Abstract
Kycklingembryo ger en superb ryggradsdjur modell som kan användas för att dissekera utvecklingsmässiga frågor på ett direkt sätt. Dess tillgänglighet och robusthet efter kirurgiskt ingrepp är viktiga experimentella styrkor. Mica plattorna var de första hindren som används för att förhindra chick lem knopp initiering 1. Protokoll som använder aluminiumfolie som en ogenomtränglig barriär mot ving knopp eller ben knopp induktion och eller initiering beskrivs. Vi kombinerar denna teknik med pärla placering i sidled till hinder för exogen tillförsel kandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Resultaten analyseras med användning av in situ-hybridisering av efterföljande genexpression. Vårt huvudsakliga fokus ligger på sig rollen av retinsyra signalering i induktion och senare initiering av kycklingembryo förgrunden och bakbenen. Vi använder BMS 493 (en invers agonist av retinsyrareceptorer (RAR)) bomullstrasa pärlor implanterade i den laterala plattan mesoderm (LPM) för att efterlikna effekten av en bartransportören placeras mellan somites (en källa av retinsyra (RA)) och LPM som lem knoppar växa. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler. Förutsatt den region i kycklingembryo är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, kan en barriär placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan återfinnas i den växande hjärnan, axel förlängning och organutveckling, såsom lever eller njure induktion.
Introduction
Klassiska embryologer traditionellt användes fysiska tekniker för att förhöra de mekanismer som styr embryoutveckling. Under 1960- och 1970-talet utvecklade utredare tekniker som används ogenomträngliga barriärer insatta mellan vävnader i det utvecklande embryot att visa betydelsen av induktiva signaler under embryogenes. Vårt intresse är i ryggradsdjur lem utveckling och i synnerhet vilka händelser före lem knopp utväxt. Till exempel kan insättningen av en barriär förhindrar extremitetsanlag utväxt från att uppstå på en sida av kycklingembryo och tillåta det att fortsätta normalt på den kontra, oanvänd sida. Material som används för att göra dessa hinder varierad; exempelvis glimmerplattor 1 och tantal folie 2. Dessa hinder effektivt separera sidoplåten mesoderm (LPM), från vilken lem knopp former, från somites bildas från det paraxiella mesoderm. Kirurgiska ympning tekniker visar att nära samarbete with somites är en förutsättning för att lem knopp initiering skall ske i LPM 3 4. På 80-talet och 90-talet upptäckte utvecklingsbiologer diffunderbara signalmolekyler som är nödvändiga för att kontrollera utvecklingsprocesser. Pärlor indränkt med dessa signalmolekyler kan implanteras i specifika regioner i embryot och producera ändringar i embryonal utveckling. Till exempel är retinsyra (RA) tas upp av jonbytarmaterial pärlor frisätts över en 24-timmarsperiod när de implanteras in i en kycklingembryo och kan producera spegelbild dubblering av siffrorna 5. Heparin akrylpärlor innehållande FGF protein kan initiera lem knopp utväxt från interlimb LPM 6.
På senare tid har mus och fisk genetik har tagit studien av ryggradsdjur lem inledande in i en ny era (översikt i 7). Det finns goda bevis för att RA förekommer i somites före lem knopp initiering är det väsentliga diffunderbart signal som krävs av LPM att initiera lem spirande. Vi ville utnyttja tillgängligheten och experimentell robusthet kycklingembryo att dissekera effekten av barriär implantation på genuttryck i LPM runt tiden för lem knopp inledande. En ny anpassning av vår metod är att kombinera ett hinder som blockerar signalerna från axiella vävnader med pärla placering i sidled till hinder för exogent försörjningskandidat endogena faktorer som har blockerats av barriären. Följande protokoll är de som utvecklats för att locka fram de mekanismer för lem knopp induktion och initiering.
Studera lem knopp initiering innebär att använda embryon tidigt stadium. Många forskare fönster hönsägg genom att först ta bort en del av albumin genom luftsäcken med en injektionsnål. Embryot, som ligger på toppen av äggulan, därefter kommer att ligga lägre i ägget. Detta är en fördel för vissa tekniker, såsom elektroporation, men kan vara en nackdel om kirurgisk manipulation av embryot önskas.Vi finner att ha embryot så nära öppningen i ägget som möjligt är en fördel.
Frågor kvarstår om de signaler som styr ryggradsdjur lem knopp induktion och initiering och följande protokoll är lämpliga för att ta itu med dem. Vi är de första att utveckla ett protokoll för införande av barriärer för att förhindra chick lem knopp utväxt på ett stadium tidigare än steget 12 8. Modifierade versioner av dessa protokoll kan också användas för att ta itu med andra frågor om ursprung och tidpunkten för induktiva signaler där en tillgänglig inducerande vävnad ligger intill primordium induceras. Förutsatt regionen av embryot är tillgänglig vid den aktuella utvecklingsstadiet, då en barriär skulle kunna placeras mellan de två vävnaderna och därav följande förändringar i utvecklingen som studerats. Exempel kan hittas i hjärnans utveckling, axel förlängning och eventuellt organutveckling såsom lever eller njure induktion.
Protocol
Följande protokoll använder kycklingembryon vid mindre än tio dagars inkubation. Alla experiment utfördes i enlighet med Kings College London, Storbritannien och riktlinjerna för brittiska inrikesdepartementet djurskötsel.
