Abstract
鸡胚提供了可用于解剖直接的方式发展的问题，一个极好的脊椎动物模型。它的可访问性和健壮性以下外科干预是关键的实验优势。云母板是用来防止小鸡肢芽开始1第一障碍。使用铝箔作为防渗屏障翅芽或腿芽诱导和或启动协议描述。我们与珠放置横向这种技术结合了障碍外生已封锁的壁垒供应候选人内生因素。结果是使用在随后的基因表达的原位杂交分析。我们的主要焦点是在诱导和维甲酸信号鸡胚前后肢和后来萌生的作用。我们使用的BMS 493（视黄酸受体的反向激动剂（RAR））在侧板中胚层（LPM）注入浸泡珠以模仿杆的作用垒放置在体节（视黄酸源（RA）），并从该肢芽生长LPM之间。这些协议的修改版本也可以使用，以解决对感应线索的起源和定时的其他问题。提供的鸡胚的区域是在有关发育阶段访问，阻挡可以被放置在两个组织中的发展随之变化研究之间。实例可以在脑发育，轴延伸和在器官发育中找到，如肝脏或肾脏的诱导。
Introduction
古典传统的胚胎学家采用物理技术审问控制胚胎发育的机制。在20世纪60年代和70年代，研究人员开发出了用于插入胚胎发育的组织之间的胚胎发育过程中表现出的感应信号的重要性防渗屏障技术。我们的兴趣是在脊椎动物肢体发育，特别是什么事件之前肢芽生长。例如，阻挡插入可以防止肢芽生长从鸡胚的一侧发生，同时使其上的对侧，腭裂侧正常进行。用于制造这些障碍不同的材料;例如，云母板1和钽箔2。这些障碍有效分离的侧板中胚层（LPM），从该肢芽形成，从体节从近轴中胚层形成。外科移植技术证明，密切联系机智h如果肢芽开始在LPM 3 4要发生的体节是必不可少的。在80年代和90年代，发育生物学家发现扩散的信号是在控制发育过程中必不可少的分子。与这些信号分子浸泡珠可在胚胎的特定区域被植入并产生改变胚胎发育。例如，当植入到鸡胚和可产生的位5镜像复制通过离子交换珠粒溶于视黄酸（RA）被释放，在24小时内。含FGF蛋白质肝素压克力珠可以从interlimb LPM 6发起肢芽生长。
最近，鼠标和鱼类遗传学采取脊椎动物肢体发起的研究进入一个新的时代（7审查）。有足够的证据表明存在于前肢芽萌生体节RA是由LP所需的基本扩散信号M键启动肢体萌芽。我们希望利用鸡胚的可访问性和鲁棒性实验解剖围绕肢芽开始时的LPM屏障植入对基因表达的影响。我们的方法的小说改编是一个屏障相结合，从与珠横向放置的障碍已被封锁的壁垒外生供给的候选人内生因素的轴向组织块的信号。以下协议是那些发展梳理出肢芽诱导和引发的机制。
研究肢芽萌生指利用早期胚胎。许多研究者窗口鸡卵由第一至气囊用皮下注射针除去一些白蛋白。胚胎，它坐落在蛋黄上面，然后将趴在低蛋。这对于某些技术，如电穿孔的优点，但如果胚胎的手术操作需要可以是一个缺点。我们发现有胚胎接近鸡蛋开幕尽可能是一个优势。
问题依然是关于控制脊椎动物肢芽诱导和启动信号和下面的协议适用于解决这些问题。我们是第一个制定的障碍插入，以防止鸡肢芽生长在早于12阶段8阶段的协议。这些协议的修改版本也可以使用，以解决对起源和电感线索定时其它问题，其中，向所述原基被感应的访问的诱导组织位于相邻。所提供的胚胎的区域是在相关的发育阶段访问，则阻挡可以被放置在两个组织中的发展随之变化研究之间。例如可以在大脑发育，轴延伸和可能的器官发育找到，如肝脏或肾脏感应。
Protocol
下面的协议在培养不到十天使用鸡胚。所有实验均按照伦敦大学国王学院，英国和英国内政部的动物护理指南进行。
1.准备所需此前鸡胚操作
- 收集操作所需的下列手术器械，收获和用于固定鸡胚：两对5号制表匠钳，一双强有力的镊子， 例如 ，AA型的，剪子弯叶片与长2-2.5厘米，钝端弯曲镊子与两端约为0.5厘米长，而且还有两个对4等号制表大师钳同时使箔障碍（1.6.3）来使用。
- 使从钢销微型刀（跨0.3毫米）上磨石使用油激化。用双目显微镜，锐化销的前端到平坦叶片。放置销针座和保护其尖端从被撞倒和书房特德。
