Abstract
L'embryon de poulet fournit un modèle vertébré superbe qui peut être utilisé pour disséquer les questions de développement de manière directe. Son accessibilité et la robustesse suite à une intervention chirurgicale sont des forces expérimentales clés. Plaques Mica ont été les premières barrières utilisées pour empêcher poussin bourgeon de membre initiation 1. Les protocoles qui utilisent une feuille d'aluminium comme une barrière imperméable aux bourgeons de l'aile ou de la jambe bourgeon induction et ou d'initiation sont décrits. Nous combinons cette technique avec le placement de talon latéral à la barrière à exogène candidats d'approvisionnement des facteurs endogènes qui ont été bloqués par la barrière. Les résultats sont analysés en utilisant l'hybridation in situ de l' expression génétique subséquente. Notre objectif principal est le rôle de la signalisation de l'acide rétinoïque dans l'induction et l'initiation plus tard, de l'avant d'embryon de poulet et postérieurs. Nous utilisons BMS 493 (un agoniste inverse des récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR)) perles trempées implantées dans le mésoderme de la plaque latérale (LPM) pour imiter l'effet d'un barrier placé entre les somites (une source d'acide rétinoïque (RA)) et de la LPM à partir de laquelle se développent les bourgeons des membres. Des versions modifiées de ces protocoles pourraient également être utilisés pour répondre à d'autres questions sur l'origine et le calendrier des signaux inductifs. Pourvu que la région de l'embryon de poulet est accessible au stade de développement pertinent, une barrière pourrait être placée entre les deux tissus et les changements qui en découlent dans le développement étudiés. Des exemples peuvent être trouvés dans le cerveau, l'extension de l'axe en développement et dans le développement des organes, comme le foie ou le rein induction.
Introduction
embryologistes classiques traditionnellement employées techniques physiques pour interroger les mécanismes contrôlant le développement embryonnaire. Dans les années 1960 et 1970 chercheurs ont développé des techniques qui utilisent des barrières imperméables insérées entre les tissus de l'embryon en développement afin de démontrer l'importance des signaux inductifs pendant l'embryogenèse. Notre intérêt est de vertébrés développement des membres et en particulier les événements qui précèdent bourgeon de membre excroissance. Par exemple, l'insertion d'une barrière peut empêcher bourgeon de membre excroissance de se produire sur un côté de l'embryon de poulet tout en lui permettant de procéder normalement sur le côté controlatéral non opéré. Les matériaux utilisés pour rendre ces barrières variées; par exemple, des plaques de mica et de tantale feuille 1 2. Ces barrières séparent efficacement le mésoderme latéral (LPM), à partir duquel la forme de bourgeon branche, à partir des somites formés à partir du mésoderme paraxial. techniques de greffage chirurgicales démontrent que étroite association with l'somites est essentielle si bourgeon de membre initiation doit se produire dans la LPM 3 4. Dans les années 80 et 90 les biologistes du développement ont découvert diffusible molécules qui sont essentielles dans le contrôle des processus de développement de signalisation. Perles imprégnées de ces molécules de signalisation peuvent être implantées dans des régions spécifiques de l'embryon et produisent des altérations du développement embryonnaire. Par exemple, l' acide rétinoïque (RA) pris par des billes d'échange d'ions est libéré sur une période de 24 heures lorsqu'elle est implantée dans un embryon de poulet et peut produire image miroir duplication des chiffres 5. Perles acryliques héparine contenant des protéines de FGF peuvent initier bourgeon de membre excroissance de la interlimb LPM 6.
Plus récemment , la souris et les poissons de la génétique ont pris l'étude des vertébrés branche initiation à une nouvelle ère (revue dans 7). Il y a de bonnes preuves que RA présente dans les somites avant l'initiation du bourgeon de membre est le signal diffusible essentiel requis par le LPM pour lancer membre bourgeonnement. Nous voulions exploiter l'accessibilité et la robustesse expérimentale de l'embryon de poulet à disséquer l'effet de barrière implantation sur l'expression génique dans le LPM au moment de l'initiation du bourgeon de membre. Une nouvelle adaptation de notre méthode consiste à combiner une barrière qui bloque les signaux provenant de tissus axiaux avec le placement de talon latéral à la barrière à candidats d'alimentation facteurs endogènes exogène qui ont été bloqués par la barrière. Les protocoles suivants sont ceux développés pour démêler les mécanismes de bourgeon de membre induction et d'initiation.
Étudier bourgeon de membre initiation signifie l'utilisation d'embryons à un stade précoce. De nombreux oeufs fenêtre chercheurs de poulet par première enlever une partie de l'albumine à travers le sac d'air avec une aiguille hypodermique. L'embryon, qui se trouve au-dessus du jaune, alors mentir plus bas dans l'œuf. Ceci est un avantage pour certaines techniques telles que l'électroporation, mais peut être un inconvénient si la manipulation chirurgicale de l'embryon est souhaitée.Nous trouvons ayons l'embryon comme proche de l'ouverture dans l'œuf que possible est un avantage.
Des questions demeurent en ce qui concerne les signaux qui contrôlent des membres des vertébrés bourgeon induction et l'initiation et les protocoles suivants sont appropriés pour y faire face. Nous sommes les premiers à développer un protocole pour l'insertion des barrières pour empêcher poussin bourgeon de membre excroissance à un stade plus précoce que l' étape 12 8. Des versions modifiées de ces protocoles pourraient également être utilisés pour répondre à d'autres questions sur l'origine et le calendrier des signaux inductifs où un tissu inducteur accessible se trouve à côté de la primordium étant induite. Pourvu que la région de l'embryon est accessible au stade de développement pertinent, une barrière pourrait être placée entre les deux tissus et les changements qui en découlent dans le développement étudiés. Des exemples peuvent être trouvés dans le développement du cerveau, l'extension de l'axe et le développement éventuellement un organe comme le foie ou les reins induction.
