Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Draining लिम्फ नोड्स में Murine त्वचा वृक्ष के समान कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के साथ संक्रमण के दौरान एक CFSE आधारित परख Published: October 9, 2016 doi: 10.3791/54620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

Abstract

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) शटल प्रतिजन उनकी हासिल करने की क्षमता और draining लिम्फ नोड (DLN) के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत, भाग में के लिए महत्वपूर्ण हैं। DLN करने के लिए डीसी की लामबंदी जटिल है और पूरी तरह से संक्रमण के दौरान स्पष्ट किया जाना है। यहाँ बताया कि एक अभिनव, सरल परख है कि C57BL में माइकोबैक्टीरियम बोविस Bacille Calmette-Guérin (बीसीजी) के साथ लुटेरा संक्रमण के दौरान डीसी के पलायन को ट्रैक करने के fluorochrome 5 और 6-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) पर निर्भर करता है का उपयोग है / 6 चूहों। इस परख त्वचा डीसी उप आबादी कि सक्रिय रूप से बीसीजी के जवाब में निकासी, घुटने की चक्की एल.एन. के लिए स्थानांतरित के लक्षण वर्णन के लिए सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल एक बीसीजी मॉडल जहां प्रवासी त्वचा डीसी प्रवाह cytometry द्वारा की पहचान की गई से निकलती है। परख अध्ययन और DCS या अन्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मिलनसार है कि घर घुटने की चक्की एल.एन. के लिए रोगाणुओं, उनके चयापचयों या अन्य भड़काऊ का टीका के बादलुटेरा में उत्तेजनाओं, और फलस्वरूप कारक है कि इन कोशिकाओं के प्रवास को विनियमित अध्ययन करने के लिए।

Introduction

शरीर सतहों में स्थानीय डीसी रोगाणुओं या अपने उत्पादों भावना है, और ऐसा करने में निकासी एल.एन. (DLN) 1,2 के लिए लसीका वाहिकाओं के माध्यम से लामबंद। इस स्थानांतरण DLN और हमलावर सूक्ष्म जीव के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के फलस्वरूप भड़काना करने के लिए माइक्रोबियल प्रतिजन के परिवहन के लिए आवश्यक है। दरअसल, नाकाबंदी या डीसी की विफलता के संक्रमित ऊतक से विस्थापित करने के लिए DLN टी सेल प्रतिक्रिया 3-5 म्यूट करता है। तदनुसार, एकल कोशिका के स्तर पर पलायन को ट्रैक करने के लिए डिज़ाइन किया गया assays एक दिया डीसी सबसेट को मानो प्रवासी समारोह में मदद करने के लिए उपयोगी होते हैं।

वहाँ DLN करने के लिए त्वचा डीसी की लामबंदी पर डेटा की एक बड़ी संस्था है। सूजन या संक्रमित साइटों 2 से डीसी प्रवास पर ज्ञान के अधिक के लिए बाद खातों। यह आश्चर्य की बात के बाद से त्वचा डीसी की एक बड़ी आबादी के घरों और प्रयोगशाला माउस में प्रयोग के लिए एक अत्यधिक सुलभ सतह नहीं है। कई तकनीकों इस प्रकार का आकलन करने के लिए विकसित किया गया हैDLN 2 के लिए त्वचा से murine डीसी के पलायन। FITC त्वचा चित्रकला अब तक का सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण से है। इस परख में fluorochrome fluorescein-5-आइसोथियोसाइनेट (FITC) एसीटोन और एक संपर्क अड़चन के साथ एक मिश्रण तैयार किया जाता है। इस कॉकटेल depilated या मुंडा त्वचा के लिए लागू किया जाता है और FITC लेबल कोशिकाओं के संचय DLN में विश्लेषण बारी में है। प्रवासन भी fluorochrome टैग नैनो या microparticles, जो phagocytic कोशिकाओं है कि त्वचा में फ्लोरोसेंट कणों भाँति की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है के साथ त्वचा इंजेक्शन लगाने के द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। लसीका वाहिकाओं को भी सीधे लसीका से पलायन DCs निकालने के लिए cannulated जा सकता है। हालांकि यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से चूहों में। बाद के विश्लेषण के लिए प्राप्त डीसी की संख्या भी एक सीमित कारक है।

