הולכים דרך בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד אם עוברים כמה מגואלות בבת אחת.- בעקבות קיבעון, למקם את העובר בצלחת של PBS תחת מיל המשקףcroscope.
- באמצעות שני זוגות של 5 microforceps המס, למקם את הזוג עזב מקרוב משני צדי המחסום בצד המופעל של העובר. אחוז המכשול עם הזוג ימינה משוך בעדינות את המחסום מעובר באמצעות הזוג עזב כדי לשמור על העובר למטה ולמנוע כל רקמת דבקות המכשול כפי שהוא מוסר.
- לקיים את הנדר בעצם כמתואר 11.
- קח העובר בשלב 15 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף. הסר את השכבה העליונה של קלטת ברורה.
- קח העובר בשלב 13 מהחממה ומניח את הביצה על שאר ביצה תחת מיקרוסקופ משקפת מוגדרת גדלת 3.2X ומעלה אם מועדף. הסר את השכבה העליונה של קלטת ברורה.
Representative Results
הפרוטוקול המפורט לעיל מתאר את השיטות הננקטות ואח Nishimoto. , 2015. המחקר בוחן אינדוקצית ניצן איבר וייזום הוא מלפנים hindlimb של עובר החומוס. תוצאות בעקבות החדרת מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע את התולדה של ניצן forelimb פורסמו 1 בעבר, 2, 9 אך חלו רק מחסומים באחד מחקרים מתארים מניעת ייזום ניצן רגל 1. נתוני Hindlimb מאל et Nishimoto. , מוצגים כאן כתוצאות נציג 2015 על בדיקת ביטוי mRNA לאחר החדרת מכשול.
הביטוי Tbx4 ב LPM אינו מספיק כדי ליזום Hindlimb תולדה:
דמויות 2B ו- C (טבלה 2) להראות כי החדרת מחסום בשלב 15 (איור 2 א) (ראה פרוטוקול 3.2) מוביל הן Fgf10ביטוי Fgf8 נעדר באזור ניצן הרגל (כונה על ידי סוגר) בצד ימין פעל. השוואה עם הצד השמאלי unoperated. עם זאת, הביטוי Tbx4 הוא ציין בשני שלב 19 ושלב 23 בצד המופעל (איור 2 ד ו E). אנו מסיקים כי הביטוי Tbx4 לבדו אינו מספיק כדי ליזום תולדה hindlimb מן LPM. מחקרים אחרים האפרוח הראו כי ביטוי גני Tbx מספיק כדי ליזום ניצן forelimb היווצרות 12, 13.
איור 2 ג 'כלול כדי להמחיש כיצד מחסום נראה המוטבעת באזור הרגל של קיבעון פוסט העובר. ברוב המכריע של המקרים המחסומים הוסרו לפני הכלאה באתרו (פרוטוקול 4.3).
RA מן somites חיונית LPM לפני Fgf10 גורם לימב באד Outgrowth:
איור 3 א הוא סכימטי המייצג תוספת של דיסטלי חרוז ספוג RA כדי מחסום מוכנס בשלב 15 (פרוטוקול 3.2.1.3). לאחר תולדה המבצע איבר ניצן זה (מסומן בכוכבית) הוא ציין בצד ימין פעלו Tbx4, Fgf10 ו Fgf8 באים לידי ביטוי ניצן כפי שהם נמצאים בצד יצא משליטת (איור 3B, C ו- D, טבלה 2) . לכן תוספת של RA אל LPM מתגברת על השפעת תמורת ייזום ניצן המחסום ובשלמות גופם. אנו מסיקים כי ב- RA התפתחות נורמלית מן somites חיונית LPM לפני תולדה ניצן איבר יכול להיות יזם. ניצני hindlimb וכתוצאה מכך הם בדרך כלל קטנים יותר מאלה בצד השליטה. זה יכול להיות בגלל מינון RA ב LPM להיות לא שווה את מצב הסוג הבר. אם מינון RA מדי גבוה Apical Ectodermal רידג '(AER) יכול להתקצר וניצנים קטנים יביאו14, 15.
