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Developmental Biology

L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

doi: 10.3791/54618 Published: November 17, 2016

Abstract

L'embrione pulcino fornisce un modello vertebrato superba che può essere utilizzato per sezionare domande di sviluppo in modo diretto. La sua accessibilità e la robustezza dopo l'intervento chirurgico sono importanti punti di forza sperimentali. Piatti Mica sono state le prime barriere usati per prevenire pulcino arto gemma iniziazione 1. Protocolli che utilizzano un foglio di alluminio come una barriera impermeabile al germoglio ala o induzione gamba gemma e l'iniziazione o sono descritti. Uniamo questa tecnica con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I risultati vengono analizzati mediante ibridazione in situ della successiva espressione genica. Il nostro obiettivo principale è il ruolo della segnalazione dell'acido retinoico nella induzione e iniziazione successiva alla ribalta embrione di pollo e degli arti posteriori. Usiamo BMS 493 (un agonista inverso di recettori dell'acido retinoico (RAR)) perline bagnati impiantati nella piastra laterale mesoderma (LPM) per simulare l'effetto di un barrier posto tra i somiti (una fonte di acido retinoico (RA)) e la LPM da cui gemme degli arti crescono. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull'origine e la tempistica di spunti induttivi. Purché la regione di embrione di pollo è accessibile in fase di sviluppo rilevante, una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati nel cervello di sviluppo, l'estensione dell'asse e nello sviluppo di organi, come il fegato o il rene induzione.

Introduction

embriologi classici tradizionalmente impiegate tecniche fisiche per interrogare i meccanismi che controllano lo sviluppo embrionale. Negli anni 1960 e 1970 ricercatori hanno sviluppato tecniche che hanno usato le barriere impermeabili inseriti tra i tessuti dell'embrione in via di sviluppo per dimostrare l'importanza dei segnali induttivi durante l'embriogenesi. Il nostro interesse è in vertebrati sviluppo degli arti e, in particolare, quali eventi precedono escrescenza arto gemma. Ad esempio, l'inserimento di una barriera può impedire arto gemma conseguenza di verificarsi su un lato del embrione di pollo pur consentendo di procedere normalmente sul lato non operato controlaterale. I materiali utilizzati per rendere queste barriere vario; per esempio, piastre di mica 1 e tantalio lamina 2. Queste barriere separano efficacemente la piastra mesoderma laterale (LPM), da cui le forme arto germoglio, dai somiti formano dalla mesoderma parassiale. tecniche di innesto chirurgico dimostrano che stretta associazione ingegnoh la somiti è essenziale se iniziazione arto germoglio deve avvenire nel LPM 3 4. Negli anni '80 e '90 biologi dello sviluppo hanno scoperto diffusibile molecole che sono essenziali nel controllo dei processi di sviluppo di segnalazione. Perle imbevuti di queste molecole di segnalazione possono essere impiantati in specifiche regioni del dell'embrione e produrre alterazioni dello sviluppo embrionale. Ad esempio, l'acido retinoico (RA) ripresa da perle di scambio ionico viene rilasciato per un periodo di 24 ore quando impiantato in un embrione di pollo e può produrre speculare la duplicazione delle cifre 5. Eparina perline acrilici contenenti proteine FGF possono avviare arto gemma conseguenza dal interlimb LPM 6.

Più di recente il mouse e pesce genetica hanno preso lo studio dei vertebrati arto iniziazione in una nuova era (rivisto in 7). Ci sono buone evidenze che RA presente nei somiti prima dell'inizio arto gemma è il segnale diffusibile essenziale, prevista dal LPM per avviare arto in erba. Abbiamo voluto sfruttare l'accessibilità e la robustezza sperimentale del embrione di pollo di sezionare l'effetto di sbarramento dell'impianto sull'espressione genica nel LPM intorno al periodo di iniziazione arto gemma. Un romanzo adattamento del nostro metodo è quello di combinare una barriera che blocca i segnali dai tessuti assiali con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I seguenti protocolli sono quelli sviluppati per prendere in giro i meccanismi di induzione arto gemma e l'iniziazione.

Studiare iniziazione arto gemma significa usare embrioni dello stadio precoce. Molte uova di gallina finestra ricercatori di primo rimuovendo alcune dell'albumina attraverso la sacca d'aria con un ago ipodermico. L'embrione, che si trova sulla parte superiore del tuorlo, poi giacere inferiore nell'uovo. Questo è un vantaggio per alcune tecniche, come l'elettroporazione, ma può essere uno svantaggio se manipolazione chirurgica dell'embrione è desiderato.Troviamo avendo l'embrione come vicino all'apertura nell'uovo possibile è un vantaggio.

Le domande rimangono per quanto riguarda i segnali che controllano vertebrati arto induzione gemma e l'iniziazione e le seguenti protocolli sono adatti per affrontarle. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per l'inserimento di barriere per impedire pulcino arto gemma conseguenza in una fase precedente alla fase 12 8. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull'origine e la tempistica di segnali induttivi in ​​cui un tessuto Induzione accessibili si trova adiacente al primordio essere indotta. Purché la regione dell'embrione è accessibile in fase di sviluppo rilevante, quindi una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati in sviluppo del cervello, estensione dell'asse e sviluppo possibilmente organo come fegato o reni induzione.

Protocol

Il seguente protocollo utilizza embrioni di pollo in meno di dieci giorni di incubazione. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Ministero degli Interni.