1. Förberedelser krävs före kycklingembryo Operation
- Samla följande kirurgiska instrument som behövs för verksamheten, för skörd och för fastställande av kycklingembryon: Två par av nr 5 urmakare pincett, ett par starka tång, t.ex. typ AA, böjd sax med blad 2,5 cm långa, trubbiga ändar böjda pincett med ändarna ca 0,5 cm långa, och även två par nr 4 urmakare pincett för att använda samtidigt som foliebarriärer (1.6.3).
- Gör en mikro kniv från en stålstift (0,3 mm i diameter) slipas med olja på en skärpning sten. Med användning av ett binokulärt mikroskop, skärpa spetsen av tappen till ett platt blad. Placera stiftet i en nålhållare och skydda sin vassa änden från att knuffas och dented.
OBS: inkapsling av den kniv med en 1000 mikroliter pipettspets är ett enkelt alternativ för detta. - Förbered 70% etanol i en plasttvättflaska. Använd en skvätt detta på en pappersnäsduk för att torka de kirurgiska instrument och mikro kniven före och efter användning för att sterilisera och rengöra dem.
- Köp 5 cm bred klar tejp och en lämplig dispenser. Hitta eller tillverka en vila lämplig att hålla ett hönsägg stadigt på sin sida.
- Gör och butikslösningar för blötläggning pärlor.
- Förbered en 0,35 mg / ml lösning av Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) protein från 1 mg / ml fryst lager genom att späda den med vatten och förvara vid -20 ° C i 30 pl alikvoter.
- Förbered lösningar (antingen 0,05 eller 0,1 mg / ml) av all-trans-retinoinsyra (RA) utspädd med dimetylsulfoxid (DMSO) i mörka mikrocentrifugrör från en 5 mg / ml lager. Lagra lager och 100 | il alikvoter vid -20 ° C.
- Bereda lösningar (antingen 2,5 eller 5 mg / ml) av BMS 493 (en invers agonist av RAR) utspädd med DMSO i mörka mikrocentrifugrör från en 10 mg / ml lager. Lagra lager och 100 | il alikvoter vid -20 ° C.
- Gör hinder från aluminiumfolie.
OBS: Folien används för att göra de hinder är standard catering folien (mätt med mikrometer som 0,013 mm tjock). Alla inhemska aluminiumfolie skulle sannolikt vara lämpliga.- Skär en 1 cm fyrkantig bit av aluminiumfolie och sterilisera den genom att torka av den med 70% etanol på en vävnad. Placera den på en 6 cm steril plast petriskål. Kasta locket och gör ett lock för skålen från folien.
OBS: Detta förhindrar de kapade hinder från senare fastnar på plastlock av skålen på grund av statisk. - Placera petriskål ovanpå en scen graticule (1 cm lång delas upp i 100 delar) under ett binokulärt mikroskop med förstoring inställd på 1,6X. Med hjälp av en No.15 blad liten skalpell, skär remsor av folien till en exakt bredd, till exempel, 0,7 mm eller 1,3 mm.
- Separera folienremsor med två par av nr 4 urmakare pincett. Sedan göra en rätvinklig krök i mitten av foliebarriären så att den liknar ett gångjärn av den specifika bredd.
OBS: Denna form av barriär tas från 9, 10. En gångjärns barriär hålls på plats bättre än en rak, platt barriär. Nr 4 pincett är relativt trubbig och används eftersom de är mindre benägna att göra bucklor eller poäng i foliebarriärer. - Rada upp hindren i mitten av petriskål med en sida platt mot skålen och den andra pekar upp ur skålen, flytta den återstående oklippta folien på ena sidan. Förbered 20 eller fler hinder före operation dag. Placera folielocket över skålen och lagra hinder på ett ställe där de inte kommer att störas.
OBS: Även en liten knock kan tippa hinder över eller innebära att de håller med statisk på sidorna av skålen.
- Skär en 1 cm fyrkantig bit av aluminiumfolie och sterilisera den genom att torka av den med 70% etanol på en vävnad. Placera den på en 6 cm steril plast petriskål. Kasta locket och gör ett lock för skålen från folien.
- Inkubera befruktade hönsägg på sina sidor på papp äggbrickor vid 38 °C för lämplig tid före operation dag så att embryona kommer att vara på den önskade 8 scenen.
2. Beredning av kycklingembryon och pärlor på operationsdagen
- "Window" inkuberade hönsägg.
OBS: Följande metod för att öppna ägg fördes vidare av Dennis Summer (publiceras inte).- Med ägget liggande på sin sida, genomborra den trubbiga änden (luftsäcken ände) av ägget med typ AA starka pincett att se till att det inre skalmembranet har brutits. För att göra detta grepp tången ihop ordentligt och använda en kontrollerad huggande rörelse medan du håller ägget med den fria handen.
- Ta ägget, fortfarande liggande på sidan, med båda händerna (en vardera sidan) vrid den 180 ° längs den horisontella axeln och ersätta den i ägget facket så att den sida som var översta är nu bredvid facket.
OBS: Detta löser embryot från skalmembran och kommer att innebära att embryot är less sannolikt skäras när skalet ovanför embryot tas bort. - Ta en bit genomskinlig tejp ca 5 cm i fyrkant och hålla detta tätt över den översta ytan av ägget att stoppa äggskal från sönderfallande på embryot när ägget öppnas.
- Använd böjd sax för att försiktigt bryta igenom skalet och dess membran i mitten av den översta delen av ägget, gör en mycket litet hål med ett blad av saxen så att luft kan komma in i ägget över embryot (som ligger strax under den översta delen av skalet).