त्वचा डीसी प्रवास पर पिछले कई अध्ययनों के बावजूद, वहाँ DLN निम्नलिखित vacci करने के लिए त्वचा डीसी लामबंदी के बारे में जानकारी की कमी बनी हुई हैBacille Calmette-Guérin (बीसीजी), लाइव माइकोबैक्टीरियम बोविस की तनु तनाव के साथ राष्ट्र एम के खिलाफ टीका करने के लिए इस्तेमाल तपेदिक। बीसीजी टीका त्वचा में है, एक सीमित संक्रमण है कि एक टी सहायक सेल प्रकार 1 प्रतिक्रिया से चलाता है के कारण। दोनों डीसी उप आबादी कि बीसीजी संक्रमित त्वचा से DLN को जुटाने और कारक है कि इस प्रक्रिया के दौरान उनके पलायन को विनियमित पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। ऊपर के प्रकाश में, एक सरल लेकिन उपन्यास विधि विकसित किया गया था, जहां fluorochrome 5 और 6-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) DLN 3 में डीसी के पलायन को ट्रैक करने के बगल में इंजेक्ट किया जाता है। C57BL / 6 चूहों बीसीजी का एक inoculum और बलिदान से पहले दिन के साथ हिंद लुटेरा में इंजेक्ट कर रहे हैं, जानवरों CFSE के एक उच्च एकाग्रता के साथ एक ही लुटेरा में इंजेक्ट किया जाता है। चौबीस घंटे बाद जानवरों की बलि दी जाती है और draining घुटने की चक्की एल.एन. (PLN) हटा दिया है और प्रवाह cytometry के लिए तैयार किया। इस परख आईडीई सक्षम बनाता हैकोशिकाओं है कि DLN को लुटेरा त्वचा से रातोंरात पलायन (चित्रा 1) के ntification।

इसके अलावा, जीन-लक्षित चूहों DLN को लामबंद करने के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक कारकों की पहचान में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस परख का उपयोग करना, इस रिपोर्ट के लेखकों में पहले से पाया है कि EpCAM कम CD11b उच्च प्रवासी त्वचा डीसी परिवहन DLN को इंटरल्युकिन -1 रिसेप्टर और intracellular एडाप्टर अणु MyD88 3 द्वारा विनियमित एक प्रक्रिया में बीसीजी। इस CFSE आधारित प्रवास परख जो Bollampalli एट अल। 3, जहां से फ्लो प्रवासी त्वचा डीसी का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था द्वारा उपरोक्त रिपोर्ट से निकलती लिए प्रोटोकॉल, इस के साथ साथ वर्णित है। फायदे और इस परख के नुकसान पर चर्चा कर रहे हैं।

Protocol

नोट: C67BL / 6 चूहों इस पांडुलिपि में दिखाया प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया। इन जानवरों को एमटीसी जानवरों की सुविधा, कारोलिंस्का Institutet, स्टॉकहोम, स्वीडन में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत घर थे। पशु प्रयोगों निर्देशों और कृषि के स्वीडिश बोर्ड, स्वीडिश पशु संरक्षण एजेंसी, और कारोलिंस्का Institutet के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया। प्रयोगों स्टॉकहोम उत्तर पशु आचार परिषद द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. CFSE स्टॉक्स और भंडारण की तैयारी

  1. डाइमिथाइल sulfoxide में 5 और 6-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) के एक 5 मिमी स्टॉक तैयार करें। भंवर। बाँझ में 100 μl aliquots बांटना, 0.5 मिलीग्राम टोपी microtubes पेंच। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।