Protocol
Le protocole suivant utilise des embryons de poulet à moins de dix jours d'incubation. Toutes les expériences ont été réalisées conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les directives de protection des animaux au Royaume-Uni Home Office.
1. Préparation requise Avant Chick Opération Embryo
- Rassembler les instruments chirurgicaux suivants nécessaires aux opérations, pour la récolte et pour la fixation des embryons de poulet: Deux paires de n ° 5 horlogers pince, une paire de pinces solides, par exemple de type AA, ciseaux courbes avec des lames de 2,5 cm de long, à extrémités franches incurvée une pince à bouts d'environ 0,5 cm de longueur, ainsi que deux paires de pinces n ° 4 horlogeries à utiliser tout en faisant des barrières de feuilles (1.6.3).
- Faire un micro couteau à partir d'une tige d'acier (0,3 mm de diamètre) aiguisée en utilisant l'huile sur une pierre à aiguiser. L'utilisation d'un microscope binoculaire, aiguiser la pointe de la broche à une lame plate. Placez la broche dans un porte-aiguille et protéger son extrémité pointue d'être frappé et dented.
NOTE: Les enveloppes du couteau avec une pointe de 1000 pi de pipette est une option simple pour cela. - Préparer 70% d'éthanol dans un flacon de lavage en plastique. Utilisez une giclée de ceci sur un mouchoir en papier pour essuyer les instruments chirurgicaux et le micro couteau avant et après l'utilisation de stériliser et de les nettoyer.
- Acheter 5 cm de large ruban adhésif clair et un distributeur approprié. Trouver ou fabriquer un repos convenable pour tenir un œuf de poule régulière sur son côté.
- Marque et solutions de magasins pour perles de trempage.
- Préparer une solution de 0,35 mg / ml de Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) protéines de 1 mg / ml stock congelé en le diluant avec de l'eau et conserver à -20 ° C en 30 aliquotes.
- Préparer des solutions (soit 0,05 ou 0,1 mg / ml) de tout-trans-rétinoïque (RA) dilué avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans des tubes à centrifuger sombres d'un 5 mg / stock ml. Stocker le stock et aliquotes de 100 pi à -20 ° C.
- Préparer des solutions (2,5 ou 5 mg / ml) de BMS 493 (une ag inverseonist de RARs) dilué avec du DMSO dans des tubes de microcentrifugation sombres de 10 mg / stock ml. Stocker le stock et aliquotes de 100 pi à -20 ° C.
- Faire des barrières de papier d'aluminium.
NOTE: La feuille utilisée pour fabriquer les barrières est une feuille de restauration standard (mesurée par micromètre 0,013 mm d'épaisseur). Toute feuille d'aluminium intérieure serait probablement approprié.- Coupez un morceau carré de 1 cm de papier d'aluminium et de le stériliser en l'essuyant avec 70% d'éthanol sur un tissu. Placez-le sur un plastique stérile boîte de Pétri de 6 cm. Jeter le couvercle et faire un couvercle pour le plat de papier d'aluminium.
NOTE: Cela permettra d'éviter les barrières de coupe de coller plus tard sur le couvercle en plastique du plat en raison de statique. - Placez la boîte de Pétri sur un réticule de scène (1 cm de long répartis en 100 sections) sous un microscope binoculaire avec un grossissement réglé sur 1.6X. En utilisant un petit scalpel de lame No.15, couper des bandes de la feuille à une largeur exacte, par exemple, 0,7 mm ou 1,3 mm.
- Séparer la feuillebandes en utilisant deux paires de n ° 4 horlogers forceps. Ensuite, faire un virage à angle droit dans le centre de la barrière de la feuille de telle sorte qu'il ressemble à une charnière de la largeur spécifique.
NOTE: Cette forme de barrière est tirée de 9, 10. Une barrière à charnière reste en place mieux que, une barrière plate droite. N ° 4 des pinces sont relativement émoussée et sont utilisés parce qu'ils sont moins susceptibles de faire des bosses ou des scores dans les barrières de feuilles. - Aligner les barrières dans le centre de la boîte de Pétri avec un côté plat contre le plat et l'autre pointant vers le haut sur le plat, le déplacement de la feuille non coupée restante d'un côté. Préparer 20 ou plusieurs obstacles avant le jour de l'opération. Placez le couvercle en aluminium sur le plat et de stocker les barrières dans un endroit où ils ne seront pas perturbés.
NOTE: Même un léger cliquetis peut faire basculer les barrières plus ou dire qu'ils collent avec statique sur les côtés du plat.
- Coupez un morceau carré de 1 cm de papier d'aluminium et de le stériliser en l'essuyant avec 70% d'éthanol sur un tissu. Placez-le sur un plastique stérile boîte de Pétri de 6 cm. Jeter le couvercle et faire un couvercle pour le plat de papier d'aluminium.
- Incuber les œufs de poule fécondés sur leurs côtés sur des plateaux d'œufs en carton à 38 °C pour la durée appropriée avant le jour de fonctionnement tels que les embryons sera au 8 stade désiré.
2. Préparation des embryons de poulet et perles sur Jour Opération
- "Fenêtre" incubé des oeufs de poule.
NOTE: La méthode suivante pour l'ouverture des œufs a été transmis par Dennis Summerbell (non publié).- Avec l'oeuf couché sur le côté, percer l'extrémité émoussée (extrémité de sac d'air) de l'œuf avec le type AA fortes pinces en veillant à ce que la membrane interne de la coquille a été cassée. Pour ce faire, saisir la pince fermement ensemble et utiliser un mouvement d'engagement contrôlé tout en maintenant l'œuf avec la main libre.
