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Developmental Biology

उम्मीदवार फैक्टर लथपथ मोती के साथ संयुक्त अभेद्य बाधाओं के आवेदन लड़की में आगमनात्मक संकेतों का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/54618 Published: November 17, 2016

Abstract

लड़की भ्रूण एक शानदार कशेरुकी मॉडल है कि एक सीधे रास्ते में विकासात्मक सवाल काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसकी पहुंच और मजबूती शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप निम्न कुंजी प्रयोगात्मक ताकत हैं। मीका प्लेटों पहली लड़की अंग कली दीक्षा 1 रोकने के लिए इस्तेमाल बाधाओं थे। प्रोटोकॉल है कि दक्षिणपंथी कली या पैर कली प्रेरण और या दीक्षा के लिए एक अभेद्य अवरोध के रूप में एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग वर्णित हैं। हम आपूर्ति उम्मीदवार अंतर्जात कारक है कि बाधा द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया है exogenously के लिए बाधा को मनका प्लेसमेंट के पार्श्व के साथ इस तकनीक गठबंधन। परिणाम बाद में जीन अभिव्यक्ति की स्वस्थानी संकरण में उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं। हमारा मुख्य ध्यान प्रेरण में retinoic एसिड संकेतन और लड़की भ्रूण सामने और hindlimb के बाद दीक्षा की भूमिका पर है। हम बीएमएस 493 का उपयोग करें (retinoic एसिड रिसेप्टर्स की एक उलटा एगोनिस्ट (RAR)) लथपथ पार्श्व प्लेट mesoderm (LPM) में प्रत्यारोपित मोती एक बार के प्रभाव की नकल करने के लिएrier somites (retinoic एसिड का एक स्रोत (आरए)) और LPM से अंग कलियों बढ़ने के बीच रखा। इन प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण भी मूल और प्रेरक संकेतों के समय पर अन्य प्रश्न के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परंतु लड़की भ्रूण के क्षेत्र प्रासंगिक विकास के चरण में पहुँचा जा सकता है, एक बाधा दो ऊतकों और विकास में परिणामी परिवर्तन का अध्ययन बीच में रखा जा सकता है। उदाहरण ऐसे जिगर या गुर्दे की प्रेरण के रूप में, विकासशील मस्तिष्क, एक्सिस विस्तार में और अंग विकास में पाया जा सकता है।

Introduction

शास्त्रीय embryologists पारंपरिक रूप से तंत्र भ्रूण के विकास को नियंत्रित करने से पूछताछ करने के भौतिक तकनीक कार्यरत हैं। 1960 के दशक और 1970 के दशक में जांचकर्ताओं तकनीक है कि विकासशील भ्रूण के ऊतकों के बीच डाला embryogenesis दौरान प्रेरक संकेतों के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए अभेद्य अवरोध का उपयोग किया विकसित की है। हमारे हित कशेरुकी अंग विकास में और विशेष रूप से है क्या घटनाओं पूर्व में होना अंग कली परिणाम। उदाहरण के लिए, एक बाधा की प्रविष्टि लड़की भ्रूण के एक तरफ से होने वाली है, जबकि यह सामान्य रूप से contralateral, unoperated पक्ष पर आगे बढ़ने के लिए इजाजत देने से अंग कली परिणाम रोका जा सकता है। इन बाधाओं को विविध बनाने के लिए इस्तेमाल सामग्री, उदाहरण के लिए, अभ्रक प्लेटों 1 और टैंटलम पन्नी 2। इन बाधाओं को प्रभावी ढंग से पार्श्व प्लेट mesoderm (LPM), अंग कली रूपों, somites से paraxial mesoderm से गठित जिसमें से अलग। सर्जिकल ग्राफ्टिंग तकनीक है कि निकट सहयोग से बुद्धि का प्रदर्शनज somites यदि अंग कली दीक्षा LPM 3 4 में होने के लिए आवश्यक है। 80 और 90 के दशक में विकासात्मक जीव अणुओं है कि विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करने में आवश्यक हैं संकेत प्रसारण की खोज की। इन संकेतन अणुओं से लथपथ मोती भ्रूण के विशिष्ट क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और भ्रूण विकास के लिए परिवर्तन का उत्पादन। उदाहरण के लिए, retinoic एसिड (आरए) आयन एक्सचेंज मोती द्वारा हाथ में लिया है जब एक लड़की भ्रूण में प्रत्यारोपित और अंक 5 का दर्पण छवि दोहराव उत्पादन कर सकते हैं एक 24 घंटे की अवधि में जारी की है। हेपरिन एक्रिलिक FGF प्रोटीन युक्त मोती interlimb LPM 6 से अंग कली परिणाम आरंभ कर सकते हैं।

अभी हाल ही में माउस और मछली आनुवंशिकी एक नए युग (7 में समीक्षा) में कशेरुकी अंग दीक्षा के अध्ययन के लिए ले लिया है। अच्छा सबूत है कि somites अंग कली दीक्षा के लिए पूर्व में आरए उपस्थित आवश्यक प्रसारण संकेत एल.पी. द्वारा अपेक्षित है नहीं हैएम अंग नवोदित आरंभ करने के लिए। हम अंग कली दीक्षा के समय के आसपास LPM में जीन की अभिव्यक्ति पर बाधा आरोपण के प्रभाव काटना पहुँचा और लड़की भ्रूण की प्रयोगात्मक मजबूती का फायदा उठाने के लिए करना चाहता था। हमारे पद्धति का एक उपन्यास अनुकूलन एक बाधा गठबंधन करने के लिए है कि exogenously आपूर्ति उम्मीदवार अंतर्जात कारक है कि बाधा द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया है, के लिए बाधा मनका प्लेसमेंट के पार्श्व के साथ अक्षीय ऊतकों से ब्लॉकों का संकेत है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अंग कली प्रेरण और दीक्षा के तंत्र बाहर तंग करने के लिए विकसित होते हैं।

के अध्ययन के अंग कली दीक्षा प्रारंभिक चरण भ्रूण का प्रयोग होता है। पहले एक चमड़े के नीचे सुई के साथ हवा की थैली के माध्यम से एल्बुमिन से कुछ को हटाने से कई शोधकर्ताओं खिड़की चिकन अंडे। भ्रूण है, जो की जर्दी के शीर्ष पर स्थित है, तो अंडे में कम झूठ होगा। इस तरह के electroporation के रूप में कुछ तकनीक, के लिए एक फायदा है, लेकिन अगर भ्रूण की शल्य हेरफेर वांछित है एक नुकसान हो सकता है।हम भ्रूण के रूप में अंडे में खोलने के करीब होने लगता है संभव है एक फायदा है।

सवालों का संकेत है कि कशेरुकी अंग कली प्रेरण और दीक्षा नियंत्रण के बारे में रहते हैं और निम्नलिखित प्रोटोकॉल उन्हें संबोधित करने के लिए उपयुक्त हैं। हम पहले बाधाओं की प्रविष्टि चरण 12 8 से पहले एक मंच पर लड़की अंग कली परिणाम को रोकने के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण भी है, जहां एक सुलभ उत्प्रेरण के ऊतकों को उत्स प्रेरित किया जा रहा आसन्न निहित है उत्पत्ति और प्रेरक संकेतों के समय पर अन्य प्रश्न के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परंतु भ्रूण के क्षेत्र प्रासंगिक विकास के चरण में पहुँचा जा सकता है, तो एक बाधा दो ऊतकों और विकास में परिणामी परिवर्तन का अध्ययन बीच में रखा जा सकता है। उदाहरण ऐसे जिगर या गुर्दे की प्रेरण के रूप में मस्तिष्क के विकास, एक्सिस विस्तार और संभवतः अंग विकास में पाया जा सकता है।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल ऊष्मायन के कम से कम दस दिन में चिकन भ्रूण का उपयोग करता है। सभी प्रयोगों किंग्स कॉलेज लंदन, ब्रिटेन और ब्रिटेन के गृह मंत्रालय जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. तैयारी की आवश्यकता भ्रूण ऑपरेशन लड़की से पहले