注意：用护套用1000微升枪头刀是这个简单的选项。 - 在一个塑料洗瓶准备70％的乙醇。使用在纸上组织这样的喷射使用前和使用消毒和清洁它们擦拭后的手术器械和微刀。
- 买5厘米宽的清晰胶带和合适的饮水机。查找或制造适合保存在其一侧一个鸡蛋稳步休息。
- 制作和浸泡珠店的解决方案。
- 通过在30微升等份与水并储存在-20℃稀释制备从1毫克/毫升冷冻的储存成纤维细胞生长因子4（FGF4）蛋白的0.35毫克/毫升的溶液。
- 制备溶液用二甲基亚砜（DMSO）中暗离心管从5毫克/毫升的库存稀释全反式视黄酸（RA）的（无论是0.05或0.1毫克/毫升）。存放股票，并在-20°C 100微升等分。
- 制备溶液BMS 493（无论是2.5或5毫克/毫升）（逆股份的RAR的onist）从10毫克/毫升的库存在黑暗离心管用DMSO稀释。存放股票，并在-20°C 100微升等分。
- 建立从铝箔障碍。
注意：用于制造的障碍的箔为标准式箔（通过千分尺测量0.013毫米厚）。任何国内铝箔很可能是合适的。- 切为1厘米见方的一张铝箔，并通过与组织70％的乙醇擦拭消毒它。将其放置到将6cm无菌塑料培养皿中。丢弃盖子，使盖子从铝箔菜。
注意：这将防止以后粘到菜的塑料盖，由于静态切障碍。 - 放置具有放大倍率设置为1.6X双目显微镜下一个阶段刻度顶部的培养皿（1厘米长分成100段）。使用15号刀片手术刀小，切箔带一个准确的宽度， 例如 ，0.7毫米或1.3毫米。
- 单独箔剔除使用两对4号制表匠钳。然后使一个直角弯曲的箔屏障，使得其类似于特定宽度的铰链的中心。
注：屏障的这种形状是从9,10服用。一个铰链屏障停留在更好的地方比直的，平坦的屏障。 4号镊子相对钝并使用，因为它们不太可能使凹痕或分数箔障碍。 - 排队在培养皿与一侧平贴盘和其他朝上出的菜，剩余未切割箔移动到一侧的中心的障碍。准备手术前一天20个或更多的障碍。将铝箔盖在盘中并存储在那里他们将不会受到干扰的地方障碍。
注意：即使是轻微的敲门声可以翻倒的障碍或意味着他们坚持使用静态的菜的两侧。
- 切为1厘米见方的一张铝箔，并通过与组织70％的乙醇擦拭消毒它。将其放置到将6cm无菌塑料培养皿中。丢弃盖子，使盖子从铝箔菜。
- 在38℃孵育受精鸡蛋在其两侧的纸板上鸡蛋托盘下的时间之前操作日的适当长度，使得胚胎将在所希望的8级。
2.鸡胚和操作的日珠的制备
- “窗口”孵化鸡蛋。
注：由丹尼斯Summerbell传递打开鸡蛋下面的方法（未出版）。- 用鸡蛋侧躺着，皮尔斯AA型强镊子确保内壳膜已破蛋的钝端（气囊结束）。要做到这一点的把握镊子牢固地结合在一起，并同时用另一只手拿着鸡蛋使用控制刺伤议案。
- 取蛋，仍躺在其一侧，在双手（一个任一侧）打开它通过180°沿水平轴并更换它在蛋盘，使得这是最上侧是现在旁边的托盘。
注：这从壳膜松动胚胎，将意味着胚胎是乐SS可能在胚胎上方的外壳被去除被削减。 - 取一块透明胶带的方大约5厘米，并密切贴本翻蛋的最上表面，以从卵打开时崩溃到胚胎停止蛋壳。
- 使用弯曲的剪刀轻轻通过壳及其在蛋的最上部分的中心的膜破裂，使一个非常小的孔与剪刀的一个叶片，使得空气可以进入在胚胎蛋（其位于略低于壳的最上部）。
注：刚刚破壳膜和没有违反任何膜覆盖胚胎，进入卵子的空气将胚胎从壳从壳分离，胚胎会停留在蛋黄上面约0.5-1厘米。 - 使用弯曲的剪刀在壳的孔放大到一个圆的直径为约1厘米。在一个鸡蛋中取出一块切除外壳并覆盖孔一块透明胶带大约5厘米见方。轻松删除该磁带，按磁带只在孔的边缘坚持下去，留下剩余的录像带免费。那么可用磁带可以掌握到启封蛋。
- 阶段的胚胎
- 以下在38℃（参见步骤1.7）和窗口（步骤2.1）温育后，用双目显微镜按8到阶段的鸡胚。这样做是密封以下窗口鸡蛋之前。写在蛋壳每个胚胎阶段。返回蛋的孵化器。
注：在8至15阶段的胚胎都适合屏障，珠实验。胚胎更容易，如果他们没有被排除在孵化太久之前的操作才能生存。
- 以下在38℃（参见步骤1.7）和窗口（步骤2.1）温育后，用双目显微镜按8到阶段的鸡胚。这样做是密封以下窗口鸡蛋之前。写在蛋壳每个胚胎阶段。返回蛋的孵化器。