OBS: Genom att bara bryta skalmembran och inte bryta någon av membranen som täcker embryot, luft kommer in i ägget separerar embryot från skalet och embryot kommer att vila ovanpå äggulan ca 0,5-1 cm från skalet . - Använd böjd sax för att förstora hålet i skalet till en cirkel med en diameter på ca 1 cm. Ta bort bit utskuren skal och täcka hål i ägget med enbit genomskinlig tejp ca 5 cm i fyrkant. För att enkelt ta bort det här bandet, trycker bandet att sticka bara på kanten av hålet, som lämnar återstående band gratis. Den fria tejpen kan sedan gripas för att bryta förseglingen ägget.
- stegsembryon
- Efter inkubation vid 38 ° C (se steg 1,7) och fönster (steg 2,1), använd en kikare mikroskop för att arrangera de kycklingembryon enligt 8. Gör detta precis innan äggen tätas efter fönster. Skriv stadiet varje embryo på äggskal. Återgå äggen till inkubatorn.
OBS: Embryon i stadierna mellan 8 och 15 är lämpliga för barriär och pärla experiment. Embryon är mer benägna att överleva om de inte har lämnats ut ur inkubatorn för länge innan operation.
- Efter inkubation vid 38 ° C (se steg 1,7) och fönster (steg 2,1), använd en kikare mikroskop för att arrangera de kycklingembryon enligt 8. Gör detta precis innan äggen tätas efter fönster. Skriv stadiet varje embryo på äggskal. Återgå äggen till inkubatorn.
- Blötläggning pärlor före operation.
- FGF4
- Ta antalet affinitetskromatografi gelpärlor (150-300 nm) som håller sig till slutet av en 1000 mikroliter pipettspets och varh dem i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett mikrocentrifugrör för att avlägsna aziden de lagras i. Centrifugera i 5 sek, kasta PBS och upprepa processen två gånger.
- Blöt gelpärloma i en 30 | il droppe av 0,35 mg / ml FGF4 protein på en steril petriskål på is under 30 min. Plocka pärlor ca 150 | j, m i diameter med nr 5 microforceps för insättning i embryot.
OBS: Hantera jonbytarharts pärlor som används i de följande stegen med nr 5 microforceps och grepp dem mycket försiktigt eftersom pärlorna är sköra och kan splittras om pressas för hårt. Denna varning gäller 2.3.2-2.3.3 och alla harts pärla operationer.
- RA
- Tina en alikvot av 0,05 eller 0,1 mg / ml all-trans-RA späddes med DMSO och placera en 100 | il droppe på en steril petriskål (9 cm i diameter), som tidigare har tagits upp i folie för att skydda RA från ljus. Ta en 10 mikroliter pipettspets och plocka upp några kloridformen jonbytehartspärlor på dess ände och dra dessa i RA droppe skyddas från ljus vid rumstemperatur under 20 min.
- Skölj pärlorna i tre på varandra droppar av 100 | il Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) placerade på samma petriskål minst 1 cm från varandra.
OBS: Pärlorna ta upp fenolrött färgämne från DMEM. Denna metod är baserad på 5. - Plocka pärlor ca 100 | j, m i diameter (kulor varierar i storlek från 75 till 180 | im i vått tillstånd) för införande i embryot, med hjälp av ett mikroskop skede gradnät glider under petriskålen och No.5 microforceps att hålla pärlorna. När plocka upp kulan från 100 l droppe DMEM, första pärlan ner på petriskål och ta bort eventuella kvarvarande DMEM från det antingen genom att trycka strängen ur droppe eller genom att placera de stängda pincett bredvid kulan (kapillär åtgärd drar vätskan bort från kulan).
- BMS 493
- När det gäller RA (2.3.2), blöt ion utbange hartspärlor i ett 100 | il droppe av 2,5 eller 5,0 mg / ml BMS 493 i DMSO vid rumstemperatur i 20 minuter och skölj sedan i 100 | il droppar av DMEM. Plocka pärlor ca 100 | j, m i diameter för insättning i embryot.
- DMSO kontroll
- Som för RA (2.3.2), blöt jonbyte hartspärlor i en 100 ^ il droppe av DMSO vid rumstemperatur under 20 minuter och skölj sedan i 100 | il droppar av DMEM. Plocka pärlor ca 100 | j, m i diameter för insättning i embryot.
- FGF4
3. Barriär och Bead Operations
Figur 1. Schema för kycklingembryon av olika stadier visar var Hinder och eller pärlor ska placeras. (A) Steg 13 kycklingembryo visar schematiskt spärrläge (grön linje) mellan somiter och LPM vid presumptiv vingnivå (somites 15-20). (B) Samma schema som i (A), som visar var RA pärla (röd cirkel) ska placeras före barriär insättning. (C) Schematisk visning barriärposition (grön linje) vid den presumtiva benet nivån (somiter 26-32) i ett skede 15 embryo. (D) Samma schema som i (C), som visar var en RA pärla (röd cirkel) ska placeras. (E) Schematisk visar var BMS 493 pärlor (lila cirklar) ska placeras i LPM av en scen 15 embryo. (F) Skiss av en etapp 9 kycklingembryo som anger spärrläge (grön linje) mellan presomitic mesoderm och LPM på presumtiva vingnivå. (G) Schematiskt diagram av en etapp 9 embryo som visar positionerna för en barriär (grön linje) och RA vulst (röd cirkel). (H) Skiss av en scen 10 kycklingembryo visar spärrläge (grön linje) på presumtiva benet nivå. (I 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Barriär införd i steg 13 för att förhindra ving knopp initiering.