  1. संचालन के लिए आवश्यक निम्नलिखित सर्जिकल उपकरणों इकट्ठा, फसल कटाई के लिए और लड़की भ्रूण फिक्सिंग के लिए: नं 5 watchmakers संदंश के दो जोड़े, मजबूत संदंश, जैसे, प्रकार ए.ए. की एक जोड़ी, ब्लेड 2.5 सेमी लंबे समय के साथ घुमावदार कैंची, कुंद घुमावदार समाप्त हो गया समाप्त होता है लगभग 0.5 सेमी लंबे समय के साथ संदंश, और भी नंबर 4 watchmakers संदंश के दो जोड़े जबकि पन्नी बाधाओं (1.6.3) बनाने का उपयोग करें।
  2. एक इस्पात पिन से एक माइक्रो चाकू (0.3 मिमी) के पार बनाने के लिए एक sharpening पत्थर पर तेल का उपयोग बढ़ाई। एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एक फ्लैट ब्लेड के लिए पिन की नोक पैनापन। एक सुई धारक में पिन की जगह और दस्तक दी और मांद किया जा रहा से अपनी तेज अंत की रक्षाटेड।
    नोट: एक 1000 μl विंदुक टिप के साथ चाकू sheathing इस के लिए एक सरल विकल्प है।
  3. एक प्लास्टिक की बोतल धोने में 70% इथेनॉल तैयार करें। पहले और बाँझ और उन्हें साफ करने के लिए इस्तेमाल करने के बाद सर्जिकल उपकरणों और सूक्ष्म चाकू पोंछने के लिए एक कागज ऊतक पर इस का एक धार का प्रयोग करें।
  4. 5 सेमी चौड़ा स्पष्ट चिपचिपा टेप और एक उपयुक्त निकालने की मशीन खरीदें। ढूँढें या चिकन अंडे अपने पक्ष पर स्थिर रखने के लिए उपयुक्त एक आराम निर्माण।
  5. बनाओ और भिगोने मोती के लिए दुकान समाधान।
    1. 30 μl aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर पानी और दुकान के साथ यह गिराए द्वारा 1 मिलीग्राम / एमएल जमे हुए स्टॉक से fibroblast वृद्धि कारक 4 (FGF4) प्रोटीन का एक 0.35 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है।
    2. तैयार समाधान अखिल पार retinoic एसिड (आरए) एक 5 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) अंधेरे microcentrifuge ट्यूबों में से पतला के (या तो 0.05 या 0.1 मिलीग्राम / एमएल)। शेयर और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots स्टोर।
    3. तैयार समाधान बीएमएस 493 के (या तो 2.5 या 5 मिलीग्राम / एमएल) (एक उलटा एजीRARs की onist) एक 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से अंधेरे microcentrifuge ट्यूब में DMSO के साथ पतला। शेयर और -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl aliquots स्टोर।
  6. एल्यूमीनियम पन्नी से बाधाओं को बनाओ।
    नोट: पन्नी बाधाओं को बनाने के लिए इस्तेमाल मानक खानपान पन्नी (0.013 मिमी मोटी के रूप में माइक्रोमीटर से मापा जाता है) है। किसी भी घरेलू एल्यूमीनियम पन्नी की संभावना उपयुक्त होगा।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी की एक 1 सेमी चौकोर टुकड़ा काटें और एक ऊतक पर 70% इथेनॉल के साथ यह पोंछते द्वारा यह बाँझ। यह एक 6 सेमी बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश पर रखें। ढक्कन त्यागें और पन्नी से पकवान के लिए एक ढक्कन बनाते हैं।
      नोट: यह बाद में स्थिर होने के कारण डिश के प्लास्टिक के ढक्कन के लिए चिपके से कटौती बाधाओं को रोकने जाएगा।
    2. पेट्री (1 सेमी लंबा 100 वर्गों में विभाजित) बढ़ाई 1.6x करने के लिए सेट के साथ एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत एक मंच रेखाजाल के शीर्ष पर पकवान रखें। एक सं .15 ब्लेड छोटे छुरी का उपयोग करना, एक सटीक चौड़ाई के लिए पन्नी के स्ट्रिप्स में कटौती जैसे, 0.7 मिमी या 1.3 मिमी।
    3. अलग पन्नीनंबर 4 watchmakers संदंश के दो जोड़े का उपयोग स्ट्रिप्स। फिर पन्नी बाधा ऐसी है कि यह विशिष्ट चौड़ाई का एक जैसा दिखता है काज के केंद्र में एक समकोण मोड़ सकते हैं।
      नोट: बाधा के इस आकार से 9, 10 से लिया जाता है। एक hinged बाधा एक सीधी, सपाट बाधा की तुलना में बेहतर जगह में रहता है। नंबर 4 संदंश अपेक्षाकृत कुंद कर रहे हैं और इस्तेमाल कर रहे हैं क्योंकि वे कम पन्नी बाधाओं में छात्रों या स्कोर बनाने की संभावना है।
    4. पकवान के खिलाफ एक तरफ फ्लैट और अन्य पकवान से बाहर इशारा करते हुए, एक तरफ करने के लिए शेष काटा हुआ पन्नी के साथ चलती पेट्री डिश के केंद्र में बाधाओं को अप लाइन। ऑपरेशन के एक दिन पहले 20 या अधिक बाधाओं को तैयार करें। पकवान पर पन्नी ढक्कन प्लेस और एक जगह है जहाँ वे परेशान नहीं किया जाएगा में बाधाओं की दुकान।
      नोट: यहां तक ​​कि एक मामूली पारी खत्म बाधाओं को टिप या मतलब है कि वे पकवान के पक्ष में स्थिर साथ छड़ी कर सकते हैं।
  7. 38 डिग्री पर गत्ता अंडे की ट्रे पर अपने पक्ष पर निषेचित चिकन अंडे सेतेऑपरेशन के दिन से पहले समय की उचित लंबाई के लिए सी ऐसी है कि भ्रूण वांछित 8 मंच पर किया जाएगा।