2. चूहे

  1. उम्र के 8 और 12 सप्ताह के बीच जन्मजात नर हो या मादा चूहों का प्रयोग करें। Sex- और उम्र से मिलान जानवरों पसंद कर रहे हैं। सुनिश्चित करें कि आवश्यक पशु नैतिक परमिट की गिरफ्तारी बनाओजगह में ई प्रयोगों की दीक्षा से पहले।

Isoflurane गैस संज्ञाहरण के साथ पशुओं के 3. स्थिरीकरण

  1. isoflurane के साथ संज्ञाहरण इकाई भार। isoflurane के साथ 10 मिलीलीटर गैस तंग कांच सिरिंज भरें। हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें। सिरिंज और आपूर्ति की ट्यूबिंग के साथ तरल इनलेट कनेक्ट और ढकेलने आगे ले जाने के लिए जब तक जोड़ने वाली ट्यूब में तरल दिख बस के बारे में vaporizer दर्ज है।
    नोट: सिरिंज में जब उपयोग में नहीं isoflurane की दुकान नहीं है।
  2. प्रेरण कक्ष में isoflurane के साथ जानवरों anesthetize, एक airflow के साथ लगभग 400 बनाए रखा - 500 मिलीग्राम / मिनट और 3.5% पर isoflurane की एकाग्रता।
    नोट: इकाई airflow के बिना काम नहीं करेगा।
  3. एक बार जानवरों सो रहे हैं, पानी निकलने की टोंटी संज्ञाहरण इकाई पर मार्ग को isoflurane गैस मास्क टुकड़ा करने के लिए बारी है। जाँच करें कि मुखौटा टुकड़ा गैस के रिसाव से बचने के लिए बरकरार है। वायु प्रवाह 400 मिलीग्राम / मिनट, वैकल्पिक पर रखा जा सकता हैtively 200 मिलीग्राम / मिनट की कमी हुई। 2.6% isoflurane एकाग्रता में कमी।
    नोट: संवेदनाहारी प्रभाव बढ़ाया जा सकता है और / या प्रवाह की दर का समायोजन की कमी हुई।

4. बीसीजी इंजेक्शन और रिकवरी

  1. नेत्रहीन की पुष्टि करें और इंजेक्शन के प्रदर्शन से पहले स्थिर कर रहे हैं / isoflurane मुखौटा टुकड़े पर सो रहा है कि इस तरह के चूहों पता लगाने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा परीक्षण के रूप में परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
  2. एक सिरिंज एक 29 जी एक्स आधा इंच सुई के साथ फिट का उपयोग कर पीबीएस के 30 μl में हिंद लुटेरा में टीका लगाना, माइकोबैक्टीरियम बोविस Bacille Calmette-Guérin (बीसीजी) की 1 एक्स 10 6 कॉलोनी के गठन इकाइयों।
    नोट: माइक्रोबैक्टीरियल शेयरों की पीढ़ी संक्षेप में इस प्रक्रिया 3 के मूल विवरण में वर्णित है, और कहीं और 6 पर्याप्त विस्तार में। बीसीजी भी वाणिज्यिक स्रोतों से आसानी से उपलब्ध है। लेखकों की सिफारिश एक सिरिंज के माध्यम से उस बीसीजी पल्स-sonicated या पारित हो इसकी inoculati करने से पहले गुच्छों को बाधित करने के लिएचूहों में है। बीसीजी यहाँ इस बात को दोहराया के रूप में एक माइक्रोबियल उत्तेजनाओं इस प्रोटोकॉल 3 के मूल विवरण में अपने रोजगार दिया लेकिन निश्चित रूप से अन्य लेखकों माइक्रोबियल उत्तेजनाओं के परीक्षण के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।
  3. एक ही प्रक्रिया पीबीएस के इंजेक्शन नियंत्रण चूहों में लिए ऊपर वर्णित प्रदर्शन करना।
  4. इंजेक्शन के बाद जानवरों की निगरानी है कि वसूली पुष्टि करने के लिए संज्ञाहरण सफल से और जानवरों के लिए खुद को इंजेक्शन, हिंद लुटेरा पर समर्थन कर सकते हैं कि।