כדי לאשר RA (מתוך somites) ב LPM נדרש ייזום ניצן איבר רגיל אגוניסט ההופכי של RAR, BMS 493, היה בשימוש. חרוזים הם מושתלים לתוך LPM באזור הרגל בשלב 15 (ראה פרוטוקול 3.2.1.4) (3E איור). ביטוי Fgf10 הוא downregulated היישום הבא של BMS 493 חרוזי LPM, וכתוצאה מכך ניצני hindlimb קטנים יותר בהשוואה בצד הביקורת (האיור 3F; טבלה 3). חרוזים בקרה DMSO לא לגרום למומים אלה (איורים 3G ו 3H; טבלה 3). הפגמים שנצפו בעקבות יישום BMS 493 הם מתונים יותר מאלה המושרים על ידי פעולת מחסום; כלומר, Fgf10 עדיין הביע וניצני איבר נוצרים. זה עשוי להיות בגלל ההשפעות של BMS 493 מוגבלים מקומית סביב חרוזים לא יוכלו להרגיז כל RA המיוצר על ידי AXIרקמות al.
מוקדם איתותי Axial ציינו את תאי LPM כי מאוחר יותר מהיר, Tbx4:
בדקנו כאשר LPM רוכש יכולתה להביע Tbx4 באזור הפוטנציאלי יוצרי הרגל. השלב המוקדם בו מחסום יכול להיות מוכנס כי לאחר מכן יחסום תולדת ניצן רגל, הוא שלב 10. אנחנו הראשונים לפתח פרוטוקול להכניס מחסומים בשלבים מוקדמים יותר בשלב 12. מחסומים המוכנסים בין mesoderm הפרקסיאלית והרגל המשוערת LPM בשלב 10 (ראה פרוטוקול 3.4) היווצרות ניצן לחסום רגל ואת הביטוי של Tbx4 ב יוצרי רגל LPM (איורי 2F ו 2G, טבלה 2), דבר המצביע על כך אות מרקמות ציריות בשלב 10 נדרשת עבור ביטוי מאוחר יותר של Tbx4 ב LPM hindlimb. שקול את התוצאה הזאת עם 2D הדמוי ו- E שבו כניסת מחסום מאוחר יותר מאפשרת ביטוי Tbx4שיוקם. יתר על כן, בדקנו אם האות צירית זה יכול להיות RA על ידי התבוננות אם אגוניסט ההופכי של RAR מפחית ביטוי Tbx4. אגל BMS 493 להציב LPM hindlimb בשלב 10 (ראה פרוטוקול 3.4.1.3) downregulates ביטוי Tbx4 (איורים 2H ו 2I), ואילו חרוזים מלאה טבול DMSO לא משפיעים על ביטוי Tbx4 (2J דמויות 2K). יחד, תוצאות אלו תומכות מודל אות RA מרקמות ציריות מסדיר אינדוקצית איבר ידי ויסות Tbx4 באופן חיובי hindlimb LPM 7.
מוות לאחר ניתוח:
לוחות 1, 2 ו -3 מעבירים את הפרטים של תוצאות הניסוי כולל מספר העוברים גוזל מת פוסט תפעול לפני הקטיף. כמה מקרי מוות יש לצפות לאחר מיקרוכירורגיה מסוג זה. יכולים להישמר גוססי המספרים עד למינימום על ידי וודא כי מכשירים הם נקיים, חור הביצה הוא חייב את הגודל המינימאלי, כי עובר נותרים ללא הגנה על חותם הסרט הדביק במשך זמן מינימאלי, בשיתוף עם הנקודה אחרונה זו שהפעולה מתבצע מהר ככל האפשר. אף אחד פעילויות אלו הינן מאוד זמן רב אך פעולות מעורבים חרוזים ומחסומים לקחת קצת יותר זמן. על אף האמצעים הללו, פעולות שבוצעו בשלבים המוקדמים ואלה באזור הכנף נוטים יותר לגרום למוות. ישנם כלי דם גדולים ברחבי להרכיב אזורי הגפה קרע בשוגג של כולים אלה עלולים להוביל למוות כתוצאה מאיבוד דם. אנו מוצאים כי ביצים נפתחו בשלב 8 או 9, אשר עובר לא נותח, לעתים קרובות למות על ידי למחרת. לכן, הפתרון היחיד לבעיות אלה הוא לבצע מספר גבוה של ניסויים.
