Abstract
Den dama embryo gir en ypperlig virveldyr modell som kan brukes til å dissekere utviklings spørsmål på en direkte måte. Sin tilgjengelighet og robusthet etter kirurgisk inngrep er viktige eksperimentelle styrker. Glimmer platene var de første barrierene brukes for å hindre chick lem knopp innvielse en. Protokoller som bruker aluminiumsfolie som en ugjennomtrengelig barriere mot vinge knopp eller ben knopp induksjon og eller initiering er beskrevet. Vi kombinerer denne teknikken med perle plassering sideveis til hinder for eksogent forsyning kandidat endogene faktorer som har blitt blokkert av barrieren. Resultatene er analysert ved hjelp av in situ hybridisering av etterfølgende genekspresjon. Vårt hovedfokus er på rollen retinsyre signalering i induksjon og senere oppstart av kylling embryo forgrunnen og bakben. Vi bruker BMS 493 (en invers agonist av retinsyrereseptorer (RAR)) bløtlagt perler implantert i sideplaten mesoderm (LPM) for å etterligne virkningen av en tverrrier plasseres mellom somites (en kilde for retinsyre (RA)) og nevnte LPM fra hvilken lem knopper vokse. Modifiserte versjoner av disse protokollene kan også brukes til å ta opp andre spørsmål om opprinnelsen og timing av induktive signaler. Forutsatt at regionen av kylling embryo er tilgjengelig på den aktuelle utviklingsstadiet, kan en barriere anbringes mellom de to vev og påfølgende endringer i utvikling studert. Eksempler kan finnes i utviklingen av hjernen, akse forlengelse og i organutvikling, slik som lever eller nyre induksjon.
Introduction
Klassiske embryologists tradisjonelt benyttet fysiske teknikker for å avhøre de mekanismene som styrer embryonal utvikling. I 1960 og 1970 etterforskere utviklet teknikker som brukes ugjennomtrengelige barrierer satt inn mellom vev i utvikling av embryo for å demonstrere viktigheten av induktive signaler under embryogenese. Vår interesse er i virveldyr lem utvikling og spesielt hvilke hendelser forut lem knopp utvekst. For eksempel kan innføring av en barriere for å hindre lem knopp utvekst oppstår på den ene side av kylling embryo samtidig som det å fortsette normalt på den kontralaterale, unoperated side. Materialer som brukes for å lage disse barrierene variert; for eksempel, glimmer platene 1 og tantal folie 2. Disse barrierene effektivt skille sideplaten mesoderm (LPM), hvorfra lem bud former, fra de somites dannet fra paraksialt mesoderm. Kirurgiske pode teknikker viser at nær tilknytning viddh somites er viktig hvis lem knopp oppstart skal skje i LPM 3 4. På 80-tallet og 90-tallet utviklings biologer oppdaget diffusible signalmolekyler som er avgjørende i å kontrollere utviklingsprosesser. Perler fuktet med disse signalmolekyler kan implanteres i spesifikke områder av embryoet og produsere endringer i embryonal utvikling. For eksempel er retinsyre (RA) som opptas av ionebytterperler frigis over en 24-timers periode når implantert i en kyllingembryo og kan produsere speilbilde duplisering av sifrene 5. Heparin akryl perler inneholder FGF protein kan initiere lem bud utvekst fra interlimb LPM 6.
Mer nylig mus og fiske genetikk har tatt studiet av virveldyr lem innvielse i en ny epoke (anmeldt i 7). Det er god dokumentasjon på at RA tilstede i somites før lem knopp initiering er den avgjørende diffusible signal kreves av LPM å initiere lem spirende. Vi ønsket å utnytte tilgjengelighet og eksperimentell robusthet av kylling embryo å dissekere effekten av barriere implantasjon på genuttrykk i LPM rundt tidspunktet for lem bud innvielse. En roman tilpasning av vår metode er å kombinere en barriere som blokkerer signalene fra aksiale vev med perle plassering sideveis til hinder for eksogent forsyning kandidat endogene faktorer som har blitt blokkert av barrieren. Følgende protokoller er de som er utviklet for å erte ut mekanismene for lem bud induksjon og innvielse.
Studerer lem knopp innvielse betyr å bruke tidlig stadium embryoer. Mange forskere vindu kyllingegg ved først å fjerne noe av albumin gjennom luftsekken med en hypodermisk nål. Embryo, som ligger på toppen av eggeplomme, vil da ligge lavere i egget. Dette er en fordel for noen teknikker, som for eksempel elektroporering, men kan være en ulempe hvis kirurgisk manipulering av embryoet er ønsket.Vi synes å ha embryoet så nær åpningen i egget som mulig, er en fordel.
Spørsmål gjenstår om de signalene som styrer virveldyr lem knopp induksjon og initiering og følgende protokoller er egnet til å løse dem. Vi er de første til å utvikle en protokoll for innsetting av barrierer for å hindre at dama lem knopp utvekst på et stadium før scenen 12 8. Modifiserte versjoner av disse protokollene kan også brukes til å ta opp andre spørsmål om opprinnelsen og timingen av induktive signaler hvor en rullestol induserende vev ligger ved siden av primordium blir indusert. Forutsatt regionen av embryoet er tilgjengelig på den aktuelle utviklingsstadiet, da en barriere kan plasseres mellom de to vev og påfølgende endringer i utvikling studert. Eksempler kan finnes i hjernens utvikling, akse forlengelse og eventuelt organutvikling slik som lever eller nyre induksjon.
Protocol
Den følgende protokollen bruker kyllingembryoer på mindre enn ti dagers inkubasjon. Alle forsøkene ble utført i samsvar med Kings College London, UK og retningslinjer britiske hjemmekontoret dyr omsorg.