- 操作之前浸泡珠。
- FGF4
- 取的亲和层析凝胶珠该粘到1000微升枪头的末尾的数字（150-300微米），并ħ它们在微量管1毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS），以除去它们存储在离心5秒的叠氮化物，弃去PBS中，两次重复该过程。
- 浸泡凝胶珠在0.35毫克/毫升FGF4蛋白对在冰上的无菌培养皿中进行30分钟的30微升下降。接珠直径大约为150微米与5号microforceps用于插入胚胎。
注：处理在下面的步骤中使用与第5 microforceps和把手它们非常平缓的离子交换树脂珠，因为珠是脆性的，如果挤压得过紧可能碎裂。此警告适用于2.3.2-2.3.3和所有树脂珠操作。
- RA
- 除霜的0.05或0.1毫克等分试样/ ml的全反式RA的用DMSO稀释并且放置在无菌培养皿（直径9厘米），先前已经覆盖在箔来保护的RA从光的100μl的下降。取10微升枪头，并挑选了一些氯化物型离子交换在其端部的树脂珠和在RA滴在室温下避光进行20分钟浸泡这些。
- 冲洗珠子微升的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）放置在同一培养皿相距至少1cm的100三个连续下降。
注：珠拿起从DMEM酚红染料。此方法是基于5。 - 接珠直径大约为100微米（珠粒的尺寸范围从75-180微米湿时）用于插入胚胎，使用下培养皿和5号microforceps显微镜阶段刻度滑动以保持珠。当从DMEM的100微升下降，首位珠倒到培养皿拿起珠，要么通过推动珠出下降或通过将封闭镊子珠旁边（毛细管从中取出所有剩余的DMEM行动从珠将液体的距离）。
- BMS 493
- 对于RA（2.3.2），浸泡离子可置换在2.5或5.0毫克100微升滴/毫升BMS 493在DMSO中在室温下20分钟安格树脂珠粒然后冲洗在DMEM中加入100μl滴。接珠直径大约为100微米的用于插入胚胎。
- DMSO控制
- 作为RA（2.3.2），泡的离子交换树脂珠粒在室温下的DMSO的100μl的下降为20分钟，然后在DMEM中加入100μl滴冲洗。接珠直径大约为100微米的用于插入胚胎。
- FGF4
3.障碍和珠运营
图1示出障碍和或珠子应该放在各阶段的鸡胚的示意图。体节和LPM在presump之间（ 一 ）第一阶段13鸡胚示意图，显示屏障位置（绿线）略去机翼水平（体节15-20）。 （ 二 ）同一原理图中（A），这表明其中RA珠（红圈）之前应屏障插入放置。 （C）在一个阶段15胚胎假定的腿水平（26-32体节）示意图，显示屏障位置（绿线）。 （ 四 ）同一原理图中（C），说明那里的RA珠（红圈）应放置。 （E）示意图说明，其中BMS 493珠（紫色圆圈）应放置在LPM的一个阶段15胚胎。 （F）表明在假定的机翼水平presomitic中胚层和LPM之间的屏障位置（绿线）一期9鸡胚的示意图。 （G）呈现出屏障（绿线）和RA珠（红圈）的位置的9级胚胎的示意图。 （H）显示在假定的腿水平屏障位置（绿线）的一个阶段10鸡胚的示意图。 （ 我 7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 在障碍13级插入防止翅芽萌生。
- 就拿从孵化器中的一个阶段13胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。取出透明胶带的上层。
- 使用钢微刀，使一个切口通过卵黄膜和侧板中胚层（LPM）相邻的对胚胎的右侧体节15至20（ 图1A）（体节没有全部在此阶段形成的）。切毗邻形成的最后四体节，并继续切两体节长度的尾部。
- 与5号microfo拿起屏障（0.7-1毫米宽）rceps在从培养皿伸出的端部和扭转手插入屏障进入切口的自由端。该铰链形状的阻挡平放在卵黄膜的LPM上面它通过切口远离体节向下突出的一半。为尽快查封用透明胶带鸡蛋，并返回到孵化器。