1. Preparazione necessaria prima di embrione di pollo Operation

  1. Raccogliere i seguenti strumenti chirurgici necessari per le operazioni, per la raccolta e per fissare gli embrioni di pollo: due coppie di n ° 5 orologiai pinze, una coppia di pinze forti, ad esempio, di tipo AA, forbici curve con lame lunghe 2,5 cm, smussato conclusa curvo pinze con estremità lunghe circa 0,5 cm, e anche due coppie di n ° 4 orologiai pinze da usare rendendo barriere lamina (1.6.3).
  2. Fare un micro coltello da un perno in acciaio (0,3 mm di diametro) affilata con olio su una pietra affilatura. Utilizzando un microscopio binoculare, affilare la punta del perno ad una lama piatta. Posizionare il perno in un supporto ago e proteggere la sua estremità appuntita e da urti e denTed.
    NOTA: Rinfoderando il coltello con la punta della pipetta 1000 microlitri è una semplice opzione per questo.
  3. Preparare 70% di etanolo in una bottiglia di lavaggio di plastica. Utilizzare uno spruzzo di questo su un fazzoletto di carta per pulire gli strumenti chirurgici e la micro coltello prima e dopo l'uso per sterilizzare e pulirli.
  4. Acquista 5 cm di larghezza nastro adesivo trasparente e un dispenser adatto. Trova o fabbricare un riposo adeguato per tenere un uovo di gallina stabile su un fianco.
  5. Marca e soluzioni magazzini, perle da bagno.
    1. Preparare una soluzione di 0,35 mg / ml di proteine ​​dei fibroblasti Growth Factor 4 (FGF4) da 1 mg / ml Stock Frozen diluendo con acqua e conservare a -20 ° C in 30 microlitri aliquote.
    2. Preparare soluzioni (sia 0,05 o 0,1 mg / ml) di tutto-trans retinoico (RA) diluito con dimetilsolfossido (DMSO) in provette da microcentrifuga scuri da un / magazzino 5 mg ml. Conservare il magazzino e aliquote di 100 microlitri a -20 ° C.
    3. Preparare soluzioni (sia 2,5 o 5 mg / ml) di BMS 493 (a ag inversaonist di RARs) diluito con DMSO in tubi microcentrifuga scuri da un / magazzino 10 mg ml. Conservare il magazzino e aliquote di 100 microlitri a -20 ° C.
  6. Fare barriere da un foglio di alluminio.
    NOTA: La pellicola usata per fare le barriere è un foglio di ristorazione standard (misurata dal micrometro come spessore 0,013 mm). Ogni foglio di alluminio domestico sarebbe probabilmente adatto.
    1. Tagliare un 1 centimetro quadrato di carta stagnola e sterilizzare lo strofinandola con etanolo al 70% su un tessuto. Posizionarlo su un 6 centimetri di plastica sterile Petri. Eliminare il coperchio e fare un coperchio per il piatto di stagnola.
      NOTA: Questo consentirà di evitare le barriere di taglio da poi attaccare il coperchio di plastica del piatto a causa di statica.
    2. Porre la capsula di Petri in cima ad un reticolo stadio (1 cm di lunghezza diviso in 100 sezioni) sotto un microscopio binoculare con ingrandimento impostato 1.6X. Utilizzando una lama No.15 piccolo bisturi, tagliare le strisce di lamina per una larghezza esatta, ad esempio 0,7 mm o 1,3 mm.
    3. Separare la pellicolastrisce con due coppie di n ° 4 orologiai pinze. Poi fare una curva ad angolo retto nel centro della barriera lamina tale che assomiglia una cerniera della larghezza specifica.
      NOTA: Questa forma di barriera è tratto da 9, 10. Una barriera a cerniera rimane in posizione migliore di una barriera di dritta, piatta. N ° 4 pinze sono relativamente smussato e sono usati perché sono meno propensi a fare ammaccature o punteggi nelle barriere stagnola.
    4. Linea le barriere nel centro del piatto Petri con un lato piatto contro il piatto e l'altra rivolta verso l'alto fuori del piatto, spostando il foglio uncut restante da un lato. Preparare 20 o più barriere prima del giorno di funzionamento. Mettere il coperchio stagnola sopra il piatto e memorizzare le barriere in un luogo dove non sarà disturbato.
      NOTA: Anche un lieve colpo può ribaltare le barriere più o significare che si attaccano con statico ai lati del piatto.
  7. Incubare uova di gallina fecondate dai loro lati su vassoi di cartone uovo a 38 °C per la durata di tempo appropriato prima giornata funzionamento, tali che gli embrioni sarà al desiderato 8 fase.