5. CFSE इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन के लिए CFSE की तैयारी:
    1. डिग्री सेल्सियस -80 से 5 मिमी CFSE शेयर समाधान की एक शीशी पिघलना। पीबीएस में CFSE 10 गुना पतला। अच्छी तरह से इंजेक्शन के लिए तैयार करने में सिरिंज भरने से पहले समाधान Resuspend।
  2. CFSE इंजेक्शन और वसूली:
    1. हिंद लुटेरा जो पहले बीसीजी या पीबीएस प्राप्त 3. 0.5 मिमी CFSE की सुई 20 μl खंड में पशुओं anesthetizing के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।

6. घुटने की चक्की लिम्फ नोड के सर्जिकल हटाने (PLN)

नोट: निष्फल सर्जिकल उपकरणों और 70% इथेनॉल में उनके दोहराया परिशोधन का उपयोग इस कदम भर में प्रोत्साहित किया जाता है।

  1. चूहों euthanize। 70% इथेनॉल के साथ पशु स्प्रे। पृष्ठीय स्थिति में पशु पिन, एक विच्छेदन बोर्ड पर।
    नोट: लेखक ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से इच्छामृत्यु की सिफारिश कर सकते हैं।
  2. ध्यान हिंद जांघ में एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाते हैं। मांसपेशियों और वसा कैंची और चिमटी का उपयोग कर बेनकाब करने के लिए और फलस्वरूप आबकारी वसा थैली में गहरी स्थित PLN, घुटने के खोखले में साफ।
  3. 0.5 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस को PLN स्थानांतरण, बर्फ पर।

7. PLN से एकल सेल निलंबन की जनरेशन

  1. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से Plac PLN Homogenizeएड एक 6 अच्छी तरह से प्लेट युक्त 5 मिलीलीटर पीबीएस या प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) बफर (पीबीएस युक्त 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), और 1 मिमी सोडियम azide)। छलनी एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के पीछे के अंत का उपयोग कर के माध्यम से Homogenize।
    नोट: सोडियम azide विषैला होता है और सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. पीबीएस या FACS बफर का एक और 5 मिलीलीटर के साथ झरनी धोने, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सामग्री इकट्ठा करने और 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 277 XG (1,200 आरपीएम, आर = 172 मिमी) पर गोली कोशिकाओं। वैकल्पिक रूप से, pLNs polypropylene homogenizers का उपयोग कर microcentrifuge ट्यूब में सीधे homogenize।
  3. 1,000 μl - गोली आकार के आधार पर, 200 पीबीएस या FACS बफर, जैसे की एक उचित मात्रा में PLN निलंबन resuspend। प्रत्येक एल.एन. निलंबन से प्राप्त कुल सेल नंबर यों तो एक गिनती चैम्बर का प्रयोग करें। मृत / मर कोशिकाओं को बाहर करने के trypan नीले रंग का प्रयोग करें।

8. सेल धुंधला और से फ्लो

  1. transfer 1 - 10 x 10 5 करने के लिए 6 कोशिकाओं मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूबों। 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 277 XG (1,200 आरपीएम, आर = 172 मिमी) पर centrifugation द्वारा FACS बफर, और गोली के साथ धोएं।
  2. (Unspecific एफसी की मध्यस्थता को ब्लॉक करने के लिए 1 विरोधी माउस CD16 / CD32 के माइक्रोग्राम - सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 50 में गोली resuspend - एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μl (देखें वृक्ष के समान सेल [डीसी] मार्कर सतह धुंधला के लिए इस्तेमाल सामग्री तालिका) 0.5 युक्त बातचीत) 30 के लिए FACS बफर में - 45 मिनट, बर्फ पर। प्रकाश से नमूनों को सुरक्षित रखें।
  3. ऊष्मायन के बाद, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 277 XG (1,200 आरपीएम, आर = 172 मिमी) पर centrifugation द्वारा FACS बफर और गोली के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  4. FACS बफर के 100 μl - 50 में कोशिकाओं Resuspend। 7-10 कोशिकामापी एक प्रवाह पर डेटा मोल।
    नोट: के लिए प्रवाह पर उत्कृष्ट समीक्षा cytometry हम निम्नलिखित प्रकाशनों कि इस पद्धति पर सैद्धांतिक और व्यावहारिक दोनों जानकारी रिले के लिए पाठक को देखें।