2. लड़की भ्रूण और ऑपरेशन दिवस के अवसर पर मोती की तैयारी

  1. 'विंडो' चिकन अंडे incubated।
    नोट: अंडे को खोलने के लिए निम्न विधि डेनिस Summerbell द्वारा पारित किया गया था (प्रकाशित नहीं)।
    1. अंडा अपने पक्ष पर झूठ बोल के साथ, प्रकार ए.ए. मजबूत संदंश सुनिश्चित करें कि भीतरी खोल झिल्ली टूट गया है बनाने के साथ अंडे की कुंद अंत (हवा की थैली अंत) घुसाना। संदंश मजबूती से एक साथ इस समझ से करते हैं और मुक्त हाथ के साथ अंडा धारण करते हुए एक नियंत्रित छुरा गति का उपयोग करने के लिए।
    2. अंडा ले लो, अभी भी (एक दोनों तरफ) अपने पक्ष पर झूठ बोल दोनों हाथों में क्षैतिज अक्ष के साथ 180 डिग्री के माध्यम से यह कर देते हैं और अंडे की ट्रे में यह जगह ऐसी है कि पक्ष यह है कि ऊपरवाला था अब ट्रे के बगल में है।
      नोट: यह खोल झिल्ली से भ्रूण loosens और इसका मतलब होगा कि भ्रूण है leएसएस संभावना जब भ्रूण के ऊपर खोल निकाल दिया जाता है कटौती करने के लिए।
    3. लगभग 5 सेमी वर्ग स्पष्ट टेप का एक टुकड़ा ले लो और इस बारीकी से अंडे के ऊपरवाला सतह पर चिपके रहते हैं भ्रूण पर ढहते जब अंडा खोला है से खोल रोकने के लिए।
    4. घुमावदार कैंची का प्रयोग धीरे खोल और अंडे के ऊपरवाला भाग के केंद्र में इसकी झिल्ली के माध्यम से तोड़ने के लिए है, ताकि हवा भ्रूण के ऊपर अंडे (जो सिर्फ तहत निहित प्रवेश कर सकते हैं कैंची की एक ब्लेड के साथ एक बहुत छोटा सा छेद कर खोल के ऊपरवाला हिस्सा)।
      नोट: सिर्फ खोल झिल्ली टूट गया और झिल्ली के किसी भी तोड़ने नहीं, भ्रूण को कवर हवा अंडे में प्रवेश के खोल से खोल से भ्रूण को अलग कर देगा और भ्रूण की जर्दी के शीर्ष पर आराम करने के लिए आ जाएगा 0.5-1 सेमी के बारे में रखकर ।
    5. लगभग 1 सेमी की एक व्यास के साथ एक चक्र के लिए खोल में छेद विस्तार करने के लिए घुमावदार कैंची का प्रयोग करें। एक साथ अंडे में excised खोल के टुकड़े निकालें और छेद को कवरस्पष्ट टेप का टुकड़ा लगभग 5 सेमी वर्ग। आसानी से इस टेप को निकालने के लिए मुक्त शेष टेप छोड़ रहा है, यह केवल छेद के होंठ पर छड़ी करने के लिए टेप दबाएँ। मुक्त टेप तो अंडे खोलना करने के लिए समझा जा सकता है।
  2. चरण भ्रूण
    1. 38 डिग्री सेल्सियस और गवाक्षन (2.1 कदम) (1.7 कदम देखें) पर ऊष्मायन के बाद, 8 के अनुसार लड़की भ्रूण चरण के लिए एक दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यह मत करो बस से पहले अंडे गवाक्षन निम्नलिखित सील कर रहे हैं। खोल पर प्रत्येक भ्रूण के मंच लिखें। इनक्यूबेटर अंडे लौटें।
      नोट: 8 और 15 के बीच के चरणों में भ्रूण बाधा और मनका प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। भ्रूण अधिक अगर वे के लिए इनक्यूबेटर से बाहर छोड़ दिया नहीं किया गया है भी लंबे समय से पहले आपरेशन करने के लिए जीवित रहने की संभावना है।
  3. ऑपरेशन से पहले भिगोने मोती।
    1. FGF4
      1. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी जेल मोतियों की संख्या (150-300 माइक्रोन) है कि एक 1000 μl विंदुक टिप के अंत करने के लिए छड़ी ले लो और थाएक microcentrifuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में एच उन्हें azide वे 5 सेकंड के लिए। अपकेंद्रित्र में जमा हो जाती है हटाने, पीबीएस त्यागने और इस प्रक्रिया में दो बार दोहराने के लिए।
      2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर एक बाँझ पेट्री डिश पर 0.35 मिलीग्राम / एमएल FGF4 प्रोटीन की एक 30 μl बूंद में जेल मोती लेना। भ्रूण में सम्मिलन के लिए 5 microforceps नं साथ मोती उठाओ, व्यास में लगभग 150 माइक्रोन।
        नोट: संभाल आयन एक्सचेंज राल नहीं 5 microforceps और उन्हें पकड़ बहुत धीरे से निम्न चरणों में इस्तेमाल किया मोती क्योंकि मोती भंगुर होते हैं और अगर बहुत कसकर निचोड़ा चकनाचूर कर सकते हैं। यह चेतावनी 2.3.2-2.3.3 और सभी राल मनका आपरेशन करने के लिए लागू होता है।
    2. आरए
      1. 0.05 या 0.1 मिलीग्राम की एक विभाज्य defrost / मिलीलीटर सब-पार आरए DMSO के साथ पतला और एक बाँझ पेट्री डिश (9 सेमी व्यास) है, जो पहले पन्नी में कवर किया गया है प्रकाश से आरए की रक्षा करने पर एक 100 μl बूंद जगह है। एक 10 μl विंदुक टिप ले लो और कुछ क्लोराइड प्रपत्र आयन एक्सचेंज उठाओअपने अंत पर राल मोती और आरए ड्रॉप 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश से सुरक्षित में इन लेना।
      2. लगातार तीन कम से कम 1 सेमी के अलावा एक ही पेट्री डिश पर रखा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) μl 100 की बूंदों में मोती कुल्ला।
        नोट: मोती DMEM से फिनोल लाल रंग हाथ में ले लिया। इस विधि पर 5 आधारित है।
      3. मोती उठाओ, लगभग 100 मीटर व्यास में भ्रूण में सम्मिलन के लिए, पेट्री डिश और No.5 microforceps के तहत एक खुर्दबीन मंच रेखाजाल स्लाइड का उपयोग मोती धारण करने के लिए (मोती जब गीला 75-180 माइक्रोन से आकार में सीमा)। जब DMEM के 100 μl ड्रॉप, मनका नीचे पहली जगह पेट्री डिश पर से मनका उठा और या तो बूंद के बाहर मनका धक्का द्वारा या मनका के बगल में बंद संदंश रखकर (केशिका इसमें से किसी भी शेष DMEM हटाने कार्रवाई मनका से दूर तरल खींचता है)।
    3. बीएमएस 493
      1. आरए (2.3.2) के रूप में, आयन Exch सोखएक 100 μl 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर DMSO में 2.5 या 5.0 मिलीग्राम की बूंद / एमएल बीएमएस 493 में Ange राल मोती तो DMEM के 100 μl बूंदों में कुल्ला। भ्रूण में सम्मिलन के लिए मोती लगभग 100 मीटर व्यास में उठाओ।
    4. DMSO नियंत्रण
      1. आरए (2.3.2) के रूप में, एक 100 μl 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर DMSO के ड्रॉप में आयन एक्सचेंज राल मोती सोख तो DMEM के 100 μl बूंदों में कुल्ला। भ्रूण में सम्मिलन के लिए मोती लगभग 100 मीटर व्यास में उठाओ।