ד / 54,618 / 54618fig2.jpg "/>
איור 2. מרקר ג'ין שינויי ביטוי הבא מכשול או בהכנסת חרוז בשעה משוערת רגל הרמה. (א) סכמטי המציג מחסום עמדה (קו ירוק) ברמת רגל המשוערת (somites 26-32) בעובר בשלב 15. (B - E ו- G) ניתוח מאחל עובר פעל. אזור הרגל מתואר (בסוגריים). (ב) ביטוי Fgf10 נעדר LPM פעל, אך ביטוי חזק מזוהה באיבו השמאל. (ג) הביטוי Fgf8 התאור בצד המופעל, דבר המצביע אין AER. (ג ') אותו העובר לפני המכשול הוסר. (ד) Tbx4 מתבטא LPM באותה רמה rostro- הזנב כמו ניצן שליטה. (E) ביטוי Tbx4 נשמר באזור רגל ימין למרות היעדר צמיחה איבר. (F) תרשים סכמטי של שלב 10 עוברים אפרוח המוצגת מיקום מכשול (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת. (G) ביטוי Tbx4 נעדר פעל התקין LPM (הסוגר). (H) סכמטי בתרשים של עובר אפרוח שלב 10 מראה BMS 493 עמדת חרוז (עיגול סגול) ברמת הרגל המשוערת. (I) ביטוי Tbx4 הוא downregulated בצד ימין המופעלים בעקבות טיפול עם BMS 493. (J) תרשים סכמטי של עובר חומוס שלב 10 המוצגת מיקום חרוז מלא DMSO (עיגול אפור). (K) Tbx4 מתבטא בצד ימין פעל ברמה דומה לזו של אגף שמאל שפעה לאחר טיפול עם DMSO לבד. נתון זה יש הבדל בין 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ד / 54,618 / 54618fig3.jpg "/>
מציל איור 3. RA ההיעדרות של לימב באד נגרמת על ידי מכשול הכנסה והוא חיוני LPM לפני Leg באד התולדה. (א) תרשים סכמטי המציין עמד מחסום (קו ירוק) ברמת הרגל המשוערת (somites 26-32) וכן חרוז RA-ספוג (עיגול אדום). (B - D) RA מציל תולדת ניצן רגל (שמוצג על ידי כוכבית). (ב) ביטוי Tbx4 שוהה ניצן הרגל הציל דומה בצד un המופעל. (C) Fgf10 מתבטא הרגל הציל ניצן דומה בצד המופעלים האו"ם. (ד) Fgf8 מתבטא AER של ניצן רגל ימין הציל. (E) סכמטי המציין היכן חרוזי 493 BMS (עיגולים סגולים) הונחו LPM הרגל המשוער של שלב 15 עובר. (F) ביטוי Fgf10 הוא downregulated בצד ימין המופעלים ואת ניצן הרגל הוא הבא הקטן BMS 49טיפול 3. חרוזים הם asterisked. (G) סכמטי בדומה (E), המציין את המיקום של חרוזי DMSO מלאים (עיגולים אפורים). (H) חרוזים DMSO (שמוצג על ידי כוכביות) לא משפיעים על ביטוי Fgf10 או גודל ניצן הרגל. נתון זה יש הבדל בין 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מחסום שלב להציב (חרוז +) * | פעל מספר | אגף חסר ** | אגף הנוכחי ** | מת מספר |
| שלב 12-14 | 40 | 24 | 1 | 15 |
| שלב 8/9 | 65 | 23 | 0 | 42 |
| שלב 12-13 (חרוז FGF4) | 41 | 7 (חסר חרוז) | 17 | 17 |
| שלב 12-13 (חרוז ע"ר) | 75 | 9 (חסר חרוז) | 32 | 34 |
| שלב 13 (חרוז שליטה) | 5 | 3 | 0 | 2 |
| * מחסומי רדיד 0.7-1 מ"מ ממוקמים בין somites 15-20 ואת mesoderm הצלחת לרוחב. 0.35 מ"ג / מ"ל חרוז FGF4. 0.05-0.1 מ"ג / מ"ל חרוז RA. | ||||
| חרוז מלא DMSO. | ||||
| ** צ'יק עוברים קבועים בשלבים 21-23 | ||||
טבלת 1. גדר תוצאות ניסוי ביד רמת כנף.