Representative Results

CFSE आधारित प्रवास परख (चित्रा 1) से फ्लो के साथ एक साथ इस्तेमाल किया गया था का पता लगाने और CFSE लेबल कोशिकाओं है कि PLN बीसीजी के बाद लुटेरा में संक्रमण में दिखाई देते हैं विशेषताएँ। PLN में CFSE लेबलिंग का एक बड़ा भाग MHC-द्वितीय उच्च और CD11c + / कम कोशिकाओं (चित्रा 2A), त्वचा DCs कि त्वचा DLN 11 के लिए चले गए हैं के साथ सुसंगत पर पाया जाता है। दोनों आवृत्ति और CFSE लेबल, MHC-द्वितीय उच्च CD11c की कुल संख्या + / कम कोशिकाओं पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण (चित्रा 2 बी-सी) की तुलना में बीसीजी संक्रमित चूहों से pLNs में बढ़ रहे हैं, सुझाव है कि बीसीजी इन के स्थानांतरण को बढ़ाता है DLN करने के लिए कोशिकाओं। एक 24 घंटे की अवधि के दौरान इस परख उपायों प्रवास के बाद से, यह है कि त्वचा डीसी अभी भी संक्रमण DLN 5 दिनों के बाद (चित्रा -2) प्रवेश कर रहे हैं स्थापित करने के लिए संभव था। यह अच्छी तरह से प्रारंभिक activati ​​के लिए समय से परे मौजूदा मॉडल में डीसी प्रवास फैलीPLN 3 में विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4+ टी कोशिकाओं की पर। इसके अलावा, प्रवासी त्वचा डीसी सह उत्तेजक अणुओं CD80 और CD86 (चित्रा 2 डी) का ऊंचा स्तर व्यक्त करते हैं। यह त्वचा explant संस्कृतियों और FITC त्वचा 11 पेंटिंग, अवधारणा है कि प्रवासी डीसी सक्रिय कोशिकाओं रहे समर्थन से पिछले टिप्पणियों के अनुरूप है। महत्वपूर्ण बात है, दोनों एल.एन. निवासी DCS (MHC-II + CD11c उच्च कोशिकाओं) और plasmacytoid DCS (MHC-द्वितीय कम CD11c कम PDCA -1 + कोशिकाओं) है, जो उच्च endothelial venules के माध्यम से सूजन LNS दर्ज करें और न अभिवाही lymphatics 12, जहां नकारात्मक के लिए CFSE (चित्रा 2EF), वास्तव में सुझाव है कि CFSE लेबलिंग मुख्य रूप लुटेरा में हुई।

यह देखते हुए कि MHC-द्वितीय उच्च CD11c + / कम कोशिकाओं से एक लेकिन कई डीसी उप आबादी 13, अतिरिक्त सतह मार्कर CD103, EpCAM (सी नहीं प्रतिनिधित्वD326) और CD11b एंटीबॉडी धुंधला प्रवाह cytometric का पता लगाने (सामग्री तालिका) के लिए इस्तेमाल आगे प्रवासी DCS (चित्रा 3) की आबादी को चिह्नित करने के पैनल में शामिल थे। ऐसा करने में, EpCAM कम CD11b उच्च कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या बीसीजी संक्रमण (चित्रा 3) के जवाब में मुख्य प्रवासी त्वचा डीसी सबसेट के रूप में पहचान की थी।