1. Forberedelse kreves før kyllingembryo Operation
- Samle følgende kirurgiske instrumenter som kreves for driften, for høsting og for innfesting av kyllingfoster: to par No. 5 urmakere tang, ett par sterke tang, f.eks type AA, buet saks med blader 2,5 cm lange, butt endte buet pinsett med endene ca 0,5 cm lange, og også to par nr 4 urmakere pinsett til å bruke, samtidig som folie barrierer (1.6.3).
- Lag en mikro kniv fra en stålpinne (0,3 mm over) skjerpet ved hjelp av olje på en skjerping stein. Ved hjelp av en kikkert mikroskop, skjerpe tuppen av pinnen til en flat blad. Sett pinnen i en nål holder og beskytte sin skarpe enden blir slått og hietted.
MERK: Vindsperre kniven med en 1000 mL pipette tips er en enkel mulighet for dette. - Fremstille 70% etanol i en plastvaskeflaske. Bruk en skvett av dette på et papir vev til å tørke av kirurgiske instrumenter og mikro kniv før og etter bruk for å sterilisere og rense dem.
- Kjøp 5 cm bredt klar tape og en passende dispenser. Finn eller produsere en pause egnet til å holde en kylling egg stødig på sin side.
- Lag og lagre løsninger for avslapnings perler.
- Forbered en 0,35 mg / ml løsning av fibroblast vekstfaktor 4 (FGF4) protein fra 1 mg / ml frossen lager ved å fortynne det med vann og oppbevares ved -20 ° C i 30 ul porsjoner.
- Fremstille oppløsninger (enten 0,05 eller 0,1 mg / ml) av all-trans-retinsyre (RA) ble fortynnet med dimetylsulfoksyd (DMSO) i mørke mikrosentrifugerør fra en 5 mg / ml lager. Oppbevar lager og 100 ul porsjoner ved -20 ° C.
- Fremstille oppløsninger (enten 2,5 eller 5 mg / ml) av BMS 493 (en invers agonist av RARs) fortynnet med DMSO i mørke mikrosentrifugerør fra en 10 mg / ml lager. Oppbevar lager og 100 ul porsjoner ved -20 ° C.
- Gjør barrierer fra aluminiumsfolie.
MERK: folie som brukes til å lage barrierene er standard betjent folie (målt med mikrometer som 0,013 mm tykkelse). Enhver innenlandske aluminiumsfolie ville trolig være egnet.- Skjær et 1 cm firkantet stykke aluminiumsfolie og sterilisere den ved å tørke den med 70% etanol på en vev. Plasser den på en 6 cm steril plast petriskål. Kast lokket og lage et lokk for parabolen fra folien.
MERK: Dette vil hindre at kuttet barrierer fra senere fester seg til plastlokk av fatet på grunn av statisk. - Sett petriskål på toppen av en scene graticule (1 cm lang delt inn i 100 seksjoner) under en kikkert mikroskop med forstørrelse satt til 1,6x. Ved hjelp av en No.15 blad liten skalpell, kuttet strimler av folien til en eksakt bredde, f.eks, 0,7 mm eller 1,3 mm.
- Skill foliestrimler ved hjelp av to par nr 4 urmakere tang. Deretter foreta en rettvinklet bøy i midten av foliebarriere, slik at det ligner et hengsel av den bestemte bredde.
MERK: Denne formen barrieren er hentet fra 9, 10. En hengslet barriere holder seg på plass bedre enn en rett, flat barriere. No. 4 tang er relativt sløv og brukes fordi de er mindre tilbøyelige til å gjøre bulker og skrammer i folie barrierer. - Line opp barrierer i sentrum av petriskål med en side flatt mot fatet og den andre peker opp ut av fatet, flytte de resterende uncut folien til side. Forbered 20 eller flere barrierer før operasjonen dag. Sett inn folielokk over parabolen og lagre barrierer i et sted hvor de ikke vil bli forstyrret.
MERK: Selv en liten banker kan tipse barrierer enn eller bety at de feste med statisk til sidene av parabolen.
- Skjær et 1 cm firkantet stykke aluminiumsfolie og sterilisere den ved å tørke den med 70% etanol på en vev. Plasser den på en 6 cm steril plast petriskål. Kast lokket og lage et lokk for parabolen fra folien.
- Inkuber befruktede kylling egg på sine sider på papp egg skuffer 38 °C for den passende tidsrom før operasjonen dag slik at embryoene vil være ved det ønskede 8 trinnet.
2. Utarbeidelse av kyllingfostre og perler på Operasjon Dagsverk
- 'Window' inkuberes kylling egg.
MERK: Følgende metode for åpning egg ble videreført av Dennis Summer (ikke publisert).- Med egget liggende på siden, pierce den butte enden (luft sac slutten) av egg med type AA sterke tang å sørge for at det indre skallet membran er brutt. For å gjøre dette grepet tangen hardt sammen og bruke en kontrollert knivstikking bevegelse mens du holder egget med frie hender.
- Ta egget, fortsatt liggende på siden, i begge hender (en på hver side) snu det 180 ° langs den horisontale aksen og erstatte den i egget skuffen slik at den siden som var øverste er nå ved siden av skuffen.
MERK: Dette løsner embryo fra skallet membraner og vil bety at fosteret er less sannsynlighet for å bli kuttet når skallet ovenfor embryoet blir fjernet. - Ta et stykke klar tape ca 5 cm firkantet og hold denne tett over den øverste overflaten av egg for å stoppe eggeskallet fra smuldrer bort embryoet når egget er åpnet.
- Bruk buet saks til forsiktig bryte gjennom skallet og dets membraner i sentrum av den øverste del av egget, gjør et meget lite hull med en blad av saksen, slik at luft kan komme inn i egget over fosteret (som ligger i underkant den øverste del av skallet).