- Ta ett steg 13 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas. Ta bort det översta lagret av genomskinlig tejp.
- Med hjälp av en stålmikro kniv, gör ett snitt genom vitelline membranet och sidoplåten mesoderm (LPM) i anslutning till somites 15-20 (Figur 1A) på höger sida av embryot (somites har inte alla bildade i detta skede). Klipp i anslutning till de senaste fyra somites bildas och fortsätta skära två somit längder kaudalt.
- Plocka upp barriären (0,7-1 mm breda) med nr 5 microforceps vid slutet skjuter ut från petriskålen och vrid hand för att sätta den fria änden av barriären in i snittet. Gångjärnet formade barriären ligger platt på vitellinmembranet ovanför LPM med hälften av det utskjutande nedåt genom snittet distalt somites. Så snart som möjligt försegla ägget med genomskinlig tejp och returnera den till inkubatorn.
OBS: Mikro kniv och pincett blir klibbiga vid kontakt med vitellinmembranet. Det är viktigt att torka dem rena med 70% etanol innan en efterföljande operation. Detta gäller för alla efterföljande operation beskrivningar och pärla implantationer. - Om en kula är att införas i samband med en barriär; För det första, ta pärlan i nr 5 microforceps och sätt in den i den skurna ytan av LPM på den bortre sidan av snittet och sedan in barriären i snittet proximalt pärlan (Figur 1B). Täta ägg och returnera det omgående till inkubatorn.
- Barriär införd i steg 15 för att förhindra benet knopp initiering.
OBS: Ett exempel på resultatet av denna operation på tbox fyra transkriptionsfaktor (Tbx4) expression visas i fig 2D och 2E.- Ta ett steg 15 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas. Ta bort det översta lagret av genomskinlig tejp.
- Med användning av en stålmikro kniv göra ett snitt genom vitellinmembranet och LPM intill somiter 26-32 (Figur 1C) på höger sida av embryot (somiter har inte alla bildade i detta skede). Klipp i anslutning till de två sista somites bildas och fortsätta snitt fem somit längder kaudalt.
- Plocka upp barriären (1,2-1,3 mm bred) med nr 5 microforceps i ena änden och vrida barriären att sätta den fria änden i snittet. Så snart som möjligt försegla ägget med genomskinlig tejp ennd returnera den till inkubatorn.
OBS: Gångjärnsformade barriären ligger platt på vitellinmembranet ovanför LPM med hälften av det utskjutande nedåt genom snittet distalt somites. - Om en kula skall sättas in i samband med en barriär, dels ta pärlan i nr 5 microforceps och sätt in den i den skurna ytan av LPM på den bortre sidan av snittet och sedan in barriären i snittet proximalt vulsten (figur 1D). Täta ägg och returnera det omgående till inkubatorn.
- Om en pärla eller pärlor är att införas utan en barriär, t ex, behöver BMS 493 pärlor till benet regionen i etapp 15, inte gör den långa snitt (3.2.2.1). Gör ett litet snitt genom vitellinmembranet och in i LPM vid positionen vulsten skall placeras. Ta pärlan i nr 5 microforceps och sätt in den i hålet i LPM. Tryck in den lite längre med de slutna ändarna av pincett (Figur 1E).
- Barriär införd i steg 9 för att förhindra ving knopp induktion och initiering.
- Ta ett steg 8 eller 9 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas.
- Med användning av en stålmikro kniv göra ett snitt genom vitellinmembranet och LPM laterala och rostralt till den primitiva strimman, vid den kaudala änden av embryot i linje med de somiter (figur 1F) ca 5 somit längder lång.
- Plocka upp barriären (0,7-1 mm breda) med nr 5 microforceps vid slutet skjuter ut från petriskålen och vrid hand för att sätta den fria änden av barriären in i snittet. Så snart som möjligt försegla ägget med genomskinlig tejp och returnera den till inkubatorn.
OBS: Gångjärnsformade barriären ligger platt på vitellinmembranet ovanför LPM med hälften av det utskjutande nedåt genom snittet. - Om en vulst är att vara inserted i kombination med ett barriär; För det första, ta pärlan i nr 5 microforceps och sätt in den i den skurna ytan av LPM på den bortre sidan av snittet och sedan in barriären i snittet proximalt pärlan (figur 1G). Täta ägg och returnera det omgående till inkubatorn.
- Ta ett steg 8 eller 9 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas.
- Barriär införd i steg 10 för att förhindra benet knopp induktion och initiering.
OBS: Ett exempel på resultatet av denna operation på Tbx4 expression visas i figur 2G.- Ta ett steg 10 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas.
- Med användning av en stålmikro kniv göra ett snitt genom vitellinmembranet och LPM lateralt om primitivstrimman, vid den kaudala änden av embryot i linje med de somiter (Figur 1H) cirka 6 somit längder lång.
- Plocka upp barriären (1,2mm brett) med nr 5 microforceps i slutet skjuter ut från petriskålen och vrid hand för att sätta den fria änden av barriären in i snittet. Så snart som möjligt försegla ägget med genomskinlig tejp och returnera den till inkubatorn.
OBS: Gångjärnsformade barriären ligger platt på vitellinmembranet ovanför LPM med hälften av det utskjutande nedåt genom snittet. - Om en kula ska införas utan hinder, t ex BMS 493 pärla till benet regionen vid steg 10, göra ett litet snitt genom vitelline membranet och in i LPM vid positionen pärlan ska placeras. Ta pärlan i nr 5 microforceps och sätt in den i hålet i LPM. Tryck in den lite längre med de slutna ändarna av pincett (Figur 1I).