3. बैरियर और मनका संचालन

आकृति 1
आंकड़ा जहां बाधाओं और या मोती रखा जाना चाहिए दिखा विभिन्न चरणों की लड़की भ्रूण की 1. Schematics। (ए) स्टेज 13 लड़की भ्रूण योजनाबद्ध दिखा बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) presump पर somites और LPM के बीचसक्रिय विंग स्तर (15-20 somites)। (बी) (ए) के रूप में ही योजनाबद्ध, यह दर्शाता है जहां आरए मनका (लाल वृत्त) बाधा सम्मिलन से पहले रखा जाना चाहिए। (सी) प्रकल्पित पैर स्तर (somites 26-32) एक चरण 15 भ्रूण में कम से योजनाबद्ध दिखा बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन)। (डी) (सी) के रूप में ही योजनाबद्ध, यह दर्शाता है जहां एक आरए मनका (लाल वृत्त) रखा जाना चाहिए। (ई) योजनाबद्ध का संकेत है जहां बीएमएस 493 मोती (बैंगनी हलकों) एक मंच 15 भ्रूण के LPM में रखा जाना चाहिए। (एफ) एक मंच 9 लड़की भ्रूण प्रकल्पित विंग स्तर पर presomitic mesoderm और LPM के बीच बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) का संकेत के योजनाबद्ध आरेख। (G) एक मंच 9 एक बाधा (ग्रीन लाइन) और आरए मनका (लाल वृत्त) के पदों पर दिखा भ्रूण के योजनाबद्ध आरेख। (एच) एक मंच 10 लड़की प्रकल्पित पैर के स्तर पर बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) दिखा भ्रूण के योजनाबद्ध आरेख। (मैं 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. बैरियर चरण 13 पर डाला विंग कली दीक्षा रोकने के लिए।
    1. इनक्यूबेटर से एक मंच 13 भ्रूण ले लो और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप 3.2x बढ़ाई या उच्चतर अगर पसंद करने के लिए सेट के तहत एक अंडा बाकी पर अंडे जगह है। स्पष्ट टेप की ऊपरी परत को हटा दें।
      1. एक स्टील सूक्ष्म चाकू का प्रयोग, पीतक झिल्ली और पार्श्व प्लेट mesoderm (LPM) भ्रूण के दाईं ओर somites 15 से 20 (चित्रा 1 ए) के माध्यम से सटे एक चीरा बनाने (somites सभी इस स्तर पर गठन नहीं किया है)। का गठन पिछले चार somites से सटे कट और दुमदारी कटौती दो विखंड लंबाई जारी है।
      2. नहीं, 5 microfo साथ बाधा (0.7-1 मिमी चौड़ा) उठाओअंत पेट्री डिश से फैला हुआ पर rceps और चीरा में बाधा से मुक्त अंत डालने के लिए हाथ मोड़। काज के आकार बाधा यह somites को चीरा बाहर के माध्यम से नीचे की ओर फैला हुआ के आधे के साथ LPM ऊपर पीतक झिल्ली पर फ्लैट निहित है। जैसे ही संभव के रूप में स्पष्ट टेप के साथ अंडे को सील और यह इनक्यूबेटर में लौटने।
        नोट: सूक्ष्म चाकू और चिमटी पीतक झिल्ली के साथ संपर्क पर चिपचिपा हो जाते हैं। यह बाद में एक ऑपरेशन के प्रयास करने से पहले उन्हें 70% इथेनॉल के साथ साफ साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सब बाद में आपरेशन वर्णन करने के लिए लागू होता है और implantations मनका करने के लिए।
      3. एक मनका एक बाधा के साथ संयोजन के रूप में सम्मिलित किया जा रहा है; सबसे पहले, नंबर 5 microforceps में मनका ले और चीरा के बाहर का पक्ष पर LPM की कटौती चेहरे में डालें और फिर मनका (चित्रा 1 बी) को चीरा समीपस्थ में बाधा डालने। अंडे को सील करने और इनक्यूबेटर करने के लिए तुरंत इसे वापस।
    2. बैरियर चरण 15 पर डाला पैर कली दीक्षा रोकने के लिए।
      नोट: पर Tbox 4 प्रतिलेखन कारक (Tbx4) अभिव्यक्ति इस आपरेशन के परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 2 डी और 2 ई में दिखाया गया है।
      1. इनक्यूबेटर से एक मंच 15 भ्रूण ले लो और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप 3.2x बढ़ाई या उच्चतर अगर पसंद करने के लिए सेट के तहत एक अंडा बाकी पर अंडे जगह है। स्पष्ट टेप की ऊपरी परत को हटा दें।
        1. एक स्टील सूक्ष्म चाकू का प्रयोग पीतक झिल्ली और LPM भ्रूण के दाईं ओर somites 26 के लिए 32 (चित्रा 1 सी) के माध्यम से सटे एक चीरा बनाने (somites सभी इस स्तर पर गठन नहीं किया है)। का गठन पिछले दो somites से सटे कट और दुमदारी कटौती पांच विखंड लंबाई जारी है।
        2. एक छोर पर नंबर 5 microforceps साथ बाधा (1.2-1.3 मिमी चौड़ा) उठाओ और चीरा में मुक्त अंत डालने के लिए बाधा मोड़। जैसे ही संभव के रूप में स्पष्ट टेप एक साथ अंडा सीलएन डी यह इनक्यूबेटर में लौटने।
          नोट: काज के आकार बाधा इसमें से आधा somites को चीरा बाहर के माध्यम से नीचे की ओर फैला हुआ साथ LPM ऊपर पीतक झिल्ली पर फ्लैट निहित है।
        3. एक मनका एक बाधा के साथ संयोजन के रूप में डाला जा रहा है, सबसे पहले, नंबर 5 microforceps में मनका ले और चीरा के बाहर का पक्ष पर LPM की कटौती चेहरे में डालें और फिर चीरा समीपस्थ में बाधा डालने मनका (चित्रा -1)। अंडे को सील करने और इनक्यूबेटर करने के लिए तुरंत इसे वापस।
        4. एक मनका या मोती, एक बाधा के बिना डाला जा रहे हैं जैसे, चरण 15 पर पैर क्षेत्र के लिए बीएमएस 493 मोती, लंबा चीरा (3.2.2.1) नहीं बनाते हैं। पीतक झिल्ली के माध्यम से और स्थिति मनका रखा जा रहा है पर LPM में एक छोटा सा चीरा। नहीं, 5 microforceps में मनका ले लो और LPM में छेद में डालें। संदंश (चित्रा 1E) के बंद के साथ समाप्त होता है एक छोटे से आगे में यह पुश।
      2. बैरियर 9 स्टेज पर डाला विंग कली प्रेरण और दीक्षा को रोकने के लिए।
        1. एक मंच पर 8 या 9 इनक्यूबेटर से भ्रूण ले लो और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप 3.2x बढ़ाई या इससे अधिक के लिए सेट के तहत एक अंडा बाकी पर अंडे जगह अगर प्राथमिकता दी।
          1. एक स्टील सूक्ष्म चाकू का प्रयोग पीतक झिल्ली के माध्यम से एक चीरा बनाने और LPM पार्श्व और आदिम लकीर को व्याख्यान चबूतरे, somites के साथ लाइन में भ्रूण की दुम अंत में (चित्रा 1F) के बारे में 5 विखंड लंबाई लंबा है।
          2. अंत पेट्री डिश से फैला हुआ पर नहीं, 5 microforceps साथ बाधा (0.7-1 मिमी चौड़ा) उठाओ और चीरा में बाधा से मुक्त अंत डालने के लिए हाथ मोड़। जैसे ही संभव के रूप में स्पष्ट टेप के साथ अंडे को सील और यह इनक्यूबेटर में लौटने।
            नोट: काज के आकार बाधा इसमें से आधा चीरा के माध्यम से नीचे की ओर फैला हुआ साथ LPM ऊपर पीतक झिल्ली पर फ्लैट निहित है।
          3. एक मनका inserte हो रहा हैएक बाधा के साथ संयोजन के रूप में घ; सबसे पहले, नंबर 5 microforceps में मनका ले और चीरा के बाहर का पक्ष पर LPM की कटौती चेहरे में डालें और फिर मनका (चित्रा 1G) को चीरा समीपस्थ में बाधा डालने। अंडे को सील करने और इनक्यूबेटर करने के लिए तुरंत इसे वापस।
      3. बैरियर 10 स्टेज पर डाला पैर कली प्रेरण और दीक्षा को रोकने के लिए।
        नोट: Tbx4 अभिव्यक्ति पर इस आपरेशन के परिणाम का एक उदाहरण चित्रा 2 जी में दिखाया गया है।
        1. इनक्यूबेटर से एक मंच 10 भ्रूण ले लो और एक दूरबीन माइक्रोस्कोप 3.2x बढ़ाई या उच्चतर अगर पसंद करने के लिए सेट के तहत एक अंडा बाकी पर अंडे जगह है।
          1. Somites के साथ लाइन में भ्रूण की दुम अंत में, का उपयोग करते हुए एक स्टील सूक्ष्म चाकू पीतक झिल्ली और LPM आदिम लकीर के लिए पार्श्व के माध्यम से एक चीरा बनाने (चित्रा 1H) लगभग 6 विखंड लंबी लंबाई।
          2. 1.2 बाधा उठाओ (मिमी अंत पेट्री डिश से फैला हुआ पर नहीं, 5 microforceps के साथ व्यापक) और हाथ मोड़ चीरा में बाधा से मुक्त अंत डालने के लिए। जैसे ही संभव के रूप में स्पष्ट टेप के साथ अंडे को सील और यह इनक्यूबेटर में लौटने।
            नोट: काज के आकार बाधा इसमें से आधा चीरा के माध्यम से नीचे की ओर फैला हुआ साथ LPM ऊपर पीतक झिल्ली पर फ्लैट निहित है।
          3. एक मनका, एक बाधा के बिना डाला जा रहा है जैसे, 10 स्टेज पर पैर क्षेत्र के लिए बीएमएस 493 मनका, एक छोटा सा चीरा पीतक झिल्ली के माध्यम से और स्थिति मनका रखा जा रहा है पर LPM में बनाते हैं। नहीं, 5 microforceps में मनका ले लो और LPM में छेद में डालें। संदंश (चित्रा 1 मैं) के बंद के साथ समाप्त होता है एक छोटे से आगे में यह पुश।
      4. ऑपरेटिंग उभरते contralateral अंग कली के साथ तुलना में बाधा की स्थिति की जांच के बाद 24 घंटे या उससे अधिक। किसी भी भ्रूण में जो बाधा स्पष्ट रूप से oppos नहीं है त्यागेंबाएं अंग कली ite। इस मामले में गलत तरीके से बाधा तैनात किया गया है।