MERK: Ved bare å bryte skallet membraner og ikke bryte noen av membraner som dekker embryo, luft kommer inn i egget vil skille embryoet fra skallet og embryoet vil komme til å hvile på toppen av eggeplomme ca 0,5-1 cm fra skallet . - Bruk buet saks for å forstørre hullet i skallet til en sirkel med en diameter på omtrent 1 cm. Fjern stykke utskåret skall og dekke hullet i egget med enstykke klar tape ca 5 cm kvadrat. For enkelt å fjerne dette båndet, trykk på tape til å feste det bare på kanten av hullet, og de resterende tape gratis. Den frie tape kan deretter gripes å bryte seglet egget.
- Stage embryoer
- Etter inkubasjon ved 38 ° C (se trinn 1.7) og vindus (trinn 2.1), bruker en kikkert mikroskop for å iscenesette de kyllingfoster i henhold til åtte. Gjør dette rett før eggene er forseglet følgende vindus. Skriv scenen i hvert embryo på eggeskallet. Returner egg til inkubatoren.
MERK: Embryoet på etapper mellom 8 og 15 er egnet for barriere og perle eksperimenter. Embryoet er mer sannsynlig å overleve hvis de ikke har blitt utelatt fra inkubator for lenge før operasjonen.
- Etter inkubasjon ved 38 ° C (se trinn 1.7) og vindus (trinn 2.1), bruker en kikkert mikroskop for å iscenesette de kyllingfoster i henhold til åtte. Gjør dette rett før eggene er forseglet følgende vindus. Skriv scenen i hvert embryo på eggeskallet. Returner egg til inkubatoren.
- Avslapnings perler før operasjonen.
- FGF4
- Ta antall affinitetskromatografi gelperler (150-300 um) som feste til enden av en 1000 mL pipettespissen og varh dem i 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) i en mikrosentrifuge røret for å fjerne azidet de er lagret i. Sentrifuger i 5 sek, kastes PBS og gjenta prosessen to ganger.
- Bløt gelperlene i en 30 ul dråpe på 0,35 mg / ml FGF4 protein på en steril petriskål på is i 30 min. Plukke perler omtrent 150 mikrometer i diameter med No. 5 microforceps for innføring i embryo.
MERK: Handle ionebytteharpiksperler brukes i følgende trinn med No. 5 microforceps og grep dem svært forsiktig fordi perlene er skjør og kan knuse hvis presset for hardt. Denne advarselen gjelder 2.3.2-2.3.3 og alle harpiks perle operasjoner.
- RA
- Tine en alikvot på 0,05 eller 0,1 mg / ml all-trans-RA fortynnet med DMSO og plassere en 100 ul dråpe på en steril petriskål (9 cm diameter), som på forhånd er blitt dekket med folie for å beskytte mot lys RA. Ta en 10 mL pipette tips og plukke opp noen kloridform ionebytteharpikskuler på sin ende og suge disse i RA fallet beskyttet mot lys ved romtemperatur i 20 min.
- Skyll perlene i tre påfølgende dråper 100 ul Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som er plassert på samme petriskål minst 1 cm fra hverandre.
MERK: Perlene ta opp fenol rødt fargestoff fra DMEM. Denne metoden er basert på fem. - Plukke perler omtrent 100 mikrometer i diameter (perler varierer i størrelse 75-180 um i våt tilstand) for innføring i embryo, ved hjelp av en objektbord graticule skyve under petriskålen og No.5 microforceps for å holde kulene. Når du plukker opp perlen fra 100 ul dråpe DMEM, første plass perlen ned på petriskål og fjerne eventuelle gjenværende DMEM fra det enten ved å skyve perle ut av fallet eller ved å plassere de lukkede tang ved siden av perle (kapillær handling trekker væske bort fra vulsten).
- BMS 493
- Som for RA (2.3.2), suge ion vekslerange harpikskuler i en 100 ul dråpe av 2,5 eller 5,0 mg / ml BMS-493 i DMSO ved romtemperatur i 20 minutter og deretter skylles i 100 ul dråper av DMEM. Plukke perler omtrent 100 mikrometer i diameter for innføring i embryo.
- DMSO kontroll
- Som for RA (2.3.2), suge ionebytte-harpiksperler i et 100 ul dråpe DMSO ved romtemperatur i 20 minutter og deretter skylles i 100 ul dråper av DMEM. Plukke perler omtrent 100 mikrometer i diameter for innføring i embryo.
- FGF4
3. Barrier og Perler Operations
Figur 1. Skjematisk av kyllingfoster av ulike stadier viser hvor Barrierer og eller perler bør plasseres. (A) Stage 13 kylling embryo skjematisk viser barriere posisjon (grønn linje) mellom somites og LPM på presumptive vinge nivå (somites 15-20). (B) Den samme skjematisk som i (A), som angir hvor RA perle (rød sirkel) bør plasseres før barriere innsetting. (C) Skjematisk viser barriere posisjon (grønn linje) på presumptive etappe nivå (somites 26-32) i en scene 15 embryo. (D) Den samme skjematiske som i (C), som indikerer hvor en RA vulst (rød sirkel) skal plasseres. (E) Skjematisk indikerer hvor BMS 493 perler (lilla sirkler) bør plasseres i LPM av en scene 15 embryo. (F) Skjematisk diagram av en scene 9 kyllingembryo som angir barriereposisjonen (grønn linje) mellom presomitic mesoderm og LPM ved den presumptive vinge nivå. (G) Skjematisk diagram av en scene 9 embryo som viser posisjonene av en barriere (grønn linje) og RA vulst (rød sirkel). (H) Skjematisk diagram av en scene 10 kyllingembryo viser barriereposisjonen (grønn linje) ved den presumptive benet nivå. (I 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Barrier inn på scenen 13 for å hindre vingen knopp innvielse.