2. Preparazione di Chick embrioni e perline su Operazione Giorno

  1. 'Finestra' incubate uova di gallina.
    NOTA: Il seguente metodo per l'apertura delle uova è stata trasmessa da Dennis Summerbell (non pubblicata).
    1. Con l'uovo sdraiato su un fianco, forare l'estremità smussata (fine sacco aereo) del l'uovo con una pinza tipo AA forti facendo in modo che la membrana guscio interno è stato rotto. Per fare questo afferrare il forcipe saldamente insieme e utilizzare un movimento accoltellato controllato mentre si tiene l'uovo con la mano libera.
    2. Prendere l'uovo, ancora sdraiato su un lato, in entrambe le mani (una per ogni lato) ruotate di 180 ° lungo l'asse orizzontale e sostituirla nel vassoio di uovo in modo tale che il lato che era superiore è ora accanto al vassoio.
      NOTA: Questo allenta l'embrione dalle membrane guscio e vorrà dire che l'embrione è Less probabilità di essere tagliato quando il guscio sopra l'embrione viene rimosso.
    3. Prendete un pezzo di nastro adesivo trasparente circa 5 cm quadrati e bastone da vicino questo sulla superficie superiore dell'uovo di fermare il guscio dal fatiscente sul dell'embrione quando l'uovo si apre.
    4. Utilizzare le forbici curve per rompere dolcemente attraverso il guscio e le sue membrane nel centro della parte superiore dell'uovo, fare un piccolo foro con una lama delle forbici in modo che l'aria possa entrare nella uova su dell'embrione (che si trova appena sotto la parte superiore del guscio).
      NOTA: basta rompere le membrane del guscio e non rompere qualsiasi delle membrane che coprono l'embrione, aria che penetra l'uovo separerà l'embrione dal guscio e l'embrione verrà a riposo in cima al tuorlo circa 0,5-1 cm dalla shell .
    5. Utilizzare le forbici curve per allargare il foro nel guscio di un cerchio con un diametro di circa 1 cm. Rimuovere il pezzo di guscio di asportato e coprire il buco nel uovo con unpezzo di nastro adesivo trasparente circa 5 cm quadrati. Per rimuovere facilmente questo nastro, premere il nastro per attaccarlo solo al bordo del foro, lasciando il nastro rimane libero. Il nastro libero può quindi essere afferrato per unseal l'uovo.
  2. embrioni fase
    1. Dopo l'incubazione a 38 ° C (vedi punto 1.7) e finestre (passo 2.1), utilizzare un microscopio binoculare per mettere in scena gli embrioni pulcino in base alle 8. Fate questo appena prima che le uova sono sigillati in seguito a finestre. Scrivi la fase di ogni embrione sul guscio d'uovo. Riportare le uova per l'incubatore.
      NOTA: embrioni a tappe tra 8 e 15 sono adatti per esperimenti barriera e perline. Gli embrioni sono più probabilità di sopravvivere se non sono stati lasciati fuori dell'incubatore troppo a lungo prima del funzionamento.
  3. perline ammollo prima del funzionamento.
    1. FGF4
      1. Prendere il numero di perline gel affinità cromatografia (150-300 micron) che si attaccano alla fine di un puntale di 1000 ml ed è statoli h in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) in una provetta per rimuovere il azide sono memorizzati in. Centrifugare per 5 secondi, scartare il PBS e ripetere il processo per due volte.
      2. Impregnano le perline gel in una goccia 30 ml di 0,35 mg / ml di proteine ​​FGF4 su una piastra di Petri sterile in ghiaccio per 30 min. Raccogliere perle di circa 150 micron di diametro con n ° 5 microforceps per l'inserimento in un embrione.
        NOTA: Maneggiare ioni di perle in resina di cambio utilizzato per le seguenti operazioni con n ° 5 microforceps e li presa molto delicatamente, perché le perle sono fragili e possono rompersi se spremuto troppo stretto. Questa avvertenza vale per 2.3.2-2.3.3 e tutte le operazioni di perline di resina.
    2. RA
      1. Scongelare una aliquota di 0,05 o 0,1 mg / ml all-trans-RA diluito con DMSO e una goccia 100 microlitri su una piastra di Petri sterile (9 cm di diametro), che è stato precedentemente rivestito in stagnola per proteggere il RA dalla luce. Prendere una punta della pipetta 10 microlitri e raccogliere qualche scambio sotto forma di ione cloruroperle di resina sulla sua estremità e impregnano questi nella goccia RA riparo dalla luce a temperatura ambiente per 20 min.
      2. Lavare le perline in tre gocce successive di 100 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) posti sulla stessa piastra Petri di almeno 1 cm di distanza.
        NOTA: Le perle occupano il colorante rosso fenolo dalla DMEM. Questo metodo si basa su 5.
      3. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro (perline variano nel formato 75-180 micron quando è bagnato) per l'inserimento in un embrione, utilizzando un vetrino reticolo fase di microscopio sotto le Petri piatto e No.5 microforceps per tenere le perline. Quando si solleva il tallone dal menu a 100 ml di DMEM, il primo posto il tallone verso il basso sulla piastra di Petri e rimuovere eventuali residui di DMEM da esso sia spingendo il tallone fuori dalla caduta o mettendo le pinze chiuse accanto al tallone (capillare azione trae il liquido dal tallone).
    3. BMS 493
      1. Per quanto riguarda la RA (2.3.2), immergere exch ioniperle di resina ange in una goccia 100 ml di 2,5 o 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO a temperatura ambiente per 20 minuti quindi risciacquare in 100 gocce microlitri di DMEM. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro per l'inserimento nell'embrione.
    4. controllo DMSO
      1. Come per il RA (2.3.2), immergere perle di resina a scambio ionico in una goccia 100 ml di DMSO a temperatura ambiente per 20 minuti quindi risciacquare in 100 gocce microlitri di DMEM. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro per l'inserimento nell'embrione.