      4. कटाई भ्रूण, फिक्सेशन और तैयारी wholemount स्वस्थानी संकरण में लिए (इच्छा)

      1. कटाई भ्रूण ऑपरेशन के बाद।
        1. चरण 19-23 पर फसल भ्रूण कि इस तरह के अंग कली आकृति विज्ञान स्पष्ट रूप से दोनों संचालित और contralateral नियंत्रण पक्षों में दिख रहा है।
          1. का प्रयोग घुमावदार कैंची eggshell में एक बड़ा छेद में कटौती। भ्रूण के आसपास कट microforceps के साथ भ्रूण के बाईं ओर बड़ी रक्त वाहिका धारण करते हुए। भ्रूण को हटाने और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.3 पीएच की एक पेट्री डिश में जगह के लिए पोत के इस पकड़ का प्रयोग करें।
          2. एक दूरबीन माइक्रोस्कोप के तहत, और घुमावदार कैंची का एक संयोजन का उपयोग कर कोई अतिरिक्त भ्रूण वाहिकाओं और झिल्ली दूर काटना। 5 microforceps। कैंची का उपयोग सिर निकालें।
      2. भ्रूण का निर्धारण पोस्ट कटाई।
        1. घुमावदार blun का प्रयोगटी संदंश, भ्रूण उठा और दो मानव संसाधन एक पेंच टोपी के साथ कमाल की है और उसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 20 मिलीलीटर कांच की बोतल में रात भर के लिए 5 मिलीलीटर 4% कमरे के तापमान पर पीबीएस में paraformaldehyde (पीएफए) में जगह है।
          सावधानी: पीएफए ​​स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। यह एक हानिकारक, संक्षारक अड़चन है और पाउडर त्वचा, आंखों और फेफड़ों के साथ संपर्क में आने से रोका जाना चाहिए। व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े और एक धूआं हुड का उपयोग करते हुए समाधान की तैयारी। एक बार जब यह एक 4% समाधान, दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और एक प्रयोगशाला कोट पहना है किया जाना चाहिए।
          नोट: यह तय में भ्रूण प्राप्त करने के लिए जल्दी से सबसे अच्छा mRNA अखंडता की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है।
      3. सीटू संकरण में wholemount करने से पहले बाधाओं को हटाने के।
        नोट: बाधाओं को हटा दिया जाता है क्योंकि वे तेज कर रहे हैं और भ्रूण को नुकसान के रूप में वे सीटू संकरण प्रोटोकॉल में के माध्यम से जाना जा सकता है, खासकर अगर कई भ्रूण एक बार में दाग रहे हैं।
        1. निर्धारण के बाद, एक दूरबीन मील के तहत पीबीएस की एक थाली में भ्रूण जगहcroscope।
        2. नहीं, 5 microforceps के दो जोड़े का उपयोग करना, छोड़ दिया जोड़ी बारीकी से भ्रूण के संचालित पक्ष में बाधा के दोनों ओर जगह है। सही जोड़ी के साथ बाधा समझ और धीरे भ्रूण कम रखने के लिए और बाधा का पालन करने के रूप में इसे हटा दिया जाता है से किसी भी ऊतक को रोकने के लिए छोड़ दिया जोड़ी का उपयोग भ्रूण से बाधा खींच।
      4. अनिवार्य रूप से काश बाहर ले जाने के 11 में वर्णित है।

Representative Results

प्रोटोकॉल ऊपर विस्तृत Nishimoto एट अल में नियोजित तरीके का वर्णन है। 2015 कागज दोनों सामने और लड़की भ्रूण की hindlimb में अंग कली प्रेरण और दीक्षा अध्ययन करता है। अभेद्य बाधाओं की प्रविष्टि forelimb कली के परिणाम को रोकने के लिए निम्न परिणाम पहले से प्रकाशित किया गया है 1, 2, 9, लेकिन वहाँ केवल एक अध्ययन का वर्णन पैर कली दीक्षा 1 रोकने बाधाओं को दिया गया है। Nishimoto एट अल से hindlimb डेटा। 2015 यहाँ बाधा प्रविष्टि निम्न mRNA अभिव्यक्ति के अध्ययन के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

LPM में Tbx4 अभिव्यक्ति hindlimb परिणाम आरंभ करने के लिए पर्याप्त नहीं है:
आंकड़े 2 बी और सी (तालिका 2) चरण 15 (2A चित्रा) पर उस बाधा प्रविष्टि दिखाने (प्रोटोकॉल 3.2 देखें) दोनों Fgf10 की ओर जाता हैऔर Fgf8 अभिव्यक्ति संचालित सही पक्ष पर पैर कली क्षेत्र (ब्रैकेट द्वारा चिह्नित) में अनुपस्थित जा रहा है। unoperated बाईं ओर के साथ तुलना करें। हालांकि, Tbx4 अभिव्यक्ति दोनों चरण 19 और 23 चरण संचालित पक्ष (चित्रा 2 डी और ई) पर कम से मनाया जाता है। हम निष्कर्ष है कि Tbx4 अकेले अभिव्यक्ति LPM से hindlimb परिणाम आरंभ करने के लिए पर्याप्त नहीं है। लड़की में अन्य अध्ययनों से सुझाव दिया है कि TBX जीन अभिव्यक्ति forelimb कली गठन 12, 13 को आरंभ करने के लिए पर्याप्त है।

चित्रा -2 'का उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए कैसे एक बाधा भ्रूण पद निर्धारण के पैर क्षेत्र में imbedded दिखता शामिल है। मामलों बाधाओं के बहुमत में सीटू संकरण (प्रोटोकॉल 4.3) में करने से पहले हटा दिया गया।

Somites से Ra Fgf10 लाती अंग कली हे पहले LPM में आवश्यक हैutgrowth:
चित्रा 3A एक योजनाबद्ध एक बाधा चरण 15 (प्रोटोकॉल 3.2.1.3) पर डाला करने के लिए एक आरए लथपथ मनका बाहर के अलावा प्रतिनिधित्व है। इस आपरेशन के अंग कली परिणाम (एक तारक से चिह्नित) संचालित सही पक्ष और Tbx4, Fgf10 और Fgf8 पर मनाया जाता है कली में व्यक्त कर रहे हैं के रूप में वे नियंत्रण छोड़ दिया पक्ष में हैं के बाद (चित्रा 3 बी, सी और डी, 2 टेबल) । इस प्रकार LPM को आरए के अलावा बाधा और अंग कली दीक्षा आय के प्रभाव पर काबू। हम निष्कर्ष somites से सामान्य विकास आरए में LPM में आवश्यक है कि अंग कली परिणाम शुरू किया जा सकता से पहले। जिसके परिणामस्वरूप hindlimb कलियों आम तौर पर नियंत्रण पक्ष पर उन लोगों की तुलना में छोटे होते हैं। इस में LPM जा रहा है जंगली प्रकार स्थिति के लिए बराबर नहीं आरए खुराक की वजह से हो सकता है। आरए खुराक बहुत अधिक है शिखर बहिर्जनस्तरीय रिज (AER) छोटा किया जा सकता है और छोटे कलियों नतीजा होगा14, 15।