- Ta ett steg 10 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas.
- 24 h eller mer efter rörelse kontrollera läget av barriären jämfört med den framväxande kontralaterala knopp. Kassera embryon där barriären är uppenbarligen inte opposite vänster lem knopp. I detta fall barriären har felaktigt positionerade.
4. Skörd Embryon, Fixering och förberedelse för Wholemount In Situ Hybridisering (WISH)
- Skörd embryon lägga operation.
- Harvest embryon i etapp 19-23 så att lem knopp morfologi syns tydligt i både drivs och kontralaterala kontroll sidor.
- Använda böjd sax klippa ett större hål i äggskalet. Skära runt embryot medan du håller stort blodkärl till vänster om embryo med microforceps. Använd detta grepp av kärlet för att avlägsna embryot och placera den i en petriskål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,3.
- Under en kikare mikroskop, dissekera bort extra embryonala fartyg och membran med hjälp av en kombination av böjd sax och nr. 5 microforceps. Ta bort huvudet med saxen.
- Harvest embryon i etapp 19-23 så att lem knopp morfologi syns tydligt i både drivs och kontralaterala kontroll sidor.
- Fixering av embryon posta skörd.
- Med användning av krökta blunt pincett, lyft embryot och placera den i 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS vid rumstemperatur under två timmar gungande och sedan vid 4 ° C över natten i en 20 ml glasflaska med skruvlock.
Varning: PFA är en allvarlig hälsorisk. Det är en skadlig, frätande irriterande och pulvret måste förhindras från att komma i kontakt med hud, ögon och lungor. Använd personlig skyddsutrustning och ett dragskåp medan beredning av lösningen. När det är en 4% lösning, handskar, skyddsglasögon och skyddsrock ska bäras.
OBS: Det är viktigt att få embryon i fix snabbt till bästa bevara mRNA integritet.
- Med användning av krökta blunt pincett, lyft embryot och placera den i 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS vid rumstemperatur under två timmar gungande och sedan vid 4 ° C över natten i en 20 ml glasflaska med skruvlock.
- Undanröjande av hinder innan wholemount in situ hybridisering.
OBS: Hinder avlägsnas eftersom de är vassa och kan skada embryon när de går igenom den in situ hybridisering protokollet, särskilt om flera embryon färgas på en gång.- Efter fixering, placera embryot i ett fat med PBS under kikare mimikroskop.
- Med användning av två par av nr 5 microforceps, placera den vänstra paret nära endera sidan av barriären i den opererade sidan av embryot. Ta tag i barriären med rätt par och försiktigt dra barriären från embryot med vänster paret att hålla embryot ner och för att förhindra vävnad från att fastna i barriären som den tas bort.
- Utföra WISH väsentligen såsom beskrivet i 11.
- Ta ett steg 15 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas. Ta bort det översta lagret av genomskinlig tejp.
- Ta ett steg 13 embryo från inkubatorn och placera ägg på ett ägg vila under ett binokulärt mikroskop inställt på 3,2 x förstoring eller högre om så önskas. Ta bort det översta lagret av genomskinlig tejp.
Representative Results
Protokollet beskrivs ovan beskriver de metoder som används i Nishimoto et al. Studerar 2015. Pappers lem knopp induktion och initiering i både fram- och bakbenen av kycklingembryo. Resultat efter införandet av ogenomträngliga barriärer för att förhindra utväxt av forelimb knopp har tidigare publicerats en, två, nio, men det har varit bara en studie som beskriver barriärer som förhindrar ben knopp initiering 1. Bakben data från Nishimoto et al. 2015 presenteras här som representativa resultat av studien av mRNA-expression efter barriär insättning.
Tbx4 Expression i LPM är inte tillräcklig för att initiera bakdelen utväxt:
Figurerna 2B och C (tabell 2) visar att barriär infogning vid stadium 15 (Figur 2A) (se protokoll 3,2) leder till både Fgf10och FGF8 uttryck är frånvarande i benet knopp regionen (betecknad konsol) på den opererade höger sida. Jämför med oanvänd vänster sida. Dock är Tbx4 uttryck observeras vid både scen 19 och steget 23 på den opererade sidan (Figur 2D och E). Vi avslutar ensam att Tbx4 uttryck är inte tillräcklig för att initiera bakdelen utväxt från LPM. Andra studier i ungen har föreslagit att TBX genuttryck är tillräcklig för att initiera forelimb knopp bildning 12, 13.
Figur 2C 'är inkluderad för att illustrera hur en barriär ser inbäddad i benet regionen av embryot stolpen fixering. I själva verket oftast hinder avlägsnades före in situ-hybridisering (protokoll 4,3).
RA från somites är viktigt i LPM innan Fgf10 Orsakar Limb Bud Outgrowth:
Figur 3A är en schematisk representerar tillsatsen av en RA indränkt vulst distalt om en barriär införd vid steg 15 (protokoll 3.2.1.3). Efter denna operation lem knopp utväxt (som betecknas med en asterisk) observeras på den opererade höger och Tbx4, Fgf10 och FGF8 uttrycks i sin linda eftersom de är i kontroll vänster sida (Figur 3B, C och D, Tabell 2) . Sålunda tillsats av RA till LPM övervinner effekten av barriären och lem knopp initierings- fortskrider. Vi drar slutsatsen att i normal utveckling RA från somites är viktigt i LPM innan lem knopp utväxt kan initieras. De resulterande bakdelen knoppar är i allmänhet mindre än på kontrollsidan. Detta kan bero på att RA dos i LPM är inte ekvivalent med vildtypen situationen. Om RA dosen är för hög apikala Ectodermal Ridge (AER) kan förkortas och mindre knoppar skulle resultera14, 15.