3. Le operazioni barriera e Perle

Figura 1
Figura 1. Schema di Chick embrioni di varie fasi che mostra dove le barriere e le perline o deve essere collocato. (A) Fase 13 embrionali di pollo posizione che mostra schema barriera (linea verde) tra i metameri e LPM presso la presunzionelivello dell'ala tivo (somiti 15-20). (B) Lo stesso schema come in (A), che indica dove branello RA (cerchio rosso) deve essere collocato prima dell'inserimento barriera. (C) posizione schematiche barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva (somiti 26-32) in una fase embrionale 15. (D) Lo stesso schema come in (C), che indica dove dovrebbe essere collocato un branello RA (cerchio rosso). (E) Schema che indica dove BMS 493 perline (cerchi viola) devono essere collocati nel LPM di una fase embrionale 15. (F) Schema di uno stadio 9 embrione di pollo che indica la posizione di barriera (linea verde) tra il mesoderma presomitic e LPM a livello dell'ala presuntiva. (G) Schema di uno stadio embrionale 9 che mostra le posizioni di una barriera (linea verde) e RA tallone (cerchio rosso). (H) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo che mostra la posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva. (I 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Barriera inserita in fase 13 per prevenire l'iniziazione ala nascere.
    1. Prendere una fase embrionale 13 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce. Rimuovere lo strato superiore del nastro adesivo trasparente.
      1. Utilizzando una micro coltello in acciaio, fare una incisione attraverso la membrana vitellina e la piastra laterale mesoderma (LPM) adiacente a somiti 15 a 20 (Figura 1A) sul lato destro dell'embrione (somiti non hanno tutte formate in questa fase). Tagliare adiacente agli ultimi quattro somiti formate e continuare il taglio di due lunghezze somite caudale.
      2. Raccogliete la barriera (larghezza 0,7-1 mm) con n ° 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. La barriera a forma di cerniera adagiata sulla membrana vitellina di sopra del LPM con la metà di esso che sporge verso il basso attraverso il distale incisione per i somiti. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice.
        NOTA: Il micro coltello e pinze diventare appiccicoso a contatto con la membrana vitellina. È importante pulirli con etanolo al 70% prima di un'operazione successiva. Questo vale per tutte le successive descrizioni di funzionamento e da bordare implantologia.
      3. Se un cordone deve essere inserito in combinazione con una barriera; in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1B). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore.
    2. Barriera inserita in fase 15 a prevenire l'innesco gemma gamba.
      NOTA: Un esempio del risultato di tale operazione sul Tbox 4 fattore di trascrizione (Tbx4) espressione è mostrato nella Figura 2D e 2E.
      1. Prendere un embrione fase 15 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce. Rimuovere lo strato superiore del nastro adesivo trasparente.
        1. Usando un coltello in acciaio micro fare una incisione attraverso la membrana vitellina e LPM adiacente somiti 26 a 32 (Figura 1C) sul lato destro dell'embrione (somiti non hanno tutte formate in questa fase). Tagliare adiacente alle ultime due somiti formate e continuare i taglio di cinque lunghezze somite caudale.
        2. Sollevare la barriera (larghezza 1,2-1,3 mm) con No. 5 microforceps ad una estremità e ruotare la barriera di inserire l'estremità libera nel dell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con un nastro adesivo trasparenteND restituirlo al incubatrice.
          NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina di sopra del LPM con la metà di esso che sporge verso il basso attraverso il distale incisione per i somiti.
        3. Se un cordone deve essere inserito in combinazione con una barriera, in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1D). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore.
        4. Se una perlina o perle sono da inserire, senza una barriera, ad esempio, BMS 493 perline per la regione gamba in fase di 15, non fanno la lunga incisione (3.2.2.1). Fai una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel LPM nella posizione il tallone deve essere collocato. Prendere il tallone in n ° 5 microforceps e inserirlo nel foro nel LPM. Spingere in un po 'più con le estremità chiuse della pinza (Figura 1E).
      2. Barriera inserita in fase 9 per evitare che un'ala di induzione gemma e l'iniziazione.
        1. Prendere una fase 8 o 9 embrione dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore, se si preferisce.
          1. Usando un coltello in acciaio micro fare un'incisione attraverso la membrana vitellina e LPM laterale e rostrale della stria primitiva, alla fine caudale dell'embrione in linea con le somiti (Figura 1F) circa 5 somite lunghezza lungo.
          2. Sollevare la barriera (larghezza 0,7-1 mm) con No. 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice.
            NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina sopra il LPM con la metà di esso sporge verso il basso attraverso l'incisione.
          3. Se un tallone è di essere inserted in combinazione con una barriera; in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1G). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore.
      3. Barriera inserita in fase di 10 per evitare l'induzione gemma gamba e iniziazione.
        NOTA: Un esempio del risultato di questa operazione sull'espressione Tbx4 è mostrato in Figura 2G.
        1. Prendere un embrione fase 10 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce.
          1. Usando un coltello in acciaio micro fare una incisione attraverso la membrana vitellina e LPM lateralmente alla linea primitiva, alla fine caudale dell'embrione in linea con somiti (Figura 1H) circa 6 somite lunghezze grande.
          2. Raccogliete la barriera (1.2mm di larghezza) con No. 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice.
            NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina sopra il LPM con la metà di esso sporge verso il basso attraverso l'incisione.
          3. Se un cordone deve essere inserito senza barriera, ad esempio, BMS 493 tallone alla zona della gamba nella fase 10, fare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel LPM nella posizione il tallone deve essere collocato. Prendere il tallone in n ° 5 microforceps e inserirlo nel foro nel LPM. Spingere in un po 'più con le estremità chiuse della pinza (Figura 1 decies).
      4. 24 ore o più dopo che operano controllare la posizione della barriera rispetto al germoglio arto controlaterale emergente. Eliminare eventuali embrioni in cui la barriera non è chiaramente opposite la gemma arto sinistro. In questo caso la barriera è stata erroneamente posizionato.