प्रवाह cytometric यहाँ दिखाया गया डेटा एक प्रवाह पर अधिग्रहण कर लिया था कोशिकामापी 4 लेजर (488, 532, 640 और 405 एनएम) के साथ सुसज्जित है। डेटा सेल विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था। एक सामग्री तालिका में निर्दिष्ट के अलावा अन्य बहु रंग प्रवाह cytometers मार्कर के ऊपर अध्ययन में उल्लेख के सफल पता लगाने, या अन्य मार्कर का पता लगाने, उस बात के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए नियोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल यहाँ बताया लिए, 6 अलग fluorochromes का पता लगाने के एक कोशिकामापी सक्षम nece हैssary। महत्वपूर्ण बात है, का इस्तेमाल किया प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए क्लोन निर्दिष्ट कर रहे हैं (सामग्री तालिका)। fluorochrome साधना के विकल्प के रूप में इस लेजर और उपलब्ध प्रवाह पर पता लगाने चैनलों पर निर्भर हो सकता है पर विचार करने की जरूरत है। इसी तरह, एंटीबॉडी धुंधला के लिए सबसे उपयुक्त dilutions निर्धारित करने के लिए titrated किए जाने की जरूरत है।

BCG- और पीबीएस इंजेक्शन के नमूने में जनसंख्या आवृत्तियों का रेखांकन और कुल सेल की गिनती के साथ एक साथ इस्तेमाल परिभाषित, डीसी के gated कैंपेन्स के निरपेक्ष संख्या की गणना करने के लिए कर रहे थे। डेटा समूह साधन में मतभेद के महत्व पी <0.05 की एक कट ऑफ के साथ, छात्र 'सेंट परीक्षण या एनोवा जहां उचित द्वारा विश्लेषण किया गया था। Outliers outliers के लिए Grubbs के परीक्षण के बाद विश्लेषण से बाहर रखा गया था।

आकृति 1
चित्रा 1. रूपरेखा: बीसीजी लुटेरा संक्रमणमॉडल और CFSE-आधारित प्रवास परख। बीसीजी C57BL / 6 चूहों की हिंद लुटेरा में टीका है। संक्रमण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं, और बलिदान से पहले 24 घंटे में, fluorochrome CFSE ही लुटेरा है कि पहले बीसीजी प्राप्त में इंजेक्ट किया जाता है। निकासी, घुटने की चक्की लिम्फ नोड अलग है और CFSE लेबल प्रवाह की विशेषता कोशिकाओं cytometry। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रवासी त्वचा DCS एक प्रमुख जनसंख्या DLN बीसीजी लुटेरा के बाद संक्रमण के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। C57BL / 6 चूहों लुटेरा में बीसीजी के 1 एक्स 10 6 CFUs से संक्रमित थे। बलिदान से पहले चौबीस घंटे, जानवरों को एक ही लुटेरा में 0.5 मिमी CFSE के साथ इंजेक्शन थे। घुटने की चक्की LNS, काटा गया homogenizedएकल कक्ष निलंबन में और प्रवाह cytometry के अधीन है। बीसीजी के बाद 1 दिन बना दिया माप के लिए, CFSE बीसीजी के बाद 2hr इंजेक्ट किया गया था। (ए और बी) ज़ेबरा PLN 3 दिन के संक्रमण के बाद बीसीजी-draining में MHCII उच्च और CD11c + / कम कोशिकाओं पर CFSE के प्रमुख अभिव्यक्ति दिखा भूखंडों। BCG- और पीबीएस इंजेक्शन चूहों से PLN में (सी) आवृत्ति और CFSE लेबल MHCII उच्च CD11c की कुल संख्या + / कम कोशिकाओं अलग समय बिंदुओं पर रेखांकन किया गया। (डी) मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) CD80 और CD86 के लिए CFSE + और CFSE neg MHC-द्वितीय उच्च CD11c PLN में + / कम त्वचा डीसी 3 दिन बीसीजी के संक्रमण के बाद पर निर्धारित किया गया था। (ई) त्वचा डीसी के भीतर CFSE अभिव्यक्ति (MHC-द्वितीय उच्च CD11c + / कम), एल.एन. निवासी DCS (MHC-II + CD11c उच्च) और (एफ) plasmacytoid DCS (MHC-द्वितीय कम CD11c कम PDCA