- Ta en scene 13 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig. Fjerne det øvre lag av klar tape.
- Ved hjelp av en stålmikro kniv, gjør et snitt gjennom vitelline membranen og sideplaten mesoderm (LPM) tilstøtende til somites 15 til 20 (figur 1A) på høyre side av embryoet (somites har ikke alle dannet ved dette trinn). Kutt i tilknytning til de siste fire somites dannet og fortsette kuttet to somitt lengder caudally.
- Plukk opp barrieren (0,7-1 mm bred) med No. 5 microforceps ved enden som rager ut fra petriskålen og vri hånden til å sette inn den frie ende av barrieren inn i snittet. Hengslet formet barriere ligger flatt på vitelline membran over LPM med halvparten av det som stikker nedover gjennom snittet distal til somites. Så snart som mulig forsegle egg med klar tape og returnere det til inkubatoren.
MERK: micro kniv og tang bli klissete på kontakt med vitelline membran. Det er viktig å tørke dem rene med 70% etanol før du prøver en påfølgende operasjon. Dette gjelder for alle påfølgende drift beskrivelser og å perle implantasjoner. - Hvis en perle skal settes inn i forbindelse med en barriere; for det første, ta perle i No. 5 microforceps og sett den inn i kuttet ansiktet av LPM på den distale side av snittet og deretter sette barrieren i snittet proksimalt for perle (figur 1B). Tett egg og returnere det umiddelbart til inkubatoren.
- Barrier inn på scenen 15 for å hindre etappe knopp innvielse.
NB: Et eksempel på resultatet av denne operasjon på TBox 4 transkripsjonsfaktor (Tbx4) ekspresjon er vist i figur 2D og 2E.- Ta en scene 15 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig. Fjerne det øvre lag av klar tape.
- Ved hjelp av en stålmikro kniven gjør et snitt gjennom vitelline membranen og LPM tilstøtende til somites 26-32 (figur 1C) på høyre side av embryoet (somites har ikke alle dannet ved dette trinn). Kutt i tilknytning til de to siste somites dannet og fortsette kuttet fem somitt lengder caudally.
- Plukk opp barrieren (1,2-1,3 mm bred) med # 5 microforceps i den ene enden og vri barriere for å sette den frie enden inn i snittet. Så snart som mulig forsegle egg med klar tape ennd returnere den til inkubatoren.
MERK: hengsel formet barriere ligger flatt på vitelline membran over LPM med halvparten av det som stikker nedover gjennom snittet distal til somites. - Hvis en perle skal settes inn i forbindelse med en barriere, for det første, ta perle i No. 5 microforceps og sett den inn i kuttet ansiktet av LPM på den distale side av snittet og deretter sette barrieren i snittet proksimalt for perlen (figur 1D). Tett egg og returnere det umiddelbart til inkubatoren.
- Hvis en vulst eller perlene som skal settes inn uten en barriere, for eksempel, trenger BMS 493 perler på benet regionen til stadium 15, ikke gjør den lange innsnitt (3.2.2.1). Lage et lite snitt gjennom vitelline membranen og inn i LPM ved posisjonen vulsten skal plasseres. Ta perle i No. 5 microforceps og sett den inn i hullet i LPM. Skyv den i et litt videre med de lukkede endene av tang (figur 1E).
- Barrier inn på scenen 9 for å hindre vingen knopp induksjon og innvielse.
- Ta en scene 8 eller 9 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig.
- Ved hjelp av en stålmikro kniven gjør et snitt gjennom vitelline membranen og LPM lateral og rostralt til det primitive strek, ved kaudal enden av embryoet i tråd med somites (figur 1F) omtrent 5 somitt lengder lang.
- Plukke opp barrieren (0,7-1 mm) med 5-nr microforceps ved enden som rager ut fra petriskålen og vri hånden til å sette inn den frie ende av barrieren inn i snittet. Så snart som mulig forsegle egg med klar tape og returnere det til inkubatoren.
MERK: hengsel formet barriere ligger flatt på vitelline membran over LPM med halvparten av det som stikker nedover gjennom snittet. - Hvis en perle er å være inserted i forbindelse med en barriere; for det første, ta perle i No. 5 microforceps og sett den inn i kuttet ansiktet av LPM på den distale side av snittet og deretter sette barrieren i snittet proksimalt for perle (figur 1G). Tett egg og returnere det umiddelbart til inkubatoren.
- Ta en scene 8 eller 9 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig.
- Barrier inn på scenen 10 for å hindre etappe knopp induksjon og innvielse.
NB: Et eksempel på resultatet av denne operasjon på Tbx4 ekspresjon er vist i figur 2G.- Ta en scene 10 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig.
- Ved hjelp av en stålmikro kniven gjør et snitt gjennom vitelline membranen og LPM sideveis til den primitive strek, ved kaudal enden av embryoet i tråd med somites (figur 1 H) omtrent 6 somitt lengder lang.
- Plukk opp barrieren (1,2mm bred) med No. 5 microforceps ved enden som rager ut fra petriskålen og vri hånden til å sette inn den frie ende av barrieren inn i snittet. Så snart som mulig forsegle egg med klar tape og returnere det til inkubatoren.
MERK: hengsel formet barriere ligger flatt på vitelline membran over LPM med halvparten av det som stikker nedover gjennom snittet. - Hvis en perle er å innføres uten en barriere, for eksempel, BMS 493 vulst til benet området ved planet 10, gjør et lite snitt gjennom vitelline membranen og inn i LPM ved posisjonen vulsten skal plasseres. Ta perle i No. 5 microforceps og sett den inn i hullet i LPM. Skyv den i et litt videre med de lukkede endene av tang (figur 1i).