注：微刀和镊子成为与卵黄膜接触粘。它试图后续操作之前擦拭干净，用70％的乙醇是重要的。这适用于所有随后的操作的描述和对珠粒注入。 - 如果胎圈处于与阻挡一并插入;首先，取入5号microforceps胎圈，并将其插入在切口的远端侧的LPM的切割面，然后插入屏障进入切口近端到胎圈（ 图1B）。密封鸡蛋，并及时返回它的孵化器。
- 在阻隔15期插入防止腿部芽萌生。
注：TBOX 4转录因子 （TBX4）表达此运算的结果的一个例子示于图2D和2E。- 就拿从孵化器中的一个阶段15胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。取出透明胶带的上层。
- 使用钢微刀使通过相邻对胚胎的右侧体节26至32（ 图1C）卵黄膜和LPM切口（体节没有全部在此阶段形成的）。切毗邻形成的最后两个体节，并继续分切成5体节长度的尾部。
- 拿起与5号microforceps阻挡（1.2-1.3毫米宽）在一端与拧阻挡插入自由端插入切口。为尽快查封用透明胶带一个鸡蛋第二它返回到孵化器。
注：形阻挡铰接平放在卵黄膜的LPM上面的一半通过切口远离体节突出向下。 - 如果胎圈处于与阻挡一起被插入时，首先，取在5号microforceps胎圈，并将其插入到LPM的切割面的切口的远端侧，然后插入屏障进入切口近端胎圈（ 图1D）。密封鸡蛋，并及时返回它的孵化器。
- 如果珠子或珠子插入没有障碍， 例如 ，BMS 493珠腿部区域在舞台15，不要使长的切口（3.2.2.1）。作一小切口，通过卵黄膜和成珠要被放置的位置LPM。取在5号microforceps胎圈，并将其插入在LPM的孔中。用钳子（ 图1E）的封闭两端推它远一点。
- 在道闸9级插入防止翅芽的诱导和启动。
- 以一个8级或从孵化器9胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2X倍率或更高的双目显微镜下，如果首选。
- 使用钢微刀使通过卵黄膜的切口和LPM横向和延髓的原条，在与该体节线胚胎的尾端（ 图1F）约5体节长度长。
- 拾取用5号microforceps阻挡（0.7-1毫米宽）在从培养皿伸出的端部和扭转手插入屏障进入切口的自由端。为尽快查封用透明胶带鸡蛋，并返回到孵化器。
注：形阻挡铰接平放在卵黄膜的LPM上面的一半通过切口突出向下。 - 如果一个珠是要inserted。与阻挡结合;首先，取入5号microforceps胎圈，并将其插入在切口的远端侧的LPM的切割面，然后插入屏障进入切口近端到胎圈（ 图1G）。密封鸡蛋，并及时返回它的孵化器。
- 以一个8级或从孵化器9胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2X倍率或更高的双目显微镜下，如果首选。
- 在阻隔10期插入防止腿部芽诱导和启动。
注：TBX4表达此运算的结果的一个例子示于图2G。- 就拿从孵化器中的一个阶段10胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。
- 使用钢微刀使通过卵黄膜和LPM横向于原条的切口，在与该体节线胚胎的尾端（ 图1H）约6体节长度长。
- 拿起屏障（1.2毫米宽）与从培养皿伸出的端部5号microforceps和扭转手插入屏障进入切口的自由端。为尽快查封用透明胶带鸡蛋，并返回到孵化器。
注：形阻挡铰接平放在卵黄膜的LPM上面的一半通过切口突出向下。 - 如果胎圈要被插入没有障碍， 例如，BMS 493珠在腿部区域在阶段10中，作一小切口，通过卵黄膜和成珠要被放置的位置LPM。取在5号microforceps胎圈，并将其插入在LPM的孔中。用钳（ 图1I）的封闭两端推它远一点。