För att bekräfta att RA (från somites) i LPM krävs för normal extremitetsanlag initiering en invers agonist av RAR, BMS 493, användes. Pärlor implanteras i benområdet LPM vid steg 15 (se protokoll 3.2.1.4) (figur 3E). Fgf10 expression nedregleras efter applicering av BMS 493 pärlor i LPM, vilket resulterar i mindre bakben knoppar jämfört med kontrollsidan (figur 3F; Tabell 3). Kontroll DMSO pärlor inte orsaka dessa defekter (figurerna 3G och 3H, tabell 3). Defekterna observerades efter BMS 493 ansökan är mildare än de som induceras av en barriär operation; dvs Fgf10 fortfarande uttrycks och lem knoppar bildas. Detta kommer sannolikt att bero på effekterna av BMS 493 begränsas lokalt runt kulorna och får inte kunna motverka alla RA som produceras av axial vävnader.
Tidigt Axial Signaler Ange LPM Celler som Senare Express Tbx4:
Vi testade när LPM förvärvar sin förmåga att uttrycka Tbx4 i den blivande benet bildande regionen. Den tidigaste tidpunkt när en barriär kan införas som senare kommer att blockera benet knopp utväxt, är steget 10. Vi är de första att utveckla ett protokoll för att sätta hinder i etapper tidigare än steget 12. Hinder insatta mellan det paraxiella mesoderm och presumtiva benet LPM vid steg 10 (se protokoll 3,4) blocket benet knopp bildningen och uttrycket av Tbx4 i benet bildande LPM (figurerna 2F och 2G, tabell 2), vilket antyder att en signal från axiella vävnader vid steg 10 krävs för senare uttryck av Tbx4 i bakbens LPM. Jämför detta resultat med figurerna 2D och E där senare barriär insättning tillåter Tbx4 uttrycksom skall upprättas. Dessutom undersökte vi om denna axiella signal skulle kunna vara RA genom att observera huruvida omvänd agonist av RAR reducerar Tbx4 uttryck. En BMS 493 pärla placeras i bakdelen LPM vid steg 10 (se protokoll 3.4.1.3) nedreglerar Tbx4 uttryck (figurerna 2H och 2i), medan kontroll pärlor indränkt i DMSO inte påverkar Tbx4 uttryck (fig 2J och 2K). Tillsammans utgör dessa resultat stöder en modell som en RA-signal från axiella vävnader reglerar lem induktion av positivt reglera Tbx4 i bakbenen LPM 7.
Postoperativ död:
Tabellerna 1, 2 och 3 redogöra för experimentella resultat inklusive antalet kycklingembryon som dog efter operation och före skörden. Vissa dödsfall är att vänta efter mikro av detta slag. Talen döende kan hållas till ett minimum genom att se till att instrumenten är rena, hålet i ägget är den minsta storlek som krävs, att embryona lämnas utan skydd av den klibbiga tejpen minst tid och i samband med denna sista punkt att verksamheten utförs så snabbt som möjligt. Ingen av dessa operationer är mycket tidskrävande men verksamheten omfattar pärlor och barriärer ta lite mer tid. Trots dessa åtgärder, som genomförs på de tidigaste stadierna och de i flygeln regionen är mer benägna att leda till döden. Det finns stora blodkärl runt lem bildande regioner och oavsiktlig bristning av dessa fartyg kan leda till döden på grund av blodförlust. Vi finner att ägg öppnade i skede 8 eller 9, vars embryon inte har opererats, kommer ofta dö genom nästa dag. Därför är den enda lösningen på dessa problem är att utföra ett stort antal experiment.