- Prenez l'oeuf, toujours couché sur le côté, dans les deux mains (un de chaque côté) tourner à 180 ° sur l'axe horizontal et de le remplacer dans le plateau d'oeufs de telle sorte que le côté qui était la plus élevée est maintenant à côté du plateau.
NOTE: Ce desserre l'embryon des membranes de la coquille et qui signifie que l'embryon est less susceptible d'être coupé lorsque la coque au-dessus de l'embryon est retiré. - Prenez un morceau de ruban adhésif transparent d'environ 5 cm carré et coller cette étroite sur la surface supérieure de l'œuf pour arrêter la coquille de l'effritement sur l'embryon quand l'œuf est ouvert.
- Utilisez les ciseaux courbes pour briser doucement à travers la coque et ses membranes dans le centre de la partie supérieure de l'œuf, faire un petit trou avec une lame de ciseaux de telle sorte que l'air peut pénétrer dans l'œuf sur l'embryon (qui se trouve juste sous la partie supérieure de la coque).
NOTE: En tout rompre les membranes de la coquille et de ne pas briser l'une des membranes recouvrant l'embryon, l'air entrant dans l'œuf va séparer l'embryon de la coquille et l'embryon va venir se reposer sur le dessus du jaune d'environ 0,5-1 cm de la coque . - Utilisez les ciseaux courbes pour agrandir le trou dans la coquille d'un cercle avec un diamètre d'environ 1 cm. Retirez le morceau de coquille excisée et couvrir le trou dans l'œuf avec unmorceau de ruban adhésif transparent d'environ 5 cm carré. Pour retirer facilement cette bande, appuyez sur la bande pour coller seulement au bord du trou, en laissant la bande restant libre. La bande libre peut alors être saisi pour desceller l'œuf.
- embryons de Scène
- Après incubation à 38 ° C (voir étape 1.7) et fenêtrage (étape 2.1), utiliser un microscope binoculaire pour mettre en scène les embryons de poulet selon 8. Pour ce faire, juste avant que les oeufs sont scellés suivant fenêtrage. Ecrire la scène de chaque embryon sur la coquille. Remettre les oeufs dans l'incubateur.
REMARQUE: Les embryons à des stades entre 8 et 15 sont appropriés pour des expériences de barrière et de perles. Embryons sont plus susceptibles de survivre si elles ne sont pas laissés pour compte de l'incubateur pendant trop longtemps avant de faire fonctionner.
- Après incubation à 38 ° C (voir étape 1.7) et fenêtrage (étape 2.1), utiliser un microscope binoculaire pour mettre en scène les embryons de poulet selon 8. Pour ce faire, juste avant que les oeufs sont scellés suivant fenêtrage. Ecrire la scène de chaque embryon sur la coquille. Remettre les oeufs dans l'incubateur.
- perles Tremper avant l'opération.
- FGF4
- Prenez le nombre de billes de gel de chromatographie d'affinité (150-300 um) qui collent à l'extrémité d'une pointe de pipette de 1000 pi et a étéh eux dans 1 ml du tampon phosphate salin (PBS) dans un tube à centrifuger pour éliminer l'azoture ils sont stockés dans. Centrifuger pendant 5 sec, jeter le PBS et répéter deux fois le processus.
- Faire tremper les perles de gel dans une chute de 30 pi de 0,35 mg / ml de protéine de FGF4 sur une boîte de Petri stérile sur la glace pendant 30 min. Choisissez perles environ 150 um de diamètre au numéro 5 microforceps pour l'insertion dans l'embryon.
REMARQUE: Manipulez perles de résine échangeuse d'ions utilisées dans les étapes suivantes au numéro 5 microforceps et les saisir très doucement parce que les perles sont fragiles et peuvent se briser si pressé trop serré. Cet avertissement s'applique à 2.3.2-2.3.3 et toutes les opérations de perles de résine.
- RA
- Décongeler une quantité aliquote de 0,05 ou 0,1 mg / ml all-trans-RA dilué avec du DMSO et déposer une goutte de 100 pl sur une boîte de Pétri stérile (9 cm de diamètre) qui a été préalablement recouverte d'une feuille pour protéger la PR de la lumière. Prenez une pointe de pipette 10 pi et ramasser un échange sous forme de chlorure d'ionsperles de résine sur son extrémité et tremper ceux-ci dans la chute de RA protégé de la lumière à la température ambiante pendant 20 min.
- Rincer les billes en trois gouttes successives de 100 pi de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) placés sur la même boîte de Pétri d'au moins 1 cm.
NOTE: Les billes prennent le phénol colorant rouge du DMEM. Cette méthode est basée sur 5. - Choisissez des billes d'environ 100 um de diamètre (perles varient en taille 75-180 um lorsqu'il est mouillé) pour l'insertion dans l'embryon, en utilisant un réticule lame de platine du microscope sous la boîte de Pétri et No.5 microforceps pour tenir les perles. Lors de la cueillette jusqu'à la perle de la baisse de 100 pi de DMEM, d'abord le talon vers le bas sur la boîte de Pétri et de supprimer toute DMEM restante de celui-ci soit en poussant le cordon hors de la goutte ou en plaçant la pince fermée à côté du bourrelet (capillaire l'action tire le liquide loin de la perle).
- BMS 493
- Quant à la RA (2.3.2), trempez éch d'ionsdes billes de résine ange dans une goutte 100 ul de 2,5 ou 5,0 mg / ml BMS 493 dans du DMSO à la température ambiante pendant 20 minutes puis rincer à 100 gouttes ul de DMEM. Choisissez des billes d'environ 100 m de diamètre pour l'insertion dans l'embryon.
- le contrôle DMSO
- En ce qui concerne la PR (2.3.2), faire tremper les perles de résine échangeuse d'ions dans une goutte de 100 pl de DMSO à la température ambiante pendant 20 minutes, puis rincer à 100 gouttes ul de DMEM. Choisissez des billes d'environ 100 m de diamètre pour l'insertion dans l'embryon.