      4. La raccolta embrioni, Fissazione e preparazione per Wholemount ibridazione in situ (WISH)

      1. embrioni raccolta inviare operazione.
        1. embrioni Harvest allo stadio 19-23 in modo tale che arto gemma morfologia è chiaramente visibile in entrambi i lati di controllo gestite e controlaterale.
          1. Con le forbici curve tagliare un foro più grande nel guscio d'uovo. Tagliare tutto l'embrione tenendo il vaso sanguigno grande da sinistra dell'embrione con microforceps. Utilizzare questa presa della nave per rimuovere l'embrione e metterlo in una capsula di Petri di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,3.
          2. Sotto un microscopio binoculare, sezionare vasi embrionali supplementari e membrane utilizzando una combinazione di forbici curve e non. 5 microforceps. Togliere la testa con le forbici.
      2. Fissazione di embrioni post-raccolta.
        1. Utilizzando blun curvot pinze, sollevare l'embrione e collocarlo in 5 ml 4% paraformaldeide (PFA) in PBS a temperatura ambiente per due ore e poi dondolo a 4 ° C durante la notte in una bottiglia di vetro da 20 ml con tappo a vite.
          Attenzione: PFA è un serio pericolo per la salute. Si tratta di un nocivo, irritante corrosivo e la polvere deve essere impedito di venire a contatto con la pelle, occhi e polmoni. Utilizzare indumenti protettivi personali e una cappa aspirante durante la preparazione della soluzione. Una volta che si tratta di una soluzione al 4%, guanti, occhiali di protezione e un camice da laboratorio devono essere indossati.
          NOTA: E 'importante per ottenere gli embrioni in fix velocemente per meglio preservare l'integrità mRNA.
      3. La rimozione delle barriere prima di wholemount in ibridazione in situ.
        NOTA: Le barriere vengono rimossi perché sono taglienti e possono danneggiare gli embrioni come vanno attraverso il protocollo in situ, soprattutto se diversi embrioni sono macchiati in una sola volta.
        1. A seguito di fissaggio, posizionare l'embrione in un piatto di PBS in un mi binocolocroscope.
        2. Utilizzando due coppie di No. 5 microforceps, posizionare la coppia sinistra strettamente lati della barriera nel lato operato dell'embrione. Afferrare la barriera con la coppia di destra e tirare delicatamente la barriera dall'embrione utilizzando la coppia di sinistra per mantenere l'embrione giù e per evitare qualsiasi tessuto aderisca allo sbarramento come viene rimosso.
      4. Effettuare WISH essenzialmente come descritto in 11.

Representative Results

Il protocollo descritto sopra descritti i metodi utilizzati per Nishimoto et al. 2015. Il documento studia arti induzione gemma e l'iniziazione sia in primo piano e arti posteriori del embrione di pollo. I risultati dopo l'inserimento di barriere impermeabili per evitare la conseguenza della gemma zampa anteriore sono stati pubblicati in precedenza 1, 2, 9, ma c'è stato solo uno studio che descrive gli ostacoli che impediscono la gamba gemma iniziazione 1. I dati degli arti posteriori da Nishimoto et al. 2015 sono presentati qui come risultati rappresentativi dello studio di espressione di mRNA seguenti inserimento di barriera.

Tbx4 ​​Espressione nella LPM non è sufficiente ad avviare degli arti posteriori escrescenza:
Figure 2B e C (Tabella 2) mostra che l'inserimento facilitato nella fase 15 (Figura 2A) (vedi protocollo 3.2) porta ad entrambi FGF10ed espressione Fgf8 assente nella zona della gamba germoglio (indicato con staffa) sul lato destro operato. Confronto con il lato non operato di sinistra. Tuttavia, l'espressione Tbx4 è osservata sia fase 19 e la fase 23 sul lato operato (Figura 2D e E). Concludiamo che l'espressione Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare degli arti posteriori escrescenza dal LPM. Altri studi nel pulcino hanno suggerito che l'espressione TBX gene è sufficiente per avviare la formazione degli arti anteriori gemma 12, 13.

Figura 2C 'è incluso per illustrare come una barriera sembra inserita in regione tappa del fissaggio dell'embrione palo. Nella maggior parte dei casi ostacoli sono stati rimossi prima ibridazione in situ (protocollo 4.3).

RA dalle Somiti è essenziale nel LPM prima FGF10 Induce Limb Bud Outgrowth:
La figura 3A è uno schema che rappresenta l'aggiunta di un distale tallone RA imbevuto di una barriera inserita nella fase 15 (protocollo 3.2.1.3). Successivamente a tale operazione escrescenza arto gemma (contrassegnata da un asterisco) si osserva sul lato destro gestito e Tbx4, FGF10 e Fgf8 sono espressi sul nascere come sono nel lato di comando sinistra (Figura 3B, C e D, tabella 2) . Così aggiunta di RA al LPM supera l'effetto barriera e degli arti procede iniziazione gemma. Abbiamo concluso che in normali RA sviluppo dal somiti è essenziale nella LPM prima conseguenza arto gemma può essere avviata. I germogli arti posteriori risultanti sono generalmente più piccoli di quelli sul lato di controllo. Ciò può essere dovuto alla dose RA nella LPM non essendo equivalente alla situazione wild type. Se la dose RA è troppo alto il apicale ectodermica Ridge (ARE) può essere abbreviato e boccioli più piccoli si tradurrebbe14, 15.

Per confermare che RA (dai somiti) nella LPM è necessaria per la normale iniziazione arto gemma un agonista inverso di RAR, BMS 493, è stato utilizzato. Beads vengono impiantati nella regione LPM gamba allo stadio 15 (vedi protocollo 3.2.1.4) (Figura 3E). Espressione FGF10 è downregulated seguente applicazione di BMS 493 perline in LPM, con conseguente più piccole gemme arti posteriori rispetto al lato di controllo (Figura 3F; Tabella 3). Le sfere di controllo DMSO non causano questi difetti (Figure 3G e 3H; Tabella 3). I difetti osservati dopo l'applicazione BMS 493 sono più miti rispetto a quelli indotti da un'operazione di sbarramento; vale a dire, FGF10 è ancora espresso e si formano gemme degli arti. Questo è probabilmente perché gli effetti di BMS 493 sono limitate a livello locale intorno alle perline e potrebbero non essere in grado di antagonizzare tutto il RA prodotto da axiAl tessuti.