- 就拿从孵化器中的一个阶段10胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。
- 操作检查与新出现的对侧肢芽相比阻挡层的位置后24小时或更长时间。丢弃任何胚胎，其中所述屏障是显然不是oppos伊特左肢芽。在这种情况下，屏障被错误地定位。
4.收获胚胎，固定和准备Wholemount 原位杂交（WISH）
- 收获的胚胎POST操作。
- 收获胚胎阶段19-23，使得肢芽的形态显然是在这两个操作和对侧对照侧可见。
- 采用弧形剪刀剪蛋壳更大的洞。在保持大血管与microforceps胚胎的左侧围绕胚胎切割。使用该容器的该把手以除去胚，并将其放置在磷酸盐缓冲盐水（PBS）的pH 7.3的培养皿。
- 下双目显微镜，解剖远额外胚胎血管和膜的使用和没有弯曲的剪刀的组合。 5 microforceps。删除使用剪刀头。
- 收获胚胎阶段19-23，使得肢芽的形态显然是在这两个操作和对侧对照侧可见。
- 胚胎固定后收获。
- 采用弧形blun吨镊子，提起胚，并将其放置于5ml 4％低聚甲醛（PFA）的PBS在室温下两小时用螺帽摇动，然后在4℃过夜在20ml的玻璃瓶中。
注意：PFA是一种严重危害健康。它是一种有害的，腐蚀性的刺激性，并且必须从进入与皮肤，眼睛和肺接触可以防止该粉末。而配制溶液使用个人防护服和通风橱。一旦它是一个4％的溶液，手套，护目镜和白大褂必须佩戴。
注：获取胚胎成修复迅速最好保持mRNA的完整性是重要的。
- 采用弧形blun吨镊子，提起胚，并将其放置于5ml 4％低聚甲醛（PFA）的PBS在室温下两小时用螺帽摇动，然后在4℃过夜在20ml的玻璃瓶中。
- 除去原位杂交到wholemount前障碍。
注：壁垒被除去，因为它们是尖锐和因为它们经过原位杂交协议可以破坏胚胎，特别是如果多个胚一次染色。- 固定后，将胚胎在PBS的菜双目MI下croscope。
- 使用两对5号microforceps，紧紧放置左一对阻挡层的任一侧在胚胎的操作侧。与右一对把握屏障和利用左右一对保持胚胎下来，以防止任何组织从它除去粘附在阻挡轻轻拉动从胚胎的屏障。
- 在11所描述基本完成心愿。
- 就拿从孵化器中的一个阶段15胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。取出透明胶带的上层。
- 就拿从孵化器中的一个阶段13胚胎，并放置在一个鸡蛋休息鸡蛋设置为3.2倍的放大倍率，或者首选更高双目显微镜下。取出透明胶带的上层。
Representative Results
上文详述的协议描述在西本等人采用的方法。 ，2015年研究了面向中脱颖而出，鸡胚的两个后肢肢芽的诱导和启动。防渗屏障插入防止前肢芽的生长以下结果：此前公布的1，2，9，但一直只腿防止芽萌生1一项研究中描述的障碍。从西本等人的后肢数据。 ，2015年在这里提出如下屏障插入基因表达研究的代表性成果。
在LPM TBX4表达不足以启动后肢产物：
图2B和C（ 表2）示出在阶段15（ 图2A），该阻挡插入（见协议3.2）导致两个FGF10和FGF8表达是在被操作右侧腿芽区域（由括号表示）缺席。与未手术左侧比较。然而，TBX4表达在两个级19和级23上的操作侧（ 图2D和E）观察到。我们的结论单靠TBX4表达不足以从LPM启动后肢产物。在小鸡其它的研究表明，TBX基因表达是足以引发前肢芽形成12，13。
图2C'是包含说明的障碍看起来如何在胚胎后固定腿部区域嵌入。在大多数的情况下，屏障被原位杂交（协议4.3）之前除去。
从体节RA是在之前FGF10诱导肢芽澳LPM基本utgrowth：
图3A是示意表示在加入的RA浸泡珠远端向在阶段15（协议3.2.1.3）插入的屏障。随后该操作肢芽生长（以星号表示）上被操作右侧和TBX4，FGF10和FGF8观察在萌芽表示，因为它们是在控制左侧（ 图3B，C和D， 表2） 。因而除了RA的LPM的克服了屏障和肢芽开始前进的效果。我们得出结论，在从体节正常发展RA是在LPM必要可以启动肢芽生长之前。由此产生的后肢芽通常比那些在控制端小。这可能是由于在LPM暂时不等同于野生型的情况对RA剂量。如果RA剂量过高的顶外胚层岭（AER）可以缩短，更小芽会导致14，15。