- Ta en scene 10 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig.
- 24 timer eller mer etter drift kontrollere posisjonen av barrieren i forhold til den nye kontralaterale lem knopp. Kast alle embryoer der barriere er åpenbart ikke motståite venstre lem knopp. I dette tilfelle barrieren har blitt feilaktig posisjonert.
4. Høsting Embryoet, Fiksering og klargjøring for Wholemount In Situ Hybridisering (WISH)
- Høsting embryoer poste drift.
- Slakte embryoer på scenen 19-23 slik at lem knopp morfologi er godt synlig i både opererte og kontralaterale kontroll sider.
- Bruke buet saks skjære et større hull i eggeskallet. Skjær rundt embryoet ved å holde den store blodåre til venstre for embryoet med microforceps. Bruke dette grepet av beholderen for å fjerne den embryo og plassere den i en petriskål med en fosfatbufret saltoppløsning (PBS) pH 7,3.
- Under en kikkert mikroskop, dissekere bort ekstra embryonale fartøy og membraner ved hjelp av en kombinasjon av buede saks og nei. 5 microforceps. Fjern hodet ved hjelp av saks.
- Slakte embryoer på scenen 19-23 slik at lem knopp morfologi er godt synlig i både opererte og kontralaterale kontroll sider.
- Fiksering av embryoer poste høsting.
- Bruke buet blunT tang, løfte embryo og legg den i 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS ved romtemperatur i to timer rocking og deretter ved 4 ° C over natten i en 20 ml glassflaske med skrukork.
Forsiktig: PFA er en alvorlig fare for helsen. Det er en skadelig, etsende irriterende og pulveret må forhindres fra å komme i kontakt med hud, øyne og lunger. Bruk personlig verneutstyr, og en avtrekkshette mens han forberedte løsningen. Når det er en 4% løsning, hansker, vernebriller og laboratoriefrakk må brukes.
MERK: Det er viktig å få embryoene til fix raskt til beste bevare mRNA integritet.
- Bruke buet blunT tang, løfte embryo og legg den i 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS ved romtemperatur i to timer rocking og deretter ved 4 ° C over natten i en 20 ml glassflaske med skrukork.
- Fjerning av barrierer før wholemount in situ hybridisering.
MERK: Barrierer er fjernet fordi de er skarpe og kan skade fostre som de går gjennom in situ hybridisering protokollen, særlig hvis flere embryoer er farget på en gang.- Etter fiksering, plasser embryo i et fat med PBS under en kikkert microscope.
- Ved hjelp av to par No. 5 microforceps, plasserer den venstre paret tett hver side av barrieren i det opererte side av embryoet. Ta tak i barriere med riktig par og trekk forsiktig barriere fra embryo ved hjelp av venstre paret å holde fosteret ned og for å forhindre vev fester seg til barriere som det er fjernet.
- Utføre WISH hovedsakelig som beskrevet i 11.
- Ta en scene 15 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig. Fjerne det øvre lag av klar tape.
- Ta en scene 13 embryo fra inkubatoren og plassere egg på et egg hvile under en kikkert mikroskop satt til 3.2x forstørrelse eller høyere hvis ønskelig. Fjerne det øvre lag av klar tape.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor beskriver metoder som benyttes i Nishimoto et al. , Studerer 2015. Avisen lem knopp induksjon og innvielse i både forgrunnen og bakben av kylling embryo. Resultater etter innsetting av ugjennomtrengelige barrierer for å hindre utvekst av forbena knoppen har vært publisert tidligere 1, 2, 9, men det har vært bare en studie som beskriver barrierer som hindrer ben knopp innvielse en. Bakben data fra Nishimoto et al. 2015 er presentert her som representative resultatene av studien av mRNA uttrykk følgende barriere innsetting.
Tbx4 uttrykk på LPM er ikke tilstrekkelig til å igang bakben utvekst:
Figurene 2B og C (tabell 2) viser at barrieren innsetting i trinn 15 (figur 2A) (se protokoll 3,2) fører til både Fgf10og Fgf8 uttrykk være fraværende i beinet bud regionen (merket med brakett) på det opererte høyre side. Sammenligne med unoperated venstre side. Imidlertid er Tbx4 ekspresjon observert ved både trinn 19 og trinnet 23 på det opererte side (figur 2D og E). Vi konkluderer med at Tbx4 uttrykk alene er ikke tilstrekkelig til å igang bakben utvekst fra nevnte LPM. Andre studier i dama har antydet at TBX genuttrykk er tilstrekkelig til å initiere forbena knopp formasjon 12, 13.
Figur 2C 'er inkludert for å illustrere hvordan en barriere ser innleiret i benet region av embryoet etterfiksering. I de fleste tilfeller barrierer ble fjernet før in situ hybridisering (protokoll 4.3).
RA fra somites er viktig i LPM før Fgf10 induserer Limb Bud Outgrowth:
Figur 3A er et skjematisk representerer tilsetningen av en RA fuktet vulst distalt til en barriere settes inn ved trinn 15 (protokoll 3.2.1.3). Etter denne operasjonen lem bud utvekst (merket med en stjerne) er observert på det opererte høyre side og Tbx4, Fgf10 og Fgf8 er uttrykt i bud som de er i kontroll venstre side (figur 3B, C og D, tabell 2) . Dermed tillegg av RA til LPM vinner effekten av barriere og lemmer knopp initiering fortsetter. Vi konkluderer med at det i normal utvikling RA fra somites er viktig i LPM før lem knopp utvekst kan initieres. De resulterende bakben knopper er generelt mindre enn de på styresiden. Dette kan være på grunn av RA dose i LPM er ikke ekvivalent med villtype situasjon. Hvis RA dosen er for høy den apikale ectodermal Ridge (AER) kan forkortes og mindre knopper ville resultere14, 15.