LPM में (somites से) कि आरए पुष्टि करने के लिए सामान्य अंग कली दीक्षा RAR, बीएमएस 493 का एक उलटा एगोनिस्ट के लिए आवश्यक है, इस्तेमाल किया गया था। मोती चरण 15 पर पैर क्षेत्र LPM में प्रत्यारोपित किया जाता है (प्रोटोकॉल 3.2.1.4 देखें) (चित्रा 3E)। Fgf10 अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के पक्ष (; 3 टेबल 3F चित्रा) की तुलना में छोटे hindlimb कलियों में जिसके परिणामस्वरूप LPM में 493 मोती बीएमएस के निम्नलिखित आवेदन downregulated है। नियंत्रण DMSO मोती इन दोषों (; 3 टेबल आंकड़े 3 जी और 3H) का कारण नहीं है। दोष निम्नलिखित बीएमएस 493 आवेदन मनाया एक बाधा के आपरेशन के द्वारा प्रेरित किया उन लोगों की तुलना में मामूली हैं; यानी, Fgf10 अभी भी व्यक्त किया है और अंग कलियों का गठन कर रहे हैं। इसका कारण यह है बीएमएस 493 के प्रभाव को मोती के आसपास स्थानीय रूप से प्रतिबंधित कर रहे हैं और नहीं सभी आरए AXI द्वारा उत्पादित विरोध करने में सक्षम हो सकता होने की संभावना हैअल ऊतकों।

प्रारंभिक अक्षीय सिग्नल निर्दिष्ट LPM कोशिकाओं है कि बाद में Tbx4 एक्सप्रेस:
हम परीक्षण किया है जब LPM भावी लेग गठन क्षेत्र में Tbx4 को व्यक्त करने की क्षमता प्राप्त कर लेता है। प्रारंभिक चरण है, जिस पर एक बाधा है कि बाद में पैर कली परिणाम रोकेंगे डाला जा सकता है, मंच से 10 है हम पहले चरण की तुलना में पहले चरण में बाधाओं को डालने के लिए 12. बाधाओं paraxial mesoderm और प्रकल्पित पैर के बीच में डाला एक प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं 10 स्टेज पर LPM ब्लॉक पैर कली गठन और पैर के गठन LPM में Tbx4 की अभिव्यक्ति (आंकड़े 2 एफ और 2 जी, तालिका 2) (प्रोटोकॉल 3.4 देखें), सुझाव है कि 10 स्टेज पर अक्षीय ऊतकों से एक संकेत के बाद अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है hindlimb LPM में Tbx4। जहां बाद में बाधा डालने Tbx4 अभिव्यक्ति की अनुमति देता आंकड़े 2 डी और ई के साथ इस परिणाम की तुलना करेंस्थापित किए जाने के लिए। इसके अलावा, हम इस अक्षीय संकेत से देख रहा है RAR का उलटा एगोनिस्ट Tbx4 अभिव्यक्ति को कम कर देता द्वारा आरए हो सकता है कि क्या परीक्षण किया। एक बीएमएस 493 चरण 10 (प्रोटोकॉल 3.4.1.3 देखें) पर hindlimb LPM में रखा मनका Tbx4 अभिव्यक्ति (आंकड़े 2H और 2I) downregulates, जबकि नियंत्रण मोती DMSO में भिगो Tbx4 अभिव्यक्ति (आंकड़े 2J और 2k) को प्रभावित नहीं करते। साथ में, इन परिणामों के एक मॉडल है कि अक्षीय ऊतकों से एक आरए संकेत सकारात्मक hindlimb LPM 7 में Tbx4 विनियमन द्वारा अंग प्रेरण को नियंत्रित करता है समर्थन करते हैं।

पोस्ट ऑपरेटिव मौत:
टेबल्स 1, 2 और 3 उस पद संचालन और कटाई से पहले मृत्यु हो गई लड़की भ्रूण की संख्या सहित प्रयोगात्मक परिणामों की जानकारी दे। कुछ लोगों की मृत्यु इस प्रकार की microsurgery के बाद उम्मीद की जा रही हैं। संख्या मर रखा जा सकता है सुनिश्चित करें कि उपकरणों साफ कर रहे हैं बनाने के द्वारा एक न्यूनतम करने के लिए, अंडे में छेद न्यूनतम आकार के लिए आवश्यक है, कि भ्रूण यह आखिरी बात यह है कि आपरेशन के साथ संयोजन के रूप में कम से कम समय के लिए चिपचिपा टेप सील के संरक्षण के बिना छोड़ दिया जाता है और, जितनी जल्दी संभव हो बाहर किया जाता है। इन कार्यों में से कोई भी बहुत समय लगता है लेकिन माला और बाधाओं से जुड़े संचालन थोड़ा और अधिक समय ले रहे हैं। इन उपायों के बावजूद, संचालन जल्द से जल्द चरणों में किया जाता है और विंग क्षेत्र में उन लोगों के लिए और अधिक मौत में परिणाम की संभावना है। वहाँ के आसपास अंग बनाने क्षेत्रों और इन जहाजों का आकस्मिक टूटना बड़े रक्त वाहिकाओं मौत के लिए खून की कमी के कारण पैदा हो सकती हैं। हम जानते हैं कि अंडे चरण 8 या 9, जिसका भ्रूण पर संचालित नहीं किया गया है, अक्सर अगले दिन से मर जाएगा पर खोला पाते हैं। इसलिए, इन समस्याओं का एकमात्र समाधान प्रयोगों की एक उच्च संख्या में बाहर ले जाने के लिए है।

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चित्रा 2. मार्कर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रकल्पित पैर स्तर पर बाधा या मनका निवेशन के बाद। (ए) योजनाबद्ध दिखा बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) प्रकल्पित पैर स्तर पर एक चरण 15 भ्रूण में (somites 26-32) पर। (बी - और जी) संचालित भ्रूण बताना विश्लेषण। पैर क्षेत्र उल्लिखित है (कोष्ठक)। (बी) Fgf10 अभिव्यक्ति संचालित LPM में अनुपस्थित है, लेकिन मजबूत अभिव्यक्ति बाईं कली में पता चला है। (सी) Fgf8 अभिव्यक्ति का सुझाव कोई AER है संचालित पक्ष में अनुपस्थित है। (सी) एक ही भ्रूण से पहले बैरियर हटा दिया गया था। (डी) Tbx4 नियंत्रण कली के रूप में ही rostro दुम स्तर पर LPM में व्यक्त किया जाता है। (ई) Tbx4 अभिव्यक्ति अंग विकास के अभाव के बावजूद दाहिना पैर क्षेत्र में बनाए रखा है। (एफ) एक मंच के योजनाबद्ध आरेख 10 लड़की प्रकल्पित पैर के स्तर पर बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) दिखा भ्रूण। (G) Tbx4 अभिव्यक्ति संचालित सही एलपीएम (ब्रैकेट) में अनुपस्थित है। (एच) एक मंच 10 लड़की प्रकल्पित पैर स्तर पर बीएमएस 493 मनका स्थिति (बैंगनी वृत्त) दिखा भ्रूण के योजनाबद्ध आरेख। (मैं) Tbx4 अभिव्यक्ति बीएमएस 493. (जे) एक मंच 10 लड़की नियंत्रण DMSO मनका स्थिति (ग्रे वृत्त) दिखा भ्रूण के योजनाबद्ध आरेख के साथ इलाज के बाद संचालित सही पक्ष पर downregulated है। (कश्मीर) Tbx4 अकेले DMSO के साथ इलाज के बाद नियंत्रण बाईं ओर का है कि एक समान स्तर पर संचालित सही पक्ष पर व्यक्त की है। यह आंकड़ा 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. आरए बचाता अंग कली की अनुपस्थिति बैरियर निवेशन की वजह से और LPM पैर बड परिणाम के लिए पूर्व में आवश्यक है। (ए) योजनाबद्ध आरेख प्रकल्पित पैर स्तर (somites 26-32) और एक आरए लथपथ मनका (लाल वृत्त) में बाधा स्थिति (ग्रीन लाइन) का संकेत है। (बी - डी) आरए बचाता पैर कली परिणाम (एक तारांकित द्वारा दिखाया गया है)। (बी) Tbx4 अभिव्यक्ति संयुक्त राष्ट्र के संचालित पक्ष के समान बचाया पैर कली में मौजूद है। (सी) Fgf10 बचाया पैर में संयुक्त राष्ट्र संचालित पक्ष के समान व्यक्त किया है कली। (डी) Fgf8 बचाया दाहिना पैर कली की AER में व्यक्त किया जाता है। (ई) योजनाबद्ध का संकेत है जहां बीएमएस 493 मोती (बैंगनी हलकों) चरण 15 भ्रूण के प्रकल्पित पैर LPM में रखा गया था। (एफ) Fgf10 अभिव्यक्ति संचालित सही पक्ष पर downregulated जाता है और पैर कली छोटे निम्नलिखित बीएमएस 49 है3 उपचार। मोती asterisked हैं। (G) (ई) के लिए भी इसी तरह योजनाबद्ध, नियंत्रण DMSO मोती (ग्रे हलकों) की स्थिति का संकेत है। (एच) DMSO मोती (तारों के द्वारा दिखाया गया है) Fgf10 अभिव्यक्ति या पैर कली आकार को प्रभावित नहीं किया। यह आंकड़ा 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टेज बाधा रखा (+ मनका) * संख्या संचालित विंग लापता ** विंग वर्तमान ** संख्या मृत
स्टेज 12-14 40 24 1 15
स्टेज 8/9 65 23 0 42
स्टेज 12-13 (FGF4 मनका) 41 7 (मनका लापता) 17 17
स्टेज 12-13 (आरए मनका) 75 9 (मनका लापता) 32 34
स्टेज 13 (नियंत्रण मनका) 5 3 0 2
* 0.7-1 मिमी पन्नी बाधाओं somites 15-20 और पार्श्व प्लेट mesoderm के बीच रखा। 0.35 मिलीग्राम / एमएल FGF4 मनका। 0.05-0.1 मिलीग्राम / एमएल आरए मनका।
DMSO नियंत्रण मनका।
** लड़की भ्रूण तय चरणों 21-23