d / 54.618 / 54618fig2.jpg "/>
Figur 2. markörgenuttryck Förändringar efter Barrier eller Bead Insättning på Presumtiva Leg nivå. (A) Schematisk visning barriärposition (grön linje) till presumtiva benet nivå (somiter 26-32) i ett skede 15 embryo. (B - E och G) WISH analys drivs embryon. Benet region beskrivs (parentes). (B) Fgf10 uttryck är frånvarande i den opererade LPM, men robust uttryck detekteras i den vänstra linda. (C) FGF8 uttryck är frånvarande i den opererade sidan, vilket tyder på att det inte finns någon AER. (C ') Samma embryo före barriären avlägsnades. (D) Tbx4 uttrycks i LPM vid samma Rostro-caudal nivå som kontroll linda. (E) Tbx4 expression bibehålls i det högra benet regionen trots frånvaro av lem tillväxt. (F) Schematiskt diagram av en etapp 10 kycklingembryo visar spärrläge (grön linje) på presumtiva benet nivå. (G) Tbx4 uttryck är frånvarande i den opererade höger LPM (konsol). (H) Skiss av en scen 10 kycklingembryo visar BMS 493 pärla läge (lila cirkel) på presumtiva benet nivå. (I) Tbx4 expression nedregleras på den opererade höger sida efter behandling med BMS 493. (J) Schematiskt diagram av en etapp 10 kycklingembryo som visar styr DMSO bead position (grå cirkel). (K) Tbx4 uttrycks på den opererade högra sidan på en liknande nivå med den hos kontroll vänster sida efter behandling med enbart DMSO. Denna siffra har ändrats från 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
d / 54.618 / 54618fig3.jpg "/>
Figur 3. RA räddar Limb Bud frånvaro orsakad av Barrier Insertion och är viktigt i LPM Före Leg Bud utväxt. (A) Schematisk indikerar barriärläge (grön linje) på presumtiva benet nivå (somites 26-32) och en RA-indränkt pärla (röd cirkel). (B - D) RA räddar benet knopp utväxt (visas med en asterisk). (B) Tbx4 uttryck förekommer i den räddade benet knopp som liknar den icke-opererade sidan. (C) Fgf10 uttrycks i räddade benet knopp liknar en icke-opererad sida. (D) FGF8 uttrycks i AER av de räddade höger ben knopp. (E) Schematisk som indikerar var BMS 493 pärlor (lila cirklar) placerades i det presumtiva benet LPM av scen 15 embryon. (F) Fgf10 uttryck nedregleras på den opererade höger och benet knopp är liten följande BMS 493 behandling. Pärlor är asterisk. (G) Liknande schema till (E), som anger läget för styr DMSO pärlor (grå cirklar). (H) DMSO pärlor (visas med asterisker) påverkade inte Fgf10 uttryck eller ben bud storlek. Denna siffra har ändrats från 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stage barriär placerad (+ pärla) * | antal drivs | Vinge saknas ** | Wing föreliggande ** | antal döda |
| stadium 12-14 | 40 | 24 | 1 | 15 |
| stadium 8/9 | 65 | 23 | 0 | 42 |
| Stadium 12-13 (FGF4 bead) | 41 | 7 (bead saknas) | 17 | 17 |
| Stage 12-13 (RA pärla) | 75 | 9 (bead saknas) | 32 | 34 |
| Stage 13 (kontroll pärla) | 5 | 3 | 0 | 2 |
| * 0,7-1 mm folie hinder placerade mellan somites 15-20 och sidoplåten mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 pärla. 0,05-0,1 mg / ml RA pärla. | ||||
| DMSO kontroll pärla. | ||||
| ** Kycklingembryon fasta stegen 21-23 | ||||
Tabell 1. Wing nivå Barrier och Bead Experiment Resultat.
| Stage barriär placerad (+ pärla) * antal drivs | Ben saknas ** | Benet föreliggande ** | antal döda | |
| stadium 12-15 | 43 | 39 | 0 | 4 |
| stadium 10/11 | 23 | 16 | 0 | 7 |
| Stadium 15 (FGF4 bead) | 8 | 0 | 5 | 3 |
| Stage 15 (RA pärla) | 18 | 0 | 18 | 0 |
| * 0,7-1,3 mm folie hinder placerade mellan somites 26-32 och sidoplåten mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 pärla. 0,05-0,1 mg / ml RA pärla. | ||||
| ** Kycklingembryon fasta stegen 18-24 | ||||
Tabell 2. Ben nivå Barrier och Bead Experiment Resultat.
| antal drivs | Benet knopp liten | Leg knopp något mindre | Leg knopp normal storlek | antal döda |
| BMS 493 pärlor * | ||||
| 15 | 12 | 3 | 0 | 0 |
| DMSO pärlor ** | ||||
| 12 | 0 | 3 | 9 | 0 |
| * 2-3 pärlor indränkt i 5 mg / ml BMS 493 placerad i rätt skede 14-15 LPM i etapp nivå. | ||||
| ** 2-3 pärlor indränkt i DMSO enbart placeras i rätt skede 15 LPM i etapp nivå. | ||||
| Kycklingembryon fast vid stegen 17-19. | ||||
Tabell 3. Leg Level BMS 493 Bead Experiment Resultat.
Discussion
Vi beskriver användningen av ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem knopp bildning i kycklingembryo. Denna teknik har ett antal kritiska steg. Efter preliminära experiment, fann vi att gångjärnsformade barriärer som används i 9, 10 kvar i embryot mycket bättre än raka hinder. Den distala flata sidan av barriären fastnar på vitellinmembranet och håller barriären på plats (figur 2C). Noggranna förberedelser av gångjärns formade hinder från aluminiumfolie som beskrivs i protokoll steg 1,6 är avgörande för framgången av verksamheten. En annan viktig steg är att se till att äggen inte lämnas ut ur inkubatorn för länge efter fönster och iscensättning före drift på embryot. I vår erfarenhet, embryon överlever en operation bättre om de är vid eller i närheten av inkubationstemperatur när operationen utförs. Verksamheten bör därför genomföras så snabbt som möjligt och äggen återförslutas promptly att säkerställa goda överlevnad. Många forskare lägger en droppe av antibiotika för att embryot efter mikro innan han återvände äggen till inkubatorn. Närvaron av vätskan förhindras barriärerna från att fastna väl i läge. Tillsats av antibiotika kan också rubba pärlor efter placering. Därför inte använder antibiotika, snabba operationer och god renhet med instrument rekommenderas för att undvika infektion. Torka instrument med 70% etanol efter varje steg i en operation är nödvändig för att förhindra instrument blir klibbigt kontakt med vitellinmembranet som kan orsaka både hinder eller