- FGF4
3. Opérations barrière et perles
Figure 1. Schéma de Chick Embryons de divers stades montrant où les obstacles et ou perles doivent être placés. (A) Etape 13 embryon de poulet schéma montrant la position de la barrière (ligne verte) entre somites et LPM au présompniveau de l'aile tive (somites 15-20). (B) Le même schéma que dans (A), ce qui indique où RA bourrelet (cercle rouge) doit être placé avant l'insertion de la barrière. (C) Position schématique montrant barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) dans un embryon stade 15. (D) Le même schéma que dans (C), indiquant où un bourrelet de RA (cercle rouge) doit être placé. (E) Schéma indiquant où BMS 493 perles (cercles violets) doivent être placés dans la LPM d'un embryon stade 15. (F) Schéma d'un embryon de poulet étape 9 indiquant la position de la barrière (ligne verte) entre le mésoderme présomitique et LPM au niveau de l' aile présomptif. (G) Schéma d'un embryon stade 9 montrant les positions d'une barrière (ligne verte) et RA talon (cercle rouge). (H) Schéma d'un embryon de poulet stade 10 montrant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif. (I 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Barrière inséré à l'étape 13 pour empêcher l'aile initiation du bourgeon.
- Prenez un embryon de l'incubateur étape 13 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent.
- À l' aide d' un micro - couteau en acier, une incision à travers la membrane vitelline et latérale mésoderme (LPM) adjacente à somites 15 et 20 (figure 1A) sur le côté droit de l'embryon (somites ne sont pas tous formés à ce stade). Couper adjacente aux quatre derniers somites formés et continuer la coupe deux longueurs de somites caudale.
- Ramassez la barrière (0,7-1 mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité faisant saillie de la boîte de Petri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. La charnière en forme de barrière repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision distale par rapport à somites. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur.
NOTE: Le micro couteau et une pince devenir collante au contact de la membrane vitelline. Il est important de les essuyer avec 70% d'éthanol avant de tenter une opération ultérieure. Cela vaut pour toutes les descriptions des opérations ultérieures et à perler implantations. - Si un cordon doit être inséré conjointement avec une barrière; d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l' insérer dans le visage de la LPM sur le côté distal de l'incision de coupe, puis insérez la barrière dans l'incision proximale à la perle (figure 1B). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur.
- Barrière inséré à l'étape 15 pour empêcher la jambe initiation des bourgeons.
REMARQUE: Un exemple du résultat de cette opération sur Tbox 4 facteur de transcription (Tbx4) expression est représentée sur la figure 2D et 2E.- Prenez un embryon de l'incubateur stade 15 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent.
- À l' aide d' un micro - couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM adjacente à somites 26-32 (figure 1c) sur le côté droit de l'embryon (somites ne sont pas tous formés à ce stade). Couper à côté des deux derniers somites formés et continuer la coupe cinq longueurs de somites caudale.
- Ramassez la barrière (1,2-1,3 mm de large) avec n ° 5 microforceps à une extrémité et tourner la barrière pour insérer l'extrémité libre dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec un ruban clairnd retourner à l'incubateur.
REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision distale par rapport à somites. - Si un cordon doit être inséré en conjonction avec une barrière, d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le visage de la LPM de coupe sur le côté distal de l'incision, puis insérez la barrière dans la partie proximale de l'incision à le bourrelet (figure 1D). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur.
- Si une bille ou billes doivent être insérés sans barrière, par exemple, BMS 493 perles à la région jambe à l' étape 15, ne font pas la longue incision (3.2.2.1). Une petite incision à travers la membrane vitelline et dans la LPM à la position du bourrelet doit être placé. Prenez le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le trou dans la LPM. Poussez - le dans un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince (Figure 1E).
- Barrière inséré à l'étape 9 pour empêcher l'aile bourgeon induction et initiation.
- Prenez une étape 8 ou 9 embryon de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère.
- L' utilisation d' un micro couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM latéral et rostrale à la ligne primitive, à l'extrémité caudale de l'embryon en ligne avec les somites (figure 1F) environ 5 somites longueurs de long.
- Ramassez la barrière (0,7-1 mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité en saillie de la boîte de Pétri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur.
REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision. - Si un cordon doit être inserted en combinaison avec une barrière; d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l' insérer dans le visage de la LPM sur le côté distal de l'incision de coupe, puis insérez la barrière dans l'incision proximale à la perle (figure 1G). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur.
- Prenez une étape 8 ou 9 embryon de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère.
- Barrière inséré à l'étape 10 pour empêcher la jambe induction de bourgeons et de l'initiation.
REMARQUE: Un exemple du résultat de cette opération sur l' expression de Tbx4 est représenté sur la figure 2G.- Prenez un embryon stade 10 de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère.
- L' utilisation d' un micro couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM latéral à la ligne primitive, à l'extrémité caudale de l'embryon en ligne avec les somites (Figure 1 H) environ 6 somites longueurs de long.
- Ramassez la barrière (1.2mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité en saillie de la boîte de Pétri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur.
REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision. - Si un cordon doit être inséré , sans barrière, par exemple, le BMS 493 bourrelet dans la région de la jambe à l' étape 10, une petite incision à travers la membrane vitelline et dans la LPM à la position du bourrelet doit être placé. Prenez le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le trou dans la LPM. Poussez - le dans un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince (Figure 1I).
- Prenez un embryon stade 10 de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère.
- 24 heures ou plus après l'exploitation vérifier la position de la barrière par rapport au membre controlatéral bourgeon naissant. Jeter les embryons dont la barrière est clairement pas Opposite le bourgeon de membre gauche. Dans ce cas, la barrière a été mal positionné.