All'inizio Segnali assiali Specificare le cellule LPM che espresso poi Tbx4:
Abbiamo testato quando il LPM acquisisce la sua capacità di esprimere Tbx4 nella regione prospettico gamba di formazione. La prima fase in cui un ostacolo può essere inserito che saranno successivamente bloccare gamba gemma conseguenza, è palcoscenico 10. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per inserire le barriere nelle fasi precedenti alla fase 12. Le barriere inseriti tra il mesoderma parassiale e la gamba presuntiva LPM nella fase 10 (vedi protocollo 3.4) formazione di gemme blocco gamba e l'espressione del Tbx4 alla gamba formazione LPM (figure 2F e 2G, Tabella 2), suggerendo che un segnale da tessuti assiali nella fase 10 è necessaria per l'espressione successiva Tbx4 in hindlimb LPM. Confrontare questo risultato con le figure 2D e E dove l'inserimento di barriera in seguito permette l'espressione Tbx4da stabilire. Inoltre, abbiamo testato se questo segnale assiale potrebbe essere RA osservando se l'agonista inverso di RAR riduce espressione Tbx4. Un BMS 493 tallone collocato nella LPM arti posteriori allo stadio 10 (vedi protocollo 3.4.1.3) diminuisce l'espressione Tbx4 (figure 2H e 2I), mentre sfere di controllo imbevuti di DMSO non influenzano l'espressione Tbx4 (figure 2J e 2K). Insieme, questi risultati supportano un modello che un segnale RA dai tessuti assiali regola induzione arto regolando positivamente Tbx4 in arti posteriori LPM 7.

La morte post-operatorio:
Tabelle 1, 2 e 3 forniscono dettagli di risultati sperimentali, tra cui il numero di embrioni di pollo, che è morto post operazione e prima della raccolta. Alcuni decessi sono da aspettarsi dopo microchirurgia di questa natura. La morte numeri può essere mantenuto al minimo facendo in modo che gli strumenti sono pulite, il foro nell'uovo è la dimensione minima richiesta, che gli embrioni sono lasciati senza la protezione della guarnizione nastro adesivo per un tempo minimo e, in combinazione con questo ultimo punto che l'operazione viene effettuata il più rapidamente possibile. Nessuna di queste operazioni sono molto in termini di tempo, ma le operazioni che coinvolgono perline e barriere prendere un po 'più di tempo. Nonostante queste misure, le operazioni effettuate nelle prime fasi e quelle della regione dell'ala hanno maggiori probabilità di provocare la morte. Ci sono grandi vasi sanguigni intorno alle regioni degli arti di formazione e la rottura accidentale di questi vasi possono portare alla morte a causa di perdita di sangue. Troviamo che le uova aperte in fase di 8 o 9, in cui gli embrioni non sono stati operati, spesso muoiono entro il giorno successivo. Pertanto, l'unica soluzione a questi problemi è di effettuare un elevato numero di esperimenti.

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Figura 2. Marker I cambiamenti di espressione genica seguenti barriera o tallone di inserimento presuntiva Leg livello. (A) posizione mostra Schema barriera (linea verde) a livello delle gambe presuntiva (somiti 26-32) in una fase embrionale 15. (B - E e G) analisi WISH sugli embrioni gestite. La regione gamba è delineato (parentesi). (B) l'espressione FGF10 è assente nel LPM operato, ma l'espressione robusto viene rilevato sul nascere sinistra. (C) espressione Fgf8 è assente nel lato operato, suggerendo non c'è AER. (C ') Lo stesso embrione prima della barriera è stato rimosso. (D) Tbx4 è espresso nel LPM allo stesso livello rostro-caudale come il germoglio di controllo. (E) espressione Tbx4 è mantenuto nella regione gamba destra nonostante assenza di crescita dell'arto. (F) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo mostrando posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva. (G) espressione Tbx4 è assente nel operato destra LPM (staffa). (H) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo mostrando BMS 493 posizione tallone (cerchio viola) a livello della gamba presuntiva. (I) espressione Tbx4 è inibiti sul lato destro azionato dopo trattamento con BMS 493. (J) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo che mostra controllo di posizione DMSO tallone (cerchio grigio). (K) Tbx4 è espresso sul lato destro funzionare ad un livello simile a quello del controllo laterale sinistra seguendo trattamento con solo DMSO. Questa cifra è stata modificata da 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Assenza Figura 3. RA Rescues Limb di Bud causato dalla Barriera inserimento ed è essenziale nel LPM Prima di Leg Bud escrescenza. (A) Schema che indica la posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva (somiti 26-32) ed un tallone RA-imbevuto (cerchio rosso). (B - D) RA salvataggi escrescenza gamba gemma (indicato da un asterisco). (B) l'espressione Tbx4 è presente sul nascere gamba salvato simile al lato non-operato. (C) FGF10 è espressa nella gamba salvato gemma simile al lato non-operato. (D) Fgf8 si esprime nella AER della gemma gamba destra in salvo. (E) Schema che indica dove BMS 493 perline (cerchi viola) sono stati collocati in una gamba LPM presuntiva di fase 15 embrioni. (F) espressione FGF10 è downregulated sul lato destro gestito e il bocciolo gamba è piccolo BMS 49 segue3 trattamento. Beads sono asterisco. (G) schematica simile a (E), che indica la posizione di controllo DMSO perline (cerchi grigi). (H) perle di DMSO (indicati con un asterisco) non ha modificato l'espressione FGF10 o dimensione gamba gemma. Questa cifra è stata modificata da 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Barriera Fase posto (+ tallone) * numero operato Ala mancante ** Ala presente ** numero morti
fase 12-14 40 24 1 15
fase 8/9 65 23 0 42
Fase 12-13 (FGF4 tallone) 41 7 (mancante tallone) 17 17
Fase 12-13 (RA tallone) 75 9 (mancante tallone) 32 34
Tappa 13 (microsfera di controllo) 5 3 0 2
* 0,7-1 mm barriere stagnola poste tra somiti 15-20 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA.
microsfera di controllo DMSO.
** fasi embrioni di pollo fisse 21-23

Tabella 1. Ala Livello barriera e Experiment Bead risultati.