| מחסום שלב להציב (חרוז +) * td> | פעל מספר | רגל חסר ** | רגל הנוכחי ** | מת מספר |
| שלב 12-15 | 43 | 39 | 0 | 4 |
| שלב 10/11 | 23 | 16 | 0 | 7 |
| שלב 15 (חרוז FGF4) | 8 | 0 | 5 | 3 |
| שלב 15 (חרוז ע"ר) | 18 | 0 | 18 | 0 |
| * מחסומי רדיד 0.7-1.3 מ"מ ממוקמים בין somites 26-32 ואת mesoderm הצלחת לרוחב. 0.35 מ"ג / מ"ל חרוז FGF4. 0.05-0.1 מ"ג / מ"ל חרוז RA. | ||||
| ** צ'יק עוברים קבועים בשלבים 18-24 | ||||
טבלת 2. גדר תוצאות ניסוי ביד רמת רגל.
| פעל מספר | Leg ניצן קטן | Leg ניצן מעט קטן | Leg ניצן בגודל רגיל | מת מספר |
| BMS 493 חרוזים * | ||||
| 15 | 12 | 3 | 0 | 0 |
| חרוזי DMSO ** | ||||
| 12 | 0 | 3 | 9 | 0 |
| * 2-3 חרוזים ספוגים 5 מ"ג / מיליליטר BMS 493 להציב LPM בימין במה 14-15 ברמת רגל. | ||||
| ** 2-3 חרוזי ספוגת DMSO להציב לבד בשלב 15 LPM התקין ברמת רגל. | ||||
| עובר צ'יק קבוע בשלבים 17-19. | ||||
לוח 3. רגל רמת BMS 493 חרוז ניסוי תוצאות.
Discussion
אנו מתארים את השימוש של מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע היווצרות ניצן איבר בעובר האפרוח. טכניקה זו יש מספר שלבים קריטיים. בעקבות ניסויים ראשוניים, מצאנו כי המחסומים בצורת הציר בשימוש 9, 10 להישאר במקום בעובר הרבה יותר טוב מאשר מחסומים ישר. הצד השטוח הדיסטלי של המכשול מקלות על קרום vitelline ושומר המכשול במקום (איור 2 ג '). הכנה קפדנית של מחסומים בצורת ציר מרדיד אלומיניום כמתואר בשלב פרוטוקול 1.6 חיונית להצלחת הניתוח. צעד חשוב שני הוא להבטיח כי ביצים הם לא עזבו מתוך האינקובטור במשך זמן רב מדי לאחר חלונאית, וביום לפני ההפעלה על העובר. מניסיוננו, עובר לשרוד פעולה טוב יותר אם הם ליד או טמפרטורת דגירה כאשר הניתוח מבוצע. תפעול ולכן צריך להתבצע במהירות האפשרית ואת הביצים resealed הפקודהly כדי להבטיח שיעורי הישרדות טובים. חוקרים רבים מוסיפים טיפת אנטיביוטיקה לעובר הבאים המיקרו-כירורגיה לפני שחזר את הביצים באינקובטור. הנוכחות של הנוזל מנעה את המחסומים יידבק גם בעמדה. תוספת של אנטיביוטיקה יכולה גם לסלק חרוזים לאחר מיקום. לכן לא באמצעות אנטיביוטיקה, פעולות מהירות וניקיון טוב עם מכשירים מומלצים להימנע מהידבקות. ניגוב מכשירים עם אתנול 70% לאחר כל שלב של מבצע חיוני כדי למנוע מכשירים מלהפוך דביק ממגע עם קרום vitelline אשר יכול לגרום הן מחסומים או חרוזים לדבוק מלקחיים (ראה פרוטוקול צעד 