pärlor att följa pincett (se protokoll steg 3.1.2.2). Båda sorter av pärlor som används kan falla på sin plats efter operationen. När barriär läge kontrollerades nästa dag var det inte möjligt att se igenom barriären att avgöra om kulan kvar på plats eller inte. I de fall där vulsten hade fallit ut ving knopp utväxt inte räddades ( Detta protokoll modifierar tidigare publicerade experiment som använde barriärer för att förhindra lem knopp initiering definierar specifika optimala bredder för hinder och introducerar kombinera barriär och pärla placering följt av genuttryck analys. Vi fann att använda konventionell aluminiumfolie, som är billig och lätt tillgänglig i alla labb, producerar resultat likvärdiga med dem som tidigare använt tantal folie. Folien kan vara kvar i embryot när de utför in situ hybridisering (figur 2C) men vi brukar ta bort det om mer än ett embryo bearbetas för att förhindra att skarpa kanter på folien skada embryon. PIlot studier visade att bredden av benet region hinder är särskilt viktigt. Initialt hindren trialed var alltför kort och ben knopp utväxt inte förhindras. 1,2-1,3 mm är den optimala bredden för en barriär för att blockera benet knopp utväxt helt. De smalaste ving hinder som man kan placera noggrant för att förhindra knopp utväxt ger bäst överlevnad. Det kan vara så smal som 0,5-0,7 mm. Men hindren som är lite bredare är mer sannolikt att resultera i fullständig blockering av ving knopp utväxt eftersom de möjliggör en liten felaktighet av placering (vi använde 0,7-1 mm). Undvikande av blodkärl när du gör snittet är avgörande för ving knopp nivå hinder. Semipermeabla barriärer har tidigare använts för att halvera ungen lem knopp. MacCabe och Parker, 1976 och Summer, 1979 båda används filter 0,45 um och 0,8 um porstorlek, respektive 16, 17. De rapporterade att diffunderbara signaler kan passera genom porerna i filtren och attresultat fick hjälp av halvgenomträngliga hinder var halvvägs mellan en lem knopp utan hinder är närvarande och ett med en ogenomtränglig tantal foliebarriär. Detta protokoll skulle kunna anpassas för att använda semipermeabla barriärer med varierande porstorlek för att differentiera kandidatsignalerna baserade på storlek eller för att modifiera de dynamiken i signal diffusion. Detta protokoll har olika begränsningar främst i samband med modellorganism själv. Sådana tekniker kan användas för att undersöka ytterligare frågor i lem utveckling och även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. En förutsättning är att organet / aktuella området bör utvecklas när kycklingembryo är tillgänglig för intervention. Närvaron av stora blodkärlen i området där en barriär måste placeras gör barriär placering senast steget 13 eller 14 tekniskt utmanande. Om stora blodkärl skärs under barriär placering kan detta leda till embryodödlighet. Vår undersökning av när transkriptionsfaktorer TBX5 och Tbx4 först induceras i LPM begränsades av den tidigaste skede då vi kan placera en barriär som senare skulle hamna mitt emot antingen vingen eller benet knopp respektive. Det skulle kunna belysa att försöka blockera TBX geninduktion i tidigare skeden, närmare gastrulation. Det tidigaste en barriär skulle kunna placeras i den presumtiva wing region med framgång var etapp 8 och i benområdet steget 10. Detta protokoll är förmodligen inte lämpar sig för studier av genuttryck bortom lem knopp stadier eftersom efterföljande snabb tillväxt skulle förskjuta barriären och resultat skulle endast avse den initiala positionen av barriären. Efter att ha relaterade begränsningar i kycklingembryo i detta sammanhang, dess fördelar jämfört med andra ryggradsdjur modellorganismer är många. Kycklingembryo är en mycket lämplig djurmodell för denna typ av fysiskt ingrepp i ett ryggradsdjur embryo. Embryona är relativt stora och är lättillgängliga through äggskal. Man kan återvända till embryot för ytterligare experiment (t.ex. avlägsnande av en sträng 18 eller till och med en barriär) eller för att kontrollera om framstegen genom att helt enkelt ta bort tejpen fönstret. Det är möjligt att även omfatta levande avbildning eller tidsförlopp avbildning. Vi beskriver en metod för fönster hönsägg som är särskilt lämpade för drift på embryon tidigt stadium. I fallet med lem studier är det mycket viktigt och användbart att det finns en kontralaterala kontroll lem för varje experiment som fungerar som en idealisk intern kontroll för varje biologisk replikat. Kombinationen av att använda ogenomträngliga barriärer för att förhindra lem utväxt och pärlor indränkt i signalmolekyler har inte rapporterats tidigare. Vår analys av mRNA-uttryck efter sådana insatser är också ny. Dessa tekniker det möjligt för oss att dissekera det svåra problemet med när lem specifik transkriptionsfaktorer Tbx5 och Tbx4 induceras i LPM och ävenför att visa att senare, före lem knopp initiering, är närvaron av dessa TBX gener i LPM inte är tillräcklig för aktivering av Fgf10 transkription och starten av extremitetsanlag utväxt. Figurerna 2G, 2D och 2E visar dessa resultat väl. Frånvaron av Tbx4 uttryck efter införandet av en barriär vid steg 10 i figur 2G står i skarp kontrast till sin närvaro i 2D och 2E följande barriär insättning vid steg 15, efter induktion av Tbx4. Implantation av RA indränkt pärlor lättade räddnings lem knopp initiering efter barriär insättning och så pekar RA från somites vara viktigt i LPM innan lem knopp utväxt kan börja. Sådana tekniker kan användas för att lösa frågor i lem utveckling men även andra frågor av ryggradsdjur embryogenes. Områden i hjärnan, ögat och stammen kommer sannolikt att vara lämpliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