Barriera Fase posto (+ tallone) * numero operato Leg mancante ** Leg presente ** numero morti
fase 12-15 43 39 0 4
fase 10/11 23 16 0 7
Fase 15 (tallone FGF4) 8 0 5 3
Fase 15 (tallone RA) 18 0 18 0
* 0,7-1,3 mm barriere stagnola poste tra somiti 26-32 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA.
** fasi embrioni di pollo fisse 18-24

Tabella 2. Leg Barriera e Bead Esperimento risultati.

numero operato Leg gemma piccola Leg gemma po 'piccolo Leg gemma dimensioni normali numero morti
BMS 493 perline *
15 12 3 0 0
perline DMSO **
12 0 3 9 0
* 2-3 perline imbevute di 5 mg / ml BMS 493 collocati nella giusta fase 14-15 LPM a livello della gamba.
** 2-3 perline imbevute di DMSO solo collocati nella giusta fase 15 LPM a livello delle gambe.
embrioni di pollo fissati nelle fasi 17-19.

Tabella 3. Leg livello BMS 493 Bead Experiment risultati.

Discussion

Descriviamo l'uso di barriere impermeabili per evitare formazione di gemme arto in embrione di pollo. Questa tecnica ha un numero di passaggi critici. A seguito di esperimenti preliminari, abbiamo scoperto che le forma di cerniera barriere utilizzati in 9, 10 restano in vigore nell'embrione molto meglio di barriere diritte. Il lato piatto distale della barriera attacca alla membrana vitellina e mantiene la barriera in posizione (Figura 2C '). Una preparazione accurata di cerniera barriere sagomati di un foglio di alluminio come descritto al punto 1.6 del protocollo è essenziale per il successo dell'operazione. Un secondo passo importante è quello di garantire che le uova non sono lasciati fuori dell'incubatore per troppo tempo in seguito a finestre e messa in scena prima di operare su l'embrione. Nella nostra esperienza, embrioni sopravvivono un'operazione meglio se sono in prossimità o temperatura di incubazione quando l'operazione viene eseguita. Le operazioni dovrebbero quindi essere effettuate il più rapidamente possibile e le uova risigillati prontamente per garantire i tassi di sopravvivenza buoni. Molti ricercatori aggiungere una goccia di antibiotici per l'embrione seguente microchirurgia prima di ritornare le uova per l'incubatore. La presenza del liquido impedito le barriere di attaccarsi bene in posizione. L'aggiunta di antibiotici potrebbe anche rimuovere perline dopo il posizionamento. Quindi non l'uso di antibiotici, le operazioni veloci e buona la pulizia con strumenti si raccomanda di evitare l'infezione. Pulendo strumenti con il 70% di etanolo dopo ogni fase di un'operazione è essenziale per prevenire gli strumenti di diventare appiccicoso dal contatto con la membrana vitellina che può causare sia barriere o perline di aderire alla pinza (vedere il passaggio del protocollo 3.1.2.2). Entrambe le varietà di perline usati potrebbero cadere fuori luogo dopo l'operazione. Quando la posizione barriera è stata verificata il giorno successivo non era possibile vedere attraverso la barriera di verificare se il tallone è rimasto in luogo o meno. Nei casi in cui il tallone era caduto ala gemma conseguenza non è stato salvato (

Questo protocollo modifica esperimenti precedentemente pubblicati che hanno usato le barriere per impedire arto iniziazione gemma, definisce specifiche larghezze ottimali per le barriere e introduce la combinazione di barriera e il posizionamento tallone seguita da analisi di espressione genica. Abbiamo trovato con un foglio di alluminio convenzionale, che è a buon mercato e facilmente reperibili in tutti i laboratori, produce risultati uguali a quelli che in precedenza utilizzati fogli di tantalio. Il foglio può essere lasciato nell'embrione quando effettuano ibridazione in situ (Figura 2C ') ma di solito rimuoverlo se più di un embrione viene elaborato per evitare gli spigoli della lamina danneggiare embrioni. PStudi Ilot dimostrato che la larghezza della regione gamba barriere è particolarmente importante. Inizialmente le barriere trialed erano troppo breve e escrescenza gamba germoglio non è stato impedito. 1,2-1,3 mm è la larghezza ottimale per una barriera per bloccare completamente escrescenza germoglio gamba. Le barriere ala più stretti che si può collocare con precisione per evitare conseguenza gemma danno i migliori tassi di sopravvivenza. Questo può essere il più stretto 0,5-0,7 mm. Tuttavia, le barriere che sono un po 'più ampio hanno maggiori probabilità di tradursi in completo blocco di ala escrescenza gemma perché consentono per un po' di imprecisione di posizionamento (abbiamo usato 0,7-1 mm). Prevenzione dei vasi sanguigni quando si effettua l'incisione è fondamentale per le barriere a livello dell'ala nascere. barriere semi-permeabili sono state precedentemente utilizzato per tagliare in due la gemma pulcino arto. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell 1979 filtri sia utilizzato 0,45 micron e 0,8 micron di dimensione dei pori, rispettivamente, 16, 17. Essi hanno riferito che i segnali diffusibili potrebbero passare attraverso i pori nei filtri e chei risultati hanno guadagnato con barriere semi-permeabile erano a metà strada tra un bocciolo arto con alcuna barriera presente e uno con una barriera foglio di tantalio impermeabile. Questo protocollo potrebbe essere adattato per usare barriere semipermeabili di varia dimensione dei pori di differenziare segnali candidati in base alle dimensioni o per modificare la dinamica di diffusione del segnale.