For å bekrefte at RA (fra somites) i LPM er nødvendig for normal lem knopp initiering en invers agonist av RAR, BMS 493, ble brukt. Perlene ble implantert inn i benet region LPM ved trinn 15 (se protokoll 3.2.1.4) (figur 3E). Fgf10 uttrykk er nedregulert etter påføring av BMS 493-perler i nevnte LPM, noe som resulterer i mindre bakben på stammen i forhold til styresiden (figur 3F; tabell 3). Kontroll DMSO perler ikke forårsaker disse feilene (Tall 3G og 3H, Tabell 3). De defekter følgende BMS 493-programmet er mildere enn de som fremkalles av en barriere operasjon; dvs. er Fgf10 fortsatt uttrykt og lem knopper dannes. Dette er sannsynligvis å være fordi effektene av BMS 493 er begrenset lokalt rundt kulene og vil kanskje ikke være i stand til å antagonisere alle RA produsert av axial vev.
Tidlig Axial Signaler Angi LPM Celler som Senere Ekspress Tbx4:
Vi testet når LPM får sin evne til å uttrykke Tbx4 i den potensielle beinet dannende regionen. Den tidligste stadiet der en barriere kan settes inn som senere vil blokkere etappe knopp utvekst, er scenen 10. Vi er de første til å utvikle en protokoll for å sette barrierer på etapper tidligere enn scenen 12. Barrierer satt inn mellom paraksialt mesoderm og presumptive etappe LPM i trinn 10 (se protokoll 3,4) blokk ben knopp-dannelse og ekspresjon av Tbx4 i benet dannende LPM (fig 2F og 2G, tabell 2), noe som tyder på at et signal fra aksiale vev ved trinn 10 er nødvendig for senere ekspresjon av Tbx4 i bakben LPM. Sammenlign dette resultatet med figurene 2D og E der senere barriere innsetting tillater Tbx4 uttrykkskal etableres. Videre ble det undersøkt hvorvidt dette aksiale signal kan være RA ved å observere hvorvidt den inverse agonist av RAR reduserer Tbx4 uttrykk. En BMS 493 perle plassert i bakben LPM på scenen 10 (se protokoll 3.4.1.3) nedregulerer Tbx4 uttrykk (Tall 2H og 2i), mens kontroll perler dynket i DMSO ikke påvirker Tbx4 uttrykk (Tall 2J og 2K). Sammen utgjør disse resultatene støtter en modell som en RA signal fra aksiale vev regulerer lem induksjon positivt regulere Tbx4 i bakben LPM 7.
Postoperativ død:
Tabell 1, 2 og 3 gi detaljer om eksperimentelle resultatene inkludert antall kyllingfoster som døde etter operasjon og før høsting. Noen dødsfall er å forvente etter mikro av denne art. Det numrene døende kan holdes til et minimum ved å sørge for at instrumentene er rene, hull i egget er minste størrelsen som kreves, at embryoene er igjen uten beskyttelse av tape segl for minimum tid, og i forbindelse med dette siste punktet at operasjonen utføres så raskt som mulig. Ingen av disse operasjonene er svært tidkrevende, men operasjoner med perler og barrierer ta litt mer tid. Til tross for disse tiltakene, operasjoner utført ved de tidligste stadiene og de i vingen regionen er mer sannsynlig å føre til døden. Det er store blodkar rundt lem dannende regioner og utilsiktet brudd på disse fartøyene kan føre til død på grunn av blodtap. Vi finner at egg åpnet på scenen 8 eller 9, hvis embryoer har ikke blitt operert på, vil ofte dø av neste dag. Derfor er den eneste løsning på disse problemene er å gjennomføre et høyt antall eksperimenter.