4. récolte Embryons, Fixation et préparation pour Wholemount Hybridation In Situ (WISH)
- embryons de récolte affichent opération.
- embryons de récolte au stade 19-23 telle que bourgeon de membre morphologie est clairement visible dans les deux côtés exploités et controlatéral contrôle.
- Utilisation de ciseaux courbes couper un grand trou dans la coquille. Couper autour de l'embryon, tout en maintenant le gros vaisseau sanguin vers la gauche de l'embryon avec microforceps. Utilisez cette poignée de la cuve pour éliminer l'embryon et le placer dans une boîte de Pétri de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,3.
- Sous un microscope binoculaire, disséquer les vaisseaux et les membranes extra-embryonnaires utilisant une combinaison de ciseaux courbes et non. 5 microforceps. Retirez la tête à l'aide des ciseaux.
- embryons de récolte au stade 19-23 telle que bourgeon de membre morphologie est clairement visible dans les deux côtés exploités et controlatéral contrôle.
- Fixation d'embryons afficher la récolte.
- Utilisation de Blun incurvéet forceps, soulever l'embryon et le placer dans 5 ml paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS à température ambiante pendant deux heures à bascule, puis à 4 ° C pendant la nuit dans une bouteille en verre de 20 ml avec un bouchon à vis.
Attention: PFA est un danger grave pour la santé. Il est nocif, irritant corrosif et la poudre doit être empêché d'entrer en contact avec la peau, les yeux et les poumons. Utiliser des vêtements de protection individuelle et une hotte tout en préparant la solution. Une fois qu'il est une solution à 4%, des gants, des lunettes de protection et une blouse doit être porté.
NOTE: Il est important d'obtenir les embryons en solution rapidement pour mieux préserver l'intégrité de l'ARNm.
- Utilisation de Blun incurvéet forceps, soulever l'embryon et le placer dans 5 ml paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS à température ambiante pendant deux heures à bascule, puis à 4 ° C pendant la nuit dans une bouteille en verre de 20 ml avec un bouchon à vis.
- L' élimination des obstacles avant wholemount hybridation in situ.
NOTE: Les obstacles sont supprimés car ils sont tranchants et peuvent endommager les embryons car ils passent par le protocole d'hybridation in situ, en particulier si plusieurs embryons sont colorées à la fois.- Après la fixation, placer l'embryon dans un plat de PBS dans une mi binoculairecroscope.
- L'utilisation de deux paires de n ° 5 microforceps, placer la paire gauche près de chaque côté de la barrière dans le côté opéré de l'embryon. Attrapez la barrière avec la bonne paire et tirez doucement la barrière de l'embryon en utilisant la paire gauche pour garder l'embryon vers le bas et pour éviter tout tissu d'adhérer à la barrière lorsqu'elle est retirée.
- Effectuer WISH essentiellement comme décrit dans 11.
- Prenez un embryon de l'incubateur stade 15 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent.
- Prenez un embryon de l'incubateur étape 13 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent.
Representative Results
Le protocole détaillé ci - dessus décrit les méthodes employées dans Nishimoto et al. 2015. Le document étudie bourgeon de membre induction et de l'initiation à la fois l'avant et postérieurs de l'embryon de poulet. Résultats suite à l'insertion de barrières imperméables pour empêcher l'excroissance du bourgeon forelimb ont été publiés précédemment 1, 2, 9 , mais il n'y a eu qu'une seule étude des obstacles empêchant la jambe décrivant l' initiation du bourgeon 1. Données hindlimb de Nishimoto et al. 2015 sont présentés ici comme des résultats représentatifs de l'étude de l'expression de l'ARNm suivant l'insertion de la barrière.
Tbx4 Expression dans la LPM ne suffit pas à Initier Excroissance membres postérieurs:
Figures 2B et C (tableau 2) montrent que l' insertion de la barrière à l' étape 15 (figure 2A) (voir le protocole 3.2) conduit à la fois Fgf10et l' expression Fgf8 étant absent dans la région jambe du bourgeon (désigné par le support) sur le côté droit opéré. Comparer avec le côté gauche non opéré. Cependant, l' expression Tbx4 est observée à la fois l' étape 19 et l' étape 23 du côté opéré (Figure 2D et E). Nous concluons que l' expression Tbx4 seule ne suffit pas de lancer hindlimb excroissance de la LPM. D' autres études dans le poussin ont suggéré que l' expression du gène Tbx est suffisante pour initier la formation forelimb bourgeon 12, 13.
Figure 2C 'est inclus pour illustrer comment une barrière semble ancrée dans la région jambe de l'embryon après fixation. Dans la majorité des cas , les obstacles ont été éliminés avant l'hybridation in situ (protocole 4.3).
RA des somites est essentielle dans la LPM avant FGF10 Induit Limb Bud Outgrowth:
La figure 3A est un schéma représentant l'addition d'un bourrelet distal RA imbibé d'une barrière inséré à l' étape 15 (protocole 3.2.1.3). À la suite de cette opération bourgeon de membre excroissance (désigné par un astérisque) est observée sur le côté droit exploité et Tbx4, Fgf10 et Fgf8 sont exprimés dans l'œuf car ils sont dans le contrôle du côté gauche (figure 3B, C et D, le tableau 2) . Ainsi l'addition de RA à la LPM surmonte l'effet de la barrière et de bourgeon de membre initiation produit. Nous concluons que, dans RA développement normal du somites est essentiel dans la LPM avant bourgeon de membre excroissance peut être initiée. Les bourgeons des membres postérieurs qui en résultent sont généralement plus petits que ceux du côté de commande. Cela peut être dû à la dose de RA dans le LPM étant pas équivalent à la situation de type sauvage. Si la dose de RA est trop élevée, le apicale ectodermique Ridge (AER) peut être raccourci et plus petits bourgeons se traduirait14, 15.