Questo protocollo ha varie limitazioni principalmente associati al modello organismo stesso. Tali tecniche potrebbero essere utilizzati per sondare ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti e anche altre questioni di embriogenesi dei vertebrati. Una condizione è che l'organo / area in questione dovrebbe essere in via di sviluppo quando l'embrione pulcino è accessibile a un intervento. La presenza di grandi vasi sanguigni nella zona in cui una barriera deve essere posizionato rende il posizionamento barriera dopo le fasi 13 o 14 tecnicamente impegnativo. Se grandi vasi sanguigni sono tagliati durante il posizionamento barriera questo può causare la mortalità embrionale. La nostra indagine di quando i fattori di trascrizione TBX5 e Tbx4 vengono prima indotte nel LPM è stata limitata dalla prima fase in cui potremmo mettere una barriera che avrebbe poi finire opposta sia l'ala o un batuffolo di gamba, rispettivamente. Potrebbe essere illuminante per tentare di bloccare TBX induzione genica nelle fasi precedenti, più vicino alla gastrulazione. La prima barriera potrebbe essere collocato nella regione fascia presuntiva era successo fase 8 e nella fase zona della gamba 10. Questo protocollo non è probabilmente adatto per lo studio dell'espressione genica oltre fasi arto germoglio perché successiva crescita rapida sposterebbe la barriera e risultati concerne solo alla posizione iniziale della barriera.

Dopo aver correlate i limiti del embrione di pollo in questo contesto, i suoi vantaggi rispetto ad altri organismi modello vertebrati sono molti. L'embrione di pollo è un modello animale molto adatto per questo tipo di intervento fisico in un embrione vertebrato. Gli embrioni sono relativamente grandi e sono facilmente accessibili throuGH guscio d'uovo. Si può tornare all'embrione per ulteriori sperimentazioni (ad esempio, la rimozione di un cordone 18 o anche una barriera) o per verificare progresso semplicemente rimuovendo la finestra del nastro. Non è possibile campo di applicazione alle immagini dal vivo o l'imaging lasso di tempo. Descriviamo un metodo di windowing uova di gallina che è particolarmente adatto per operare su embrioni in fase iniziale. Nel caso di studi degli arti è molto importante ed utile che ci sia un arto di controllo controlaterale per ogni esperimento che serve come controllo interno ideale per ogni replica biologica.

La combinazione di utilizzo di barriere impermeabili per evitare arto conseguenza e perline imbevuto di molecole di segnalazione non è stata segnalata in precedenza. La nostra analisi di espressione dell'mRNA a seguito di tali interventi è anche romanzo. Queste tecniche ci hanno permesso di sezionare il difficile problema di quando specifici fattori di trascrizione degli arti Tbx5 e Tbx4 sono indotti nel LPM e ancheper dimostrare che successivamente, prima dell'inizio arto germoglio, la presenza di questi geni tbx nel LPM non è sufficiente per l'attivazione di FGF10 trascrizione e l'inizio di conseguenza arto gemma. Figure 2G, 2D e 2E illustrano bene questi risultati. L'assenza di espressione Tbx4 seguito dell'inserimento di una barriera nella fase 10 nella figura 2G è in netto contrasto con la sua presenza in 2D e 2E seguente inserimento facilitato nella fase 15, dopo l'induzione di Tbx4. L'impianto di perline RA imbevuti facilitato il salvataggio di arto iniziazione gemma dopo l'inserimento di barriera e così indica RA dai somiti che sono essenziali nel LPM prima arto gemma conseguenza può iniziare. Tali tecniche potrebbero essere usate per risolvere ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti, ma anche altre questioni di vertebrati embriogenesi. Aree del cervello, occhio e tronco sono suscettibili di essere adatto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 Fine Science Tools  www.finescience.de 11241-30
Dumont strong forceps, type AA Fine Science Tools  www.finescience.de 11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long Fine Science Tools  www.finescience.de 14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long Fine Science Tools www.finescience.de 11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide Fine Science Tools  www.finescience.de 26002-20
Sharpening stone, square Fine Science Tools  www.finescience.de 29008-01
Mineral oil
Needle holder Fine Science Tools  www.finescience.de 26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m www.5staroffice.com 295985
FGF4 protein A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid Sigma www.sigmaaldrich.com R2625-50MG Remember to protect from light.
BMS 493 Sigma www.sigmaaldrich.com B6688-5MG
Scalpel blade No. 15 www.swann-morton.com cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel Bio-Rad www.bio-rad.com 153-7301 Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin Bio-Rad www.bio-rad.com 140-1251 Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs Memmert www.hce-uk.com LAB128
Paraformaldehyde (PFA) Sigma www.sigmaaldrich.com P6148-1KG Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol Sigma www.sigmaaldrich.com 32221-2.5L
DMEM, high glucose Gibco www.thermofisher.com 41965-039 500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific webshop.fishersci.com D/4121/PB08 500 ml
Binocular Microscope  Leica www.leica-microsystems.com MZ6 Replaced by M60
Chicken eggs Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com Brown Eggs

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References

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L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick
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Cite this Article

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).More

Wilde, S., Logan, M. P. Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick. J. Vis. Exp. (117), e54618, doi:10.3791/54618 (2016).

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