d / 54618 / 54618fig2.jpg "/>
Figur 2. Marker genuttrykk Endringer følgende Barrier eller Perlene Insertion på presumptive Leg nivå. (A) Skjematisk viser barriere posisjon (grønn linje) på presumptive etappe nivå (somites 26-32) i en scene 15 embryo. (B - E og G) WISH analyse på operert embryoer. Benet regionen er skissert (parentes). (B) Fgf10 uttrykk er fraværende i det opererte LPM, men robust uttrykk oppdages i venstre knopp. (C) Fgf8 uttrykk er fraværende i det opererte side, tyder det ingen AER. (C) Den samme embryo før barrieren ble fjernet. (D) Tbx4 blir uttrykt i nevnte LPM på samme rostro-kaudal nivå som styrepinne. (E) Tbx4 ekspresjon opprettholdes i det høyre benet regionen til tross for fravær av vekst lem. (F) Skjematisk diagram av en scene 10 kylling embryo viser barriere posisjon (grønn linje) på presumptive etappe nivå. (G) Tbx4 uttrykk er fraværende i det opererte høyre LPM (brakett). (H) Skjematisk diagram av en scene 10 kyllingembryo som viser BMS 493 vulsten stilling (lilla sirkel) ved den presumptive benet nivå. (I) Tbx4 ekspresjon blir nedregulert på det opererte høyre side etter behandling med BMS 493. (J) Skjematisk diagram av en scene 10 kyllingembryo som viser kontroll DMSO vulst stilling (grå sirkel). (K) Tbx4 uttrykkes på det opererte høyre side på et lignende nivå som i kontroll venstre side etter behandling med DMSO alene. Dette tallet har blitt forandret fra 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
d / 54618 / 54618fig3.jpg "/>
Figur 3. RA berger Limb Bud fravær forårsaket av Barrier Innsetting og er viktig i LPM Før Leg Bud utvekst. (A) Skjematisk diagram som viser barriere posisjon (grønn linje) på presumptive etappe nivå (somites 26-32) og en RA-gjennomvåt perle (rød sirkel). (B - D) RA redder etappe bud utvekst (vist med en stjerne). (B) Tbx4 uttrykk er til stede i den reddet benet knoppen ligner på en ikke-operert side. (C) Fgf10 er uttrykt i berget beinet knoppen ligner på en ikke-operert side. (D) Fgf8 er uttrykt i AER av reddet høyre ben knopp. (E) Skjematisk indikerer hvor BMS 493 perler (lilla sirkler) ble plassert i den presumptive etappe LPM av scene 15 embryoer. (F) Fgf10 uttrykket downregulated på det opererte høyre side og beinet bud er liten følgende BMS 493 behandling. Perler er asterisk. (G) I likhet skjematisk til (E), som indikerer posisjonen til kontroll DMSO perler (grå sirkler). (H) DMSO perler (vist med stjerner) påvirket ikke Fgf10 uttrykk eller ben knopp størrelse. Dette tallet har blitt forandret fra 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stage barriere plassert (+ perle) * | antall opererte | Wing mangler ** | Wing stede ** | antall døde |
| Stage 12-14 | 40 | 24 | 1 | 15 |
| Stage 8/9 | 65 | 23 | 0 | 42 |
| Stage 12-13 (FGF4 perle) | 41 | 7 (perle mangler) | 17 | 17 |
| Stage 12-13 (RA perle) | 75 | 9 (perle mangler) | 32 | 34 |
| Stage 13 (kontrollperle) | 5 | 3 | 0 | 2 |
| * 0,7-1 mm folie barrierer plassert mellom somites 15-20 og sideplate mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05 til 0,1 mg / ml RA perle. | ||||
| DMSO kontrollperle. | ||||
| ** Chick embryoer faste trinn 21-23 | ||||
Tabell 1. Wing nivå Barrier og Bead Eksperiment utfall.
| Stage barriere plassert (+ perle) * antall opererte | Leg mangler ** | Leg stede ** | antall døde | |
| Stage 12-15 | 43 | 39 | 0 | 4 |
| Stage 10/11 | 23 | 16 | 0 | 7 |
| Stage 15 (FGF4 perle) | 8 | 0 | 5 | 3 |
| Stage 15 (RA perle) | 18 | 0 | 18 | 0 |
| * 0,7-1,3 mm folie barrierer plassert mellom somites 26-32 og sideplate mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 perle. 0,05 til 0,1 mg / ml RA perle. | ||||
| ** Chick embryoer faste trinn 18-24 | ||||
Tabell 2. Leg nivå Barrier og Bead Eksperiment utfall.
| antall opererte | Leg knopp liten | Leg knopp litt liten | Leg bud normal størrelse | antall døde |
| BMS 493 perler * | ||||
| 15 | 12 | 3 | 0 | 0 |
| DMSO perler ** | ||||
| 12 | 0 | 3 | 9 | 0 |
| * 2-3 perler dyppet i 5 mg / ml BMS 493 plassert i den høyre trinn 14-15 LPM på benet nivå. | ||||
| ** 2-3 perler dynket i DMSO alene anbringes i riktig plattform 15 LPM på benet nivå. | ||||
| Kyllingfoster fastsatt til trinn 17-19. | ||||
Tabell 3. Leg nivå BMS 493 Perlene Eksperiment utfall.
Discussion
Vi beskriver bruk av ugjennomtrengelige barrierer for å hindre lem knopp formasjon i kylling embryo. Denne teknikk har en rekke kritiske trinn. Etter preliminære forsøk har vi funnet at hengformede barrierer som brukes i 9, 10 forblir på plass i embryoet langt bedre enn rette barrierer. Den distale flate siden av barrieren fester seg til vitelline membranen og holder barrieren på plass (figur 2C). Grundige forberedelser av hengslene formet barrierer fra aluminiumsfolie som beskrevet i protokollen steg 1,6 er avgjørende for å lykkes med operasjonen. Et annet viktig skritt er å sikre at eggene ikke er utelatt fra inkubator for lenge etter vindus og iscenesettelse før bruk på fosteret. I vår erfaring, embryoer overleve en operasjon bedre hvis de er på eller i nærheten av rugetemperatur når operasjonen er utført. Operasjoner bør derfor utføres så raskt som mulig, og eggene resealed raskly for å sikre god overlevelse. Mange forskere legge en dråpe av antibiotika til embryoet følgende mikro før retur egg til inkubatoren. Tilstedeværelsen av væsken hindres bommene fra å holde godt på plass. Tilsetting av antibiotika kan også løsne perler etter plassering. Derfor bruker ikke antibiotika, raske drift og god renslighet med instrumenter er anbefalt for å unngå smitte. Tørke instrumenter med 70% etanol etter hver fase av en operasjon er avgjørende for å hindre instrumenter fra å bli klissete fra kontakt med vitelline membran som kan føre til både barrierer eller perler til å følge tang (se protokoll trinn 3.1.2.2). Begge varianter av