तालिका 1. विंग स्तर बैरियर और मनका प्रयोग के परिणाम।

स्टेज बाधा रखा (+ मनका) * संख्या संचालित पैर गायब ** पैर वर्तमान ** संख्या मृत
स्टेज 12-15 43 39 0 4
स्टेज 10/11 23 16 0 7
स्टेज 15 (FGF4 मनका) 8 0 5 3
स्टेज 15 (आरए मनका) 18 0 18 0
* 0.7-1.3 मिमी पन्नी बाधाओं somites 26-32 और पार्श्व प्लेट mesoderm के बीच रखा। 0.35 मिलीग्राम / एमएल FGF4 मनका। 0.05-0.1 मिलीग्राम / एमएल आरए मनका।
** लड़की भ्रूण तय चरणों 18-24

तालिका 2 पैर स्तर बैरियर और मनका प्रयोग के परिणाम।

संख्या संचालित पैर छोटे कली पैर से थोड़ा छोटा कली पैर कली सामान्य आकार संख्या मृत
बीएमएस 493 मनकों *
15 12 3 0 0
DMSO मोती **
12 0 3 9 0
* 2-3 मोती 5 मिलीग्राम में भिगो / एमएल बीएमएस 493 पैर स्तर पर सही मंच 14-15 LPM में रखा।
** 2-3 मोती DMSO में भिगो अकेले पैर स्तर पर सही चरण 15 LPM में रखा।
लड़की भ्रूण चरणों में तय 17-19।

तालिका 3. पैर स्तर बीएमएस 493 मनका प्रयोग के परिणाम।

Discussion

हम अभेद्य बाधाओं का उपयोग लड़की भ्रूण में अंग कली गठन को रोकने का वर्णन है। इस तकनीक को महत्वपूर्ण कदम की एक संख्या है। प्रारंभिक प्रयोगों के बाद हमने पाया कि काज के आकार 9 में इस्तेमाल बाधाओं, 10 भ्रूण दूर सीधे बाधाओं की तुलना में बेहतर जगह में रहते हैं। बाधा के बाहर का फ्लैट की ओर पीतक झिल्ली करने के लिए लाठी और जगह (चित्रा -2 ') में बाधा रहती है। एल्यूमीनियम पन्नी प्रोटोकॉल 1.6 चरण में वर्णित के रूप में से काज के आकार बाधाओं में से सावधान तैयारी ऑपरेशन की सफलता के लिए आवश्यक है। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करने के लिए कि अंडे भी लंबे समय गवाक्षन निम्न और भ्रूण पर परिचालन करने से पहले मंचन के लिए इनक्यूबेटर से बाहर नहीं छोड़ रहे है। हमारे अनुभव में, भ्रूण एक ऑपरेशन बेहतर होगा अगर वे कम या ऊष्मायन तापमान के पास हैं जब ऑपरेशन किया जाता है जीवित रहते हैं। संचालन इसलिए जितनी जल्दी संभव हो बाहर किया जाना चाहिए और अंडे resealed शीघ्रLy अच्छा जीवित रहने की दर सुनिश्चित करने के लिए। कई शोधकर्ताओं इनक्यूबेटर अंडे लौटने से पहले निम्नलिखित microsurgery भ्रूण के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की एक बूंद जोड़ें। तरल की उपस्थिति की स्थिति में अच्छी तरह से चिपके से बाधाओं को रोका। एंटीबायोटिक के अलावा भी नियुक्ति के बाद मोती को बेदखल कर सकता है। इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं, स्विफ्ट संचालन और उपकरणों के साथ अच्छा साफ-सफाई का उपयोग नहीं कर संक्रमण से बचने के लिए सिफारिश की है। एक ऑपरेशन के हर चरण के बाद 70% इथेनॉल के साथ उपकरणों पोंछते पीतक झिल्ली जो दोनों अवरोध या मोती संदंश का पालन करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं (प्रोटोकॉल कदम 3.1.2.2 देखें) के साथ संपर्क में आने से चिपचिपा बनने से उपकरणों को रोकने के लिए आवश्यक है। इस्तेमाल किया मोतियों की दोनों किस्मों के आपरेशन के बाद जगह से बाहर गिर सकता है। जब बाधा स्थिति अगले दिन की जाँच की थी यह बाधा के माध्यम से देखने के लिए पता लगाने के लिए मनका जगह में है या नहीं बना रहा है कि क्या यह संभव नहीं था। मामलों में जहां मनका बाहर गिर गयी थी विंग कली परिणाम को बचाया नहीं गया था (

इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रयोगों है कि अवरोध का उपयोग किया अंग कली दीक्षा को रोकने के लिए संशोधित करता है, बाधाओं के लिए विशिष्ट इष्टतम चौड़ाई परिभाषित करता है और संयोजन बाधा और मनका प्लेसमेंट के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के बाद का परिचय। हम पारंपरिक एल्यूमीनियम पन्नी, जो सस्ते और सभी प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध है का उपयोग कर पाया, उन है कि पहले से टैंटलम पन्नी इस्तेमाल करने के लिए बराबर परिणामों पैदा करता है। पन्नी भ्रूण में छोड़ा जा सकता है जब सीटू संकरण (चित्रा -2 ') में बाहर ले जा रहा है, लेकिन हम आम तौर पर इसे हटाने यदि एक से अधिक भ्रूण पन्नी को नुकसान पहुँचाए भ्रूण के तेज किनारों को रोकने के लिए कार्रवाई की जा रही है। पीilot अध्ययनों से दिखा दिया है कि पैर क्षेत्र बाधाओं की चौड़ाई विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। प्रारंभ में बाधाओं trialed भी कम थे और पैर की कली परिणाम रोका नहीं गया था। 1.2-1.3 मिमी पैर कली परिणाम पूरी तरह से ब्लॉक करने के लिए एक बाधा के लिए अधिकतम चौड़ाई है। सबसेसंकरेमें विंग बाधाओं है कि एक सही जगह कर सकते हैं कली परिणाम सबसे अच्छा जीवित रहने की दरों देने को रोकने के लिए। यह 0.5-0.7 मिमी के रूप में के रूप में संकीर्ण हो सकता है। हालांकि, बाधाओं है कि एक छोटे से व्यापक हैं (हम 0.7-1 मिमी) का इस्तेमाल किया और अधिक विंग कली परिणाम की पूरी अवरुद्ध में परिणाम है क्योंकि वे नियुक्ति के लिए एक छोटे से अशुद्धि के लिए अनुमति देने की संभावना है। रक्त वाहिकाओं से बचाव जब चीरा विंग कली स्तर बाधाओं के लिए महत्वपूर्ण है। अर्द्ध पारगम्य बाधाओं को पहले से लड़की अंग कली दोटूक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। MacCabe और पार्कर, 1976 और Summerbell, 1979 दोनों का इस्तेमाल किया फिल्टर 0.45 माइक्रोन और 0.8 माइक्रोन ताकना आकार क्रमश: 16, 17. उन्होंने बताया कि प्रसारण संकेतों फिल्टर में और उस छिद्रों के माध्यम से पारित कर सकता हैपरिणामों का उपयोग अर्द्ध पारगम्य बाधाओं को कोई बाधा वर्तमान और एक एक अभेद्य टैंटलम पन्नी बाधा के साथ साथ एक अंग कली के बीच बीच में थे प्राप्त की। इस प्रोटोकॉल के आकार पर या संकेत प्रसार की गतिशीलता को संशोधित करने के आधार पर उम्मीदवार संकेतों अंतर करने के लिए अलग-अलग छेद के आकार के अर्द्ध पारगम्य बाधाओं का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मॉडल जीव के साथ ही जुड़े विभिन्न सीमाएँ हैं। इस तरह की तकनीक अंग विकास में आगे सवाल और भी कशेरुकी embryogenesis के अन्य सवालों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक प्रावधान है कि प्रश्न में अंग / क्षेत्र के विकास किया जाना चाहिए जब लड़की भ्रूण हस्तक्षेप करने के लिए सुलभ है। ऐसा क्षेत्र है जहां एक बाधा रखा जाना चाहिए में बड़े रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति चरण 13 या 14 से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बाधा प्लेसमेंट के बाद में आता है। बड़े रक्त वाहिकाओं बाधा प्लेसमेंट के दौरान काट रहे हैं, तो इस भ्रूण मृत्यु दर का कारण बन सकता है। जब प्रतिलेखन कारक टी की हमारी जांचbx5 और Tbx4 पहले LPM में प्रेरित कर रहे हैं जल्द से जल्द मंच है जिस पर हम एक बाधा है कि बाद में विपरीत या तो दक्षिणपंथी या पैर कली क्रमश खत्म होगा जगह सकता द्वारा सीमित था। यह पहले चरण, gastrulation के करीब पर TBX जीन प्रेरण ब्लॉक करने के लिए प्रयास करने के लिए रोशन किया जा सकता है। जल्द से जल्द एक बाधा के प्रकल्पित विंग क्षेत्र में रखा जा सकता है सफलतापूर्वक चरण 8 था और पैर क्षेत्र चरण 10 में इस प्रोटोकॉल की वजह से बाद में तेजी से विकास के लिए बाधा और परिणाम विस्थापित होगा शायद नहीं अंग कली चरणों से परे जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है केवल बाधा की प्रारंभिक स्थिति से संबंधित होगा।

इस संदर्भ में लड़की भ्रूण की सीमाओं से संबंधित बीत रहा है, अन्य हड्डीवाला मॉडल जीवों पर अपने फायदे कई हैं। लड़की भ्रूण एक कशेरुकी भ्रूण में शारीरिक हस्तक्षेप के इस प्रकार के लिए एक बहुत ही उपयुक्त पशु मॉडल है। भ्रूण अपेक्षाकृत बड़े हैं और throu आसानी से सुलभ हैंखोल gh। एक प्रयोग के लिए आगे भ्रूण पर लौट सकते हैं (जैसे, एक मनका 18 या यहां तक कि एक बाधा को हटाने के) या बस टेप खिड़की को हटाने के द्वारा प्रगति पर जाँच करें। वहाँ संभव गुंजाइश रहते इमेजिंग या समय चूक इमेजिंग शामिल करने के लिए है। हम चिकन अंडे कि विशेष रूप से प्रारंभिक चरण भ्रूण पर परिचालन के लिए अनुकूल है windowing की एक विधि का वर्णन है। अंग के अध्ययन के मामले में यह बहुत ही महत्वपूर्ण और उपयोगी है हर प्रयोग है कि प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के लिए एक contralateral नियंत्रण अंग नहीं है।

अंग परिणाम और मोती संकेतन अणुओं में भिगो को रोकने के लिए अभेद्य बाधाओं का उपयोग कर के संयोजन से पहले नहीं बताया गया है। इस तरह के हस्तक्षेप के बाद mRNA अभिव्यक्ति के हमारे विश्लेषण भी उपन्यास है। इन तकनीकों में हमें सक्षम जब अंग विशिष्ट प्रतिलेखन कारक Tbx5 और Tbx4 LPM में प्रेरित किया है और यह भी कर रहे हैं की कठिन समस्या टुकड़े करनाकि बाद में, कली दीक्षा अंग से पहले दिखाने के लिए, LPM में इन TBX जीनों की उपस्थिति Fgf10 प्रतिलेखन के सक्रियण और अंग कली परिणाम की शुरुआत के लिए पर्याप्त नहीं है। आंकड़े 2 जी, 2 डी और 2 ई इन निष्कर्षों में अच्छी तरह से व्याख्या करते हैं। चित्रा 2 जी में 10 स्टेज पर एक बाधा की प्रविष्टि निम्न Tbx4 अभिव्यक्ति के अभाव Tbx4 के शामिल होने के बाद चरण 15 पर 2 डी और 2 ई में अपनी उपस्थिति बाधा प्रविष्टि निम्न के विपरीत में है। आरए लथपथ मोती का आरोपण बाधा डालने और इतने somites LPM में आवश्यक किया जा रहा अंग कली परिणाम शुरू कर सकते हैं पहले से Ra को अंक निम्नलिखित अंग कली दीक्षा के बचाव में मदद की। इस तरह की तकनीक अंग विकास में आगे के प्रश्न लेकिन यह भी कशेरुकी embryogenesis के अन्य सवालों को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मस्तिष्क, आंख और ट्रंक के क्षेत्रों उपयुक्त होने की संभावना है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11241-30
Dumont strong forceps, type AA Fine Science Tools  www.finescience.de 11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long Fine Science Tools  www.finescience.de 14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long Fine Science Tools www.finescience.de 11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide Fine Science Tools  www.finescience.de 26002-20
Sharpening stone, square Fine Science Tools  www.finescience.de 29008-01
Mineral oil
Needle holder Fine Science Tools  www.finescience.de 26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m www.5staroffice.com 295985
FGF4 protein A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid Sigma www.sigmaaldrich.com R2625-50MG Remember to protect from light.
BMS 493 Sigma www.sigmaaldrich.com B6688-5MG
Scalpel blade No. 15 www.swann-morton.com cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel Bio-Rad www.bio-rad.com 153-7301 Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin Bio-Rad www.bio-rad.com 140-1251 Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs Memmert www.hce-uk.com LAB128
Paraformaldehyde (PFA) Sigma www.sigmaaldrich.com P6148-1KG Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol Sigma www.sigmaaldrich.com 32221-2.5L
DMEM, high glucose Gibco www.thermofisher.com 41965-039 500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific webshop.fishersci.com D/4121/PB08 500 ml
Binocular Microscope  Leica www.leica-microsystems.com MZ6 Replaced by M60
Chicken eggs Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com Brown Eggs

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References

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उम्मीदवार फैक्टर लथपथ मोती के साथ संयुक्त अभेद्य बाधाओं के आवेदन लड़की में आगमनात्मक संकेतों का अध्ययन करने के लिए
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Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).More

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).

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