3.1.2.2). זנים שני חרוזים בשימוש עלול ליפול מחוץ למקום לאחר הניתוח. כאשר עמד מחסום נבדק למחרת לא ניתן היה לראות מבעד למחסום כדי לברר אם החרוז נשאר במקום או לא. במקרים בם החרוז הסתכסך תולדת ניצן כנף לא חולץ ( פרוטוקול זה משנה ניסויים שפורסמו בעבר כי השתמשו מחסומים כדי למנוע ייזום ניצן איבר, מגדיר רוחב אופטימלי ספציפי מחסומים ומציג מיקום מכשול חרוז שילוב ואחריו ניתוח ביטוי גנים. מצאנו באמצעות רדיד אלומיניום קונבנציונלי, שהוא זול וזמין בכל המעבדות, מגיע לתוצאות שווות לאלה שהשתמשו בעבר רדיד טנטלום. רדיד ניתן להשאיר את העובר בעת ביצוע הכלאה באתרו (איור 2 ג ') אבל אנחנו בדרך כלל להסיר אותו אם יש יותר העובר אחת מעובדת כדי למנוע קצוות חדים של רדיד נזק עוברי. Pמחקרי Ilot הוכיחו כי הרוחב של מחסומים באזור ההרגל חשוב במיוחד. בתחילה המחסומים trialed היו קצרים מדי תולדת ניצן רגל לא נמנעה. 1.2-1.3 מ"מ הוא הרוחב האופטימלי עבור מחסום לחסום תולדת ניצן רגל לחלוטין. מחסומי הזרוע הצרים ביותר שאפשר למקם במדויק כדי למנוע תוצאת ניצן לתת שיעורי ההישרדות הטובים ביותר. זה יכול להיות צר ככל 0.5-0.7 מ"מ. עם זאת, חסמים הם קצת רחבים יותר יש סיכוי גבוהים יותר לגרום חסימה מוחלטת של תולדת ניצן כנף משום שהם מאפשרים דיוק קטן של מיקום (השתמשנו 0.7-1 מ"מ). הימנעות של כלי דם בעת ביצוע החתך היא קריטית עבור מחסומי רמת ניצן כנף. מחסומים חדיר למחצה שימשו בעבר כדי לחצות את ניצן איבר חומוס. MacCabe ופארקר, 1976 Summerbell 1979 הוא בשימוש מסננים 0.45 מיקרומטר ו 0.8 מיקרומטר גודל נקבובי, בהתאמה 16, 17. הם דיווחו כי אותות diffusible יכולים לעבור דרך הנקבובית מסנן וכיתוצאות מתבצעות באמצעות מחסומים חדירים למחצה היו באמצע דרך בין ניצן אבר ללא מכשול נוכחי ואחד עם מחסום רדיד טנטלום בלתי חדיר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש מחסומים חדירים למחצה של גודל נקבובי שונה כדי להבחין בין אותות מועמד על בסיס גודל או לשנות את הדינמיקה של דיפוזיה אות. פרוטוקול זה יש מגבלות שונות הקשורות בעיקר עם אורגניזם המודל עצמו. טכניקות אלו יכולים לשמש כדי לחקור שאלות נוספות בפיתוח איבר וגם שאלות אחרות של עובר החולייתנים. תנאים מיוחדים הוא שהאיבר / השטח מדובר יש לפתח כאשר עוברים האפרוח נגיש התערבות. הנוכחות של כלי הדם הגדולים באזור שבו מחסום צריך להיות ממוקם עושה מיקום המכשול יאוחר בשלב 13 או 14 מאתגר מבחינה טכנית. אם