为了确认在该LPM RA（自体节）所需的正常肢芽萌生RAR，BMS 493的反向激动剂，使用。珠粒注入到在阶段15中的腿区域LPM（见协议3.2.1.4）（ 图3E）。 FGF10表达被下调的BMS的以下应用中的LPM 493珠，导致更小的后肢芽相比对照侧（ 图3F; 表3）。控制DMSO珠不会导致这些缺陷（ 图3G和3H; 表3）。观察下面的BMS 493的应用程序中的缺陷是比那些由挡操作引起的温和; 即 FGF10仍表示并形成肢芽。这很可能是因为BMS 493的作用围绕珠局部限制，并且可以不能够拮抗由AXI产生的所有协人的组织。
早期的轴向信号指定LPM细胞后来快递TBX4：
我们测试的时候LPM获得其表达在未来的腿形成区域TBX4能力。将阻挡可以插入，这将阻止后来腿芽生长的最早阶段，是舞台10.我们是第一个制定一个协议在早期阶段要插入的障碍比级12壁垒旁轴中胚层和推定腿之间插入LPM在阶段10（参见协议3.4）嵌段腿芽形成和TBX4的腿部形成LPM的表达（ 图2F和2G， 表2），这表明从轴向组织在阶段10的信号需要更高表达TBX4后肢LPM。比较这个结果与图2D和E，其中后面的阻挡插入允许TBX4表达被建立。此外，我们还测试了这款轴向信号是否可能是RA通过观察RAR的反相激动剂是否会降低TBX4表达。将BMS 493胎圈放置在工作台10（参见协议3.4.1.3）后肢LPM下调TBX4表达（ 图2H和2I），而在DMSO浸泡控制珠粒不影响TBX4表达（ 图2J和2K）。总之，这些结果支持了从轴向组织的RA信号在后肢LPM 7正调节TBX4调节肢感应的模型。
手术后死亡：
表1，表2和3 中得到的实验结果的详细信息，包括该死亡后的操作和收获前小鸡胚胎数。一些死亡是这种性质的显微后可以预期的。数字垂死可以保持至最小通过确保仪器是干净的，在蛋的孔是必需的最小大小，这将胚左无胶带密封的最小时间的保护，并在结合这最后一点是，操作是尽可能快地进行。这些操作都不是很费时，但涉及的珠子和障碍操作需要多一点时间。尽管这些措施，操作在最初阶段进行，并没有在这个翼区域更可能导致死亡。有大血管肢体形成区域和这些血管意外破裂各地可能会导致死亡因失血。我们发现，鸡蛋在阶段8或9的胚胎都没有被操作时，通常会在第二天模具打开。因此，这些问题的唯一解决办法是进行了大量的实验。
D / 54618 / 54618fig2.jpg“/>
图2. 标记基因表达的变化在推定腿级别以下的障碍或珠插入。 （ 一 ）示意图，显示屏障位置（绿线）在一个阶段15胚胎假定的腿水平（26-32体节）。 （B - E和G）上运行的胚胎WISH分析。腿区域概述（括号内）。 （B）的FGF10表达是在操作LPM不存在，但在左芽检测稳健表达。 （C）FGF8表达是在手术侧缺席，表明没有AER。 （C'）有相同的胚胎，除去阻挡之前。 （D）的TBX4在LPM在同一rostro -尾级作为控制芽中表达。尽管没有肢生长（E）的TBX4表达被保持在右腿区域。 （F）的一个阶段示意图 10鸡胚显示在假定的腿水平屏障位置（绿线）。 （G）TBX4表达是在操作正确的LPM（支架）缺席。 （H）示出了在推定腿水平BMS 493胎圈位置（紫色圆圈）的一个阶段10鸡胚示意图。 （I）TBX4表达在与BMS 493（J），显示控制DMSO珠位置（灰色圆圈）的一个阶段10鸡胚示意图治疗下调的操作右侧。 （K）TBX4是在同一水平，以该控制左侧的以下单独用DMSO处理的操作的右侧表示。这个数字已经从7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
D / 54618 / 54618fig3.jpg“/>