Pour confirmer que RA (des somites) dans la LPM est nécessaire pour la normale initiation du bourgeon de membre d'un agoniste inverse de RAR, BMS 493, a été utilisé. Les perles sont implantées dans la région LPM jambe à l' étape 15 (voir protocole 3.2.1.4) (Figure 3E). L' expression est régulée à la baisse Fgf10 après l' application de BMS 493 perles dans la LPM, ce qui entraîne les petits boutons de la patte arrière par rapport au côté de commande (figure 3F; tableau 3). Perles de contrôle DMSO ne provoquent pas ces défauts (figures 3G et 3H; tableau 3). Les défauts constatés suivant BMS 493 applications sont plus douces que celles induites par une opération de barrière; à savoir, Fgf10 est toujours exprimée et les bourgeons de membres sont formés. Ceci est susceptible d'être parce que les effets de BMS 493 sont limités localement autour des perles et peuvent ne pas être en mesure de contrarier tout le RA produit par axiles tissus al.
Early Signals Axial Spécifiez les cellules LPM qui expriment plus tard Tbx4:
Nous avons testé lorsque le LPM acquiert sa capacité à exprimer Tbx4 dans la région de la jambe de formation prospective. La première étape à laquelle une barrière peut être inséré qui sera ensuite bloquer la jambe bourgeon excroissance, est l'étape 10. Nous sommes les premiers à développer un protocole pour insérer des obstacles à des étapes antérieures à l'étape 12. Les obstacles insérés entre le mésoderme paraxial et la jambe présomptif LPM à l' étape 10 (voir le protocole 3.4) la formation des bourgeons de la jambe de bloc et l'expression de Tbx4 dans la jambe formant LPM (figures 2F et 2G, tableau 2), ce qui suggère qu'un signal à partir de tissus axiaux à l' étape 10 est nécessaire pour l' expression ultérieure de Tbx4 dans hindlimb LPM. Comparer ce résultat avec les figures 2D et E où l' insertion de barrière plus tard , permet l' expression de Tbx4être établit. En outre, nous avons testé si ce signal axial pourrait être RA en observant si l'agoniste inverse de RAR réduit l' expression de Tbx4. Un BMS 493 perles placé dans le LPM de hindlimb à l' étape 10 (voir protocole 3.4.1.3) régule négativement l' expression de Tbx4 (figures 2H et 2I), alors que des billes de contrôle trempées dans du DMSO ne touchent pas l' expression Tbx4 (figures 2J et 2K). Ensemble, ces résultats supportent un modèle d' un signal RA à partir de tissus axial régule la branche d' induction en régulant positivement Tbx4 dans la patte arrière 7 LPM.
Mort post-opératoire:
Les tableaux 1, 2 et 3 donnent des détails sur les résultats expérimentaux , y compris le nombre d'embryons de poulets qui sont morts après l' opération et avant la récolte. Certains décès sont à prévoir après la microchirurgie de cette nature. Le nombre mort peut être conservé au minimum en faisant en sorte que les instruments sont propres, le trou dans l'œuf est la taille minimale requise, que les embryons sont laissés sans la protection du joint de ruban adhésif pour un minimum de temps et, en liaison avec ce dernier point que l'opération est effectuée le plus rapidement possible. Aucune de ces opérations prennent beaucoup de temps, mais les opérations impliquant des perles et des barrières prendre un peu plus de temps. En dépit de ces mesures, les opérations effectuées dans les premiers stades et ceux de la région de l'aile sont plus susceptibles d'entraîner la mort. Il y a de grands vaisseaux sanguins autour des régions des membres formant et rupture accidentelle de ces navires peuvent entraîner la mort en raison de la perte de sang. Nous trouvons que les œufs ont ouvert à l'étape 8 ou 9, dont les embryons ont pas été opéré, sera souvent mourir le lendemain. Par conséquent, la seule solution à ces problèmes est de réaliser un grand nombre d'expériences.
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Figure 2. Marqueur Gene Expression Changements suivants Barrière ou Bead Insertion au présomptif Leg Level. (A) Position montrant Schéma de barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) dans un embryon stade 15. (B - E et G) analyse WISH sur les embryons opérés. La région jambe est indiquée (entre parenthèses). (B) l' expression de Fgf10 est absent dans le LPM exploité, mais une expression robuste est détectée dans le bourgeon gauche. (C) l' expression de Fgf8 est absent du côté opéré, ce qui suggère qu'il n'y a pas de l' ARE. (C ') de même embryon avant que la barrière a été enlevée. (D) Tbx4 est exprimée dans la LPM au même niveau rostro-caudale comme le bourgeon de contrôle. (E) l' expression Tbx4 est maintenue dans la région de la jambe droite , malgré l' absence de croissance du membre. (F) Schéma d'une étape 10 embryon de poulet montrant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif. (G) l' expression Tbx4 est absente dans le droit exploité LPM (support). (H) Schéma d'un embryon de poulet stade 10 montrant BMS 493 position de talon (cercle violet) au niveau de la jambe présomptif. (I) l' expression Tbx4 est downregulated sur le côté droit opéré après un traitement avec BMS 493. (J) Schéma d'un embryon de poulet stade 10 montrant la position du DMSO de perles de commande (cercle gris). (K) Tbx4 est exprimé sur le côté droit fonctionnant à un niveau similaire à celui du contrôle du côté gauche suite à un traitement avec du DMSO seul. Ce chiffre a été modifié depuis 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Absence de Figure 3. RA Sauvetages Limb Bud Causée par la barrière d' insertion et est essentielle dans la LPM Avant Leg Bud Excroissance. (A) Représentation schématique indiquant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) et un bourrelet RA-imbibée (cercle rouge). (B - D) RA sauvetages