perler som brukes kan falle ut av plass etter operasjonen. Når barriereposisjonen ble kontrollert den neste dag var det ikke mulig å se gjennom barrieren for å fastslå om vulsten holdt seg på plass eller ikke. I tilfeller der kulen hadde falt ut vingen knopp utvekst ikke ble reddet ( Denne protokollen endrer tidligere publiserte eksperimenter som brukes barrierer for å hindre lem knopp initiering, definerer spesifikke optimale bredder for barrierer og introduserer kombinere barriere og perle emisjon etterfulgt av analyse av genuttrykk. Vi har funnet ved hjelp av konvensjonelle aluminiumfolie, som er billig og lett tilgjengelig i alle laboratorier, frembringer resultater som er lik de som tidligere er brukt tantal folie. Folien kan stå i embryoet ved gjennomføring av in situ hybridisering (figur 2C '), men vi fjerner vanligvis det hvis mer enn en embryo blir behandlet for å hindre at de skarpe kantene på folien å skade embryoer. PIlot studier viste at bredden av benet region barrierer er spesielt viktig. Utgangspunktet barrierene praksis var for kort og ben bud utvekst ble ikke hindret. 1,2-1,3 mm er den optimale bredde for en barriere for å blokkere ben knopp utvekst helt. Den smaleste vinge barrierer som man kan plassere nøyaktig for å hindre knopp utvekst gi de beste overlevelse. Dette kan være så smale som 0,5-0,7 mm. Men barrierer som er litt bredere er mer sannsynlig å resultere i fullstendig blokkering av vingen bud utvekst fordi de gir mulighet for en liten unøyaktighet av emisjonen (vi brukte 0,7-1 mm). Unngåelse av blodkar når du gjør snittet er kritisk for vingen knopp nivå barrierer. Semi-permeable barrierer har tidligere blitt brukt til å halvere dama lem knopp. MacCabe og Parker, 1976 og Summer, 1979 både brukte filtre 0,45 um og 0,8 um porestørrelse, henholdsvis 16, 17. De rapporterte at diffusible signaler kan passere gjennom porene i filtrene, og atResultatene oppnådd ved hjelp av semi-permeable barrierer var midt mellom en lem bud med ingen hindring til stede og en med en ugjennomtrengelig tantal folie barriere. Denne protokollen kan tilpasses for å bruke semipermeable barrierer av varierende porestørrelse for å skille kandidatsignaler basert på størrelse eller for å modifisere dynamikken i signal diffusjon. Denne protokollen har forskjellige begrensninger i hovedsak knyttet til modellorganisme selv. Slike teknikker kan brukes til å undersøke ytterligere spørsmål i lem utvikling og også andre spørsmål av virveldyr embryogenese. En forutsetning er at orgelet / aktuelle området bør utvikle når kylling embryo er tilgjengelig for intervensjon. Tilstedeværelsen av store blodkar i området hvor en barriere må plasseres gjør barriere plassering senere stadium enn 13 eller 14 teknisk utfordrende. Hvis store blodkar er kuttet under barriere plassering kan dette føre til embryo dødelighet. Vår undersøkelse av når transkripsjonsfaktorer TBX5 og Tbx4 først indusert i LPM var begrenset av den tidligste stadiet hvor vi kan plassere en barriere som senere skulle ende opp med motsatt enten vingen eller ben knopp hhv. Det kan være opplysende å forsøke å blokkere TBX genet induksjon på tidligere stadier, nærmere gastrulation. Den tidligste en barriere kan være plassert i den presumptive vingen region med hell var trinn 8 og i benet region trinnet 10. Denne protokollen er sannsynligvis ikke egnet for studier av genekspresjon utover lem knopp trinn fordi påfølgende rask vekst vil forskyve barrieren og resultatene ville forholde seg bare til utgangsstillingen av barrieren. Etter å ha relaterte begrensninger av kylling embryo i denne sammenheng, dets fordeler fremfor andre virveldyr modellorganismer er mange. Den kyllingembryo er en meget egnet dyremodell for denne type av fysisk inngrep i et virveldyr embryo. Embryoene er relativt store og er lett tilgjengelig igjennomgh eggeskallet. Man kan gå tilbake til embryo for videre eksperimentering (for eksempel fjerning av en perle 18 eller enda en barriere) eller for å sjekke fremdriften ved å fjerne tapen vinduet. Det er mulig omfang til å inkludere levende avbildning eller tid lapse imaging. Vi beskriver en metode for vindus kylling egg som er spesielt egnet til å operere på tidlig stadium embryoer. I tilfelle av ekstremitets studier er det svært viktig og nyttig at det er en kontralateral kontroll lem for hvert eksperiment som fungerer som en ideell intern kontroll for hver biologisk replikere. Kombinasjonen av å bruke ugjennomtrengelige barrierer for å hindre lem utvekst og perler dynket i signalmolekyler har ikke blitt rapportert før. Vår analyse av mRNA uttrykket etter slike inngrep er også romanen. Disse teknikkene gjort oss i stand til å dissekere den vanskelige problemet med når lem spesifikke transkripsjonsfaktorer Tbx5 og Tbx4 blir indusert i LPM og ogsåfor å vise at senere, før lem knopp initiering, er tilstedeværelsen av disse TBX gener i LPM ikke er tilstrekkelig for aktivering av Fgf10 transkripsjon og starten av lem knopp utvekst. Figurene 2G, 2D og 2E illustrerer disse funnene også. Fraværet av Tbx4 uttrykket etter innsettingen av en barriere ved trinn 10 på figur 2G er i sterk kontrast til dens tilstedeværelse i 2D og 2E følgende barriere innsetting i trinn 15, etter induksjon av Tbx4. Implantasjon av RA gjennomvåt perler tilrettelagt redning av lem bud initiering følgende barriere innsetting og så peker på RA fra somites være avgjørende i LPM før lem knopp utvekst kan begynne. Slike teknikker kan brukes til å løse flere spørsmål i lem utvikling, men også andre spørsmål av virveldyr embryogenese. Områder i hjernen, øyet og stammen er sannsynlig å være egnet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500 ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
References
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