图3. RA解救肢芽的缺席屏障插入引起的，是在LPM腿芽生长之前必不可少的。 （ 一 ）示意图表明在假定的腿水平（26-32体节）和RA-浸泡珠（红圈）屏障位置（绿线）。 （B - D）RA救援腿芽生长（由星号表示）。 （B）TBX4表达出现在获救腿芽类似于非手术侧。 （C）FGF10在获救腿芽表达类似的未手术侧。 （D）FGF8在获救右腿芽的AER表示。 （E）的示意图表示，其中BMS 493珠（紫色圆圈）置于台15胚胎的推定腿LPM。 （F）的 FGF10表达下调在操作右侧和腿芽小以下BMS 493治疗。珠是星号。 （G）类似原理图（E），说明控制DMSO珠（灰色圆圈）的位置。 （H）的DMSO珠（由星号表示）并不影响FGF10表达或腿芽大小。这个数字已经从7修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 舞台上放置障碍物（+珠）* | 操作数 | 永失踪** | 目前荣** | 死亡人数 |
| 12-14级 | 40 | 24 | 1 | 15 |
| 阶段8/9 | 65 | 23 | 0 | 42 |
| 舞台12-13（FGF4珠） | 41 | 7（珠丢失） | 17 | 17 |
| 12-13级（RA珠） | 75 | 9（珠丢失） | 32 | 34 |
| 13级（控制珠） | 五 | 3 | 0 | 2 |
| *置于体节15-20和侧板中胚层之间0.7-1毫米箔障碍。 0.35毫克/毫升FGF4珠。 0.05-0.1毫克/毫升的RA珠。 | ||||
| DMSO对照珠。 | ||||
| **鸡胚固定阶段21-23 | ||||
表1.机翼一级屏障和珠实验结果。
| 舞台上放置障碍物（+珠）* 操作数 | 腿失踪** | 目前腿** | 死亡人数 | |
| 12-15级 | 43 | 39 | 0 | 4 |
| 舞台10/11 | 23 | 16 | 0 | 7 |
| 15级（FGF4珠） | 8 | 0 | 五 | 3 |
| 15级（RA珠） | 18 | 0 | 18 | 0 |
| *置于体节26-32和侧板中胚层之间0.7-1.3毫米箔障碍。 0.35毫克/毫升FGF4珠。 0.05-0.1毫克/毫升的RA珠。 | ||||
| **鸡胚固定阶段18-24 | ||||
表2.腿等级壁垒与珠实验结果。
| 操作数 | 腿小芽 | 芽腿稍微小 | 腿芽正常大小 | 死亡人数 |
| BMS 493珠* | ||||
| 15 | 12 | 3 | 0 | 0 |
| DMSO珠** | ||||
| 12 | 0 | 3 | 9 | 0 |
| *在5毫克浸泡2-3个珠子/ ml的BMS 493放置在合适的阶段14-15 LPM在腿的水平。 | ||||
| ** 2-3珠子浸泡DMSO单独放置在合适的阶段，15 LPM在腿的水平。 | ||||
| 鸡胚固定在1阶段7-19。 | ||||
表3.腿级别BMS 493珠实验结果。
Discussion
我们描述了使用的不可渗透屏障，以防止在鸡胚肢芽形成。该技术具有若干关键的步骤。以下初步实验中，我们发现，在9中使用的铰链形状的障碍，10保持就位在胚胎远比直障碍更好。阻挡的远侧平面侧粘到卵黄膜，并保持就位（ 图2C'）的屏障。从作为协议的步骤描述1.6铝箔铰链形障碍精心准备是手术成功的关键。第二个重要的步骤是确保鸡蛋不会被排除在外的孵化时间过长以下窗口和之前对胚胎操作分期。在我们的经验，胚胎存活，如果他们是在或接近培养温度时操作被执行的操作更好。操作因此应尽可能迅速地进行，并且鸡蛋重新密封提示LY以确保良好的存活率。许多研究者抗生素滴添加至胚胎返回鸡蛋孵化之前以下显微。液体的存在下从位置粘附以及阻止的障碍。抗生素的添加也可以放置后打跑珠。因此，不使用抗生素，迅速行动，并与仪表整洁良好的建议，以避免感染。