כלי דם גדולים נחתכים במהלך השמת המחסום הזה יכול לגרום לתמותה עוברת. הבדיקות שערכו לגבי כאשר שעתוק גורמי Tbx5 ו Tbx4 הם מושרה הראשון LPM היה מוגבל על ידי השלב המוקדם שבו נוכל למקם מחסום יגיע בסופו ההפך גם באגף או ניצן רגל בהתאמה. זה עשוי להיות מאלף כדי לנסות לחסום אינדוקציה גן Tbx בשלבים מוקדמים יותר, קרוב יותר gastrulation. המוקדם מחסום יכול להיות ממוקם באזור הכנף המשוער היה בהצלחת שלב 8 ובשלב הרגל באזור 10. פרוטוקול זה הוא כנראה לא מתאים ללימוד ביטוי גנים מעבר בשלבי ניצן איבר בגלל צמיחה מהירה שלאחר מכן תחליף את המחסום ותוצאות יתייחס רק העמדה הראשונית של המכשול. לאחר הקשורים במגבלות של עובר החומוס בהקשר זה, יתרונות על אורגניזמים מודל חוליות אחרים הם רבים. העובר החומוס הוא מודל חיה מאוד מתאים לסוג זה של התערבות פיזית בעובר חוליות. העוברים הם יחסית גדולים והם נגישים בקלות throuGH קליפת הביצה. אפשר לחזור העובר לניסויים נוספים (למשל, הסרת חרוז 18 או אפילו מחסום) או כדי לבדוק את ההתקדמות על ידי הסרת חלון הקלטת. יש היקף ניתן לכלול הדמיה לחיות או הדמיה זמן לשגות. אנו מתארים שיטה של חלונאית ביצי תרנגולת כי הוא מתאים במיוחד פועלים בעוברים בראשית התפתחותם. במקרה של מחקרי איבר חשוב מאוד ומועיל כי קיים איבר מלא נגדי עבור כל ניסוי, המהווה נקודת בקרה פנימית אידיאלית עבור כל לשכפל ביולוגי. השילוב של שימוש מחסומים בלתי חדירים כדי למנוע תוצאת איבר וחרוזים טבול מולקולות איתות לא דווח בעבר. הניתוח שלנו של ביטוי mRNA לאחר התערבויות כאלה הוא גם רומן. טכניקות אלו אפשרו לנו לנתח את הבעיה הקשה של מתי שעתוק איבר ספציפי גורמי Tbx5 ו Tbx4 הם המושרה LPM וגםלהראות כי מאוחר יותר, לפני אחר ענף חניכת ניצן, בנוכחות גני Tbx אלה LPM אינה מספיק עבור הפעלת שעתוק Fgf10 ואת תחילת תולדת ניצן איבר. דמויות 2G, 2D and 2E להמחיש הממצאים האלה היטב. עדר ביטוי Tbx4 בעקבות החדרת מחסום בשלב 10 ב 2G האיור הוא בניגוד מוחלט נוכחותה 2D ו 2E הבא החדיר מחסום בשלב 15, לאחר הגיוס של Tbx4. השתלת חרוזים ספוג RA הקל הצלת ייזום ניצן איבר בעקבות החדרת מחסום וכך נקודות כדי RA מן somites להיות חיוני LPM לפני תולדה ניצן איבר יכול להתחיל. שיטות אלו יכולים לשמש כדי לפתור שאלות נוספות בפיתוח איבר אלא גם שאלות אחרות של עובר החולייתנים. אזורים במוח, העין וגו צפויים להיות מתאים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