excroissance jambe bourgeon (représenté par un astérisque). (B) l' expression de Tbx4 est présent dans l'œuf sauvé la jambe similaire à la partie non-exploité. (C) Fgf10 est exprimé dans la jambe secouru bourgeon similaire au côté non exploité. (D) Fgf8 est exprimée dans l'ARE du bourgeon de la jambe droite sauvé. (E) Schéma indiquant où BMS 493 perles (cercles violets) ont été placés dans la LPM jambe présomptif de stade 15 embryons. (F) l' expression Fgf10 est downregulated sur le côté droit exploité et le bourgeon de la jambe est faible BMS 49 suivant3 traitements. Les perles sont marqués d'un astérisque. (G) , schématique similaire à (E), qui indique la position de perles de DMSO de contrôle (cercles gris). (H) perles de DMSO (représentés par des astérisques) n'a pas affecté l' expression Fgf10 ou la taille jambe du bourgeon. Ce chiffre a été modifié depuis 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Étape barrière placée (+ perle) * | Nombre exploité | Wing manquant ** | Wing présente ** | Nombre morts |
| étape 12-14 | 40 | 24 | 1 | 15 |
| Etape 8/9 | 65 | 23 | 0 | 42 |
| Etape 12-13 (FGF4 perle) | 41 | 7 (bourrelet manquant) | 17 | 17 |
| Etape 12-13 (RA perle) | 75 | 9 (bourrelet manquant) | 32 | 34 |
| Etape 13 (contrôle perle) | 5 | 3 | 0 | 2 |
| * Barrières de feuilles 0,7-1 mm placés entre somites 15-20 et le mésoderme latéral. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle. | ||||
| DMSO bille de contrôle. | ||||
| ** stades des embryons de poussins fixes 21-23 | ||||
Tableau 1. Wing Barrière et résultats Bead __gVirt_NP_NN_NNPS<__ Experiment.
| Étape barrière placée (+ perle) * Nombre exploité | Jambe manquantes ** | Leg présente ** | Nombre morts | |
| Etape 12-15 | 43 | 39 | 0 | 4 |
| Etape 10/11 | 23 | 16 | 0 | 7 |
| Etape 15 (FGF4 perle) | 8 | 0 | 5 | 3 |
| Etape 15 (RA talon) | 18 | 0 | 18 | 0 |
| * Barrières de feuilles 0,7-1,3 mm placés entre somites 26-32 et le mésoderme latéral. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05-0,1 mg / ml RA perle. | ||||
| ** stades des embryons de poussins fixes 18-24 | ||||
Tableau 2. Leg Barrière et résultats Bead __gVirt_NP_NN_NNPS<__ Experiment.
| Nombre exploité | Leg bourgeon petit | Leg bourgeon un peu petite | Leg taille normale bourgeon | Nombre morts |
| BMS 493 perles * | ||||
| 15 | 12 | 3 | 0 | 0 |
| Perles de DMSO ** | ||||
| 12 | 0 | 3 | 9 | 0 |
| * 2-3 perles trempées dans 5 mg / ml BMS 493 placés dans la bonne étape 14-15 LPM au niveau de la jambe. | ||||
| ** 2-3 perles trempées dans du DMSO seul placés dans la bonne étape 15 LPM au niveau de la jambe. | ||||
| embryons de poulet fixés à des stades 17-19. | ||||
Tableau 3. Résultats Leg Level BMS 493 Bead __gVirt_NP_NN_NNPS<__ Experiment.
Discussion
Nous décrivons l'utilisation de barrières imperméables pour empêcher le membre formation des bourgeons dans l'embryon de poulet. Cette technique présente un certain nombre d'étapes critiques. Après des expériences préliminaires, nous avons constaté que les barrières en forme de charnière utilisés dans 9, 10 restent en place dans l'embryon beaucoup mieux que les barrières droites. La face distale plate de la barrière adhère à la membrane vitelline et maintient la barrière en place (figure 2C). Une préparation minutieuse de la charnière barrières en forme de feuille d'aluminium comme décrit dans le protocole étape 1.6 est essentielle à la réussite de l'opération. Une deuxième étape importante consiste à veiller à ce que les œufs ne sont pas exclus de l'incubateur pendant trop longtemps suivant fenêtrage et la mise en scène avant de faire fonctionner sur l'embryon. Dans notre expérience, les embryons survivent une opération mieux si elles sont à ou près de la température d'incubation lorsque l'opération est effectuée. Les opérations doivent donc être effectués aussi rapidement que possible et les oeufs rapidement refermésly pour assurer un bon taux de survie. De nombreux chercheurs ajoutent une goutte d'antibiotiques pour l'embryon suivant microchirurgie avant de retourner les œufs dans l'incubateur. La présence du liquide empêche les barrières se collent bien en place. L'addition d'un antibiotique pourrait également déloger des perles après le placement. Donc pas l'utilisation d'antibiotiques, des opérations rapides et une bonne propreté des instruments est recommandé d'éviter l'infection. Essuyant instruments avec 70% d'éthanol après chaque étape d'une opération est essentielle pour prévenir les instruments de devenir collant de contact avec la membrane vitelline qui peut provoquer à la fois des barrières ou des perles à adhérer à une pince (voir protocole étape 3.1.2.2). Les deux variétés de perles utilisées pourraient tomber sur place après l'opération. Lorsque la position de la barrière a été vérifiée le lendemain, il n'a pas été possible de voir à travers la barrière de vérifier si le cordon est resté en place ou non. Dans les cas où le cordon était tombé sur des bourgeons de l'aile excroissance n'a pas été sauvé ( Ce protocole modifie les expériences publiées antérieurement qui ont utilisé des barrières pour empêcher bourgeon de membre initiation, définit des largeurs optimales spécifiques pour les barrières et introduit la combinaison barrière et le placement de perles suivie d'une analyse de l'expression des gènes. Nous avons trouvé en utilisant une feuille d'aluminium classique, qui est pas cher et facilement disponible dans tous les laboratoires, produit des résultats égaux à ceux qui utilisaient auparavant une feuille de tantale. La feuille peut être laissé dans l'embryon lors de la réalisation d' une hybridation in situ (figure 2C) en général , mais nous enlever si plus d'un embryon est en cours de traitement afin d' éviter les arêtes vives de la feuille d' endommager les embryons. PDes études ont démontré ilot que la largeur des barrières de la région de la jambe est particulièrement importante. Au départ, les obstacles mis à l'essai étaient trop courts et la jambe bourgeon excroissance n'a pas été empêché. 