擦拭用70％乙醇文书以下的操作的每一个阶段是必须防止文书成为从与卵黄膜可引起两个屏障或珠粘附到镊子（见协议步骤3.1.2.2）接触粘。这两个品种的使用珠子可能掉出的操作下列的地方。当阻挡位置被检查，第二天这是不可能通过屏障看，以确定胎圈是否仍然存在与否。在珠已经降到了案件翅芽生长没有被救出（ 该协议将修改此前公布的实验中所使用的障碍，防止肢芽开始，具体的定义最适用于宽度障碍和介绍相结合的屏障及胎圈的位置后基因表达分析。我们发现使用传统的铝箔，这是价格便宜，在所有实验室一应俱全，产生的结果等同于以前使用钽箔。箔片可在胚胎原位杂交（ 图2C'）进行时，可以离开，但如果被处理多于一个的胚胎以防止箔片损坏胚胎的锋利的边缘，我们通常将其删除。 Pilot研究表明的腿部区域的障碍的宽度是特别重要的。最初试用过障碍太短，不妨碍腿部芽生长。 1.2-1.3毫米为屏障完全阻挡腿芽生长的最佳宽度。一个可以精确地放置最窄翼屏障以防止芽生长提供最佳的存活率。这可能是为0.5-0.7毫米窄。然而，这是一个小更宽障碍更可能导致翼芽生长的完全阻断，因为它们允许用于放置的一个小的误差（我们使用0.7-1毫米）。血管时避免使切口是翅芽水平壁垒的关键。半透障碍已使用过平分小鸡肢芽。 MacCabe和帕克，1976年和Summerbell，1979年都使用过滤器0.45微米和0.8微米孔径，分别为16，17，他们报告说，扩散的信号可以通过在过滤器和毛孔结果使用半透障碍是一肢芽，无阻挡本和一个用不渗透的钽箔屏障之间中途获得的。这个协议可以适于使用不同的孔径大小的半渗透屏障来区分基于尺寸或修改信号的扩散的动力学候补信号。 该协议主要有与模型生物体本身相关的各种限制。这种技术可用于探测在肢体发育进一步的问题，并且也脊椎动物胚胎发生的其他问题。一个条件是，当鸡胚是干预访问有问题的器官/地区应发展。大血管中，其中的阻挡需要放置的区域的存在使得屏障放置比阶段13或14的技术上的挑战后。如果大血管屏障放置过程中削减这可能会导致胚胎死亡。我们在转录因子T的调查BX5和TBX4在LPM首先诱导是由在此，我们可以放置一个屏障，后来分别结束了相反无论是翼或腿芽的最早阶段的限制。它可以照亮试图在早期阶段，更接近原肠阻塞TBX基因诱导。最早的一个屏障可以被放置在该推定翼区域成功是级8和腿部区域级10该协议可能是不适合的基因表达以外肢芽阶段研究，因为随后的快速增长将取代屏障和结果将仅涉及到阻挡的初始位置。 具有相关的在此上下文中鸡胚的限制，它的优点在其它脊椎动物模型生物体是很多的。鸡胚是一种用于在脊椎动物胚胎这种类型的物理干预一个非常合适的动物模型。胚胎是比较大的，而且THROU方便GH蛋壳。可以返回到胚胎用于进一步的实验（ 例如，去除一个珠18或甚至一个屏障），或通过简单地移除胶带窗口检查进展情况。有可能的范围，使其包括实时成像或延时成像。我们描述了窗口化鸡卵是特别适合于在早期胚胎操作的方法。肢体的研究的情况下，这是非常重要的和有益的，有对每个在作为理想的内部控制为每个生物复制实验一对侧控制肢体。 使用不可渗透屏障防止肢体向外生长和珠子在信号分子中浸泡的组合以前尚未报道。我们的基因表达的这种干预的分析也是小说。这些技术使我们能够解剖时肢体特异性转录因子Tbx5中和TBX4诱导的LPM，也是难的问题表明以后，前肢芽开始，在LPM这些TBX基因的存在不足以FGF10转录的激活和肢芽生长的开始。 图2G，2D和2E说明了这些研究结果良好。阻挡的在阶段10， 如图2G的插入以下的情况下TBX4表达的是在阶段15形成鲜明对比，其在2D和2E存在以下屏障插入，TBX4诱导后。 RA的浸泡珠植入促进肢芽萌生以下屏障插入和从体节是在LPM之前必不可少的肢芽生长就可以开始这么点RA救援。可以使用这种技术来解决肢体发育进一步的问题，也是脊椎动物胚胎发育的其他问题。脑，眼和躯干的区域很可能是合适的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