1,2-1,3 mm est la largeur optimale pour une barrière pour bloquer la jambe bourgeon excroissance complètement. Les barrières les plus étroites de l'aile que l'on peut placer avec précision pour empêcher l'excroissance des bourgeons donnent les meilleurs taux de survie. Cela peut être aussi étroite que 0,5-0,7 mm. Cependant, les obstacles qui sont un peu plus larges sont plus susceptibles d'entraîner un blocage complet de l'aile bourgeon excroissance car ils permettent un peu de l'inexactitude du placement (nous avons utilisé 0,7-1 mm). Prévention des vaisseaux sanguins lors de l'incision est critique pour les barrières au niveau des bourgeons de l'aile. barrières semi-perméables ont déjà été utilisés pour bisect le bourgeon poussin membre. MacCabe et Parker, 1976 et Summerbell 1979 filtres utilisés à la fois 0,45 um et 0,8 um taille des pores, respectivement 16, 17. Ils ont indiqué que les signaux diffusibles pourraient passer à travers les pores dans les filtres et querésultats obtenus en utilisant des barrières semi-perméables étaient à mi-chemin entre un bourgeon de membre sans barrière présente et une avec une barrière de feuille de tantale imperméable. Ce protocole peut être adapté pour utiliser des barrières semi-perméables de différentes tailles de pores pour différencier les signaux candidats en fonction de la taille ou de modifier la dynamique de la diffusion du signal. Ce protocole comporte des limites principalement associées à l'organisme modèle lui-même. Ces techniques pourraient être utilisées pour sonder d'autres questions dans le développement des membres ainsi que d'autres questions de l'embryogenèse des vertébrés. Une condition est que l'organe / zone en question devrait développer lorsque l'embryon de poulet est accessible à l'intervention. La présence de gros vaisseaux sanguins dans la zone où une barrière doit être placée rend le placement de barrière plus tard que le stade 13 ou 14 techniquement difficile. Si les gros vaisseaux sanguins sont coupés lors de la pose de barrière cela peut entraîner une mortalité embryonnaire. Notre enquête quand les facteurs de transcription TBX5 et Tbx4 sont induits en premier dans la LPM a été limitée par la première étape à laquelle nous pourrions placer une barrière qui allait plus tard se retrouver en face soit l'aile ou de la jambe bud respectivement. Il pourrait être éclairant pour tenter de bloquer Tbx induction du gène à des stades précoces, plus proche de la gastrulation. La première barrière pourrait être placée dans la région de l'aile présomptif était avec succès l'étape 8 et à l'étape de la région de la jambe 10. Ce protocole est probablement pas adapté à l'étude de l'expression génique au-delà des étapes branche bourgeon parce que la croissance rapide ultérieure entraînerait le déplacement de la barrière et les résultats ne porterait que sur la position initiale de la barrière. Après avoir lié les limites de l'embryon de poulet, dans ce contexte, de ses avantages par rapport à d'autres organismes modèles vertébrés sont nombreux. L'embryon de poulet est un modèle animal bien adapté à ce type d'intervention physique dans un embryon de vertébré. Les embryons sont relativement importants et sont facilement accessibles through la coquille. On peut revenir à l'embryon pour une expérimentation plus poussée (par exemple, la suppression d'un cordon 18 ou même une barrière) ou pour vérifier les progrès en retirant simplement la fenêtre de la bande. Il est possible possible d'inclure l'imagerie en direct ou à la prescription imagerie en temps. Nous décrivons une méthode de fenêtrage des œufs de poule qui est particulièrement adaptée à l'exploitation sur les embryons à un stade précoce. Dans le cas des études des membres, il est très important et utile qu'il y ait un membre de commande controlatéral pour chaque expérience qui sert de contrôle interne idéal pour chaque répétition biologique. La combinaison de l'utilisation de barrières imperméables pour empêcher la croissance du membre et des billes trempées dans des molécules de signalisation n'a pas été signalée auparavant. Notre analyse de l'expression de l'ARNm suite de ces interventions est également nouvelle. Ces techniques nous ont permis de disséquer le problème difficile du moment branche transcription spécifique des facteurs Tbx5 et Tbx4 sont induits dans la LPM et aussipour montrer que plus tard, avant Elaguez initiation bourgeon, la présence de ces gènes TBX dans la LPM ne suffit pas pour l'activation de la transcription Fgf10 et le début du bourgeon de membre excroissance. Les figures 2G, 2D et 2E illustrent bien ces résultats. L'absence d'expression de Tbx4 suite à l'insertion d'une barrière à l' étape 10 de la figure 2G est en contraste frappant avec sa présence en 2D et 2E après l' insertion de barrière à l' étape 15, après l'induction de Tbx4. L'implantation de billes RA imbibés facilité le sauvetage de bourgeon de membre initiation après l'insertion de la barrière et donc des points à RA des somites étant essentiel dans la LPM avant bourgeon de membre excroissance peut commencer. Ces techniques pourraient être utilisées pour résoudre d'autres questions dans le développement des membres, mais aussi d'autres questions de vertébrés embryogenèse. Les zones du cerveau, des yeux et du tronc sont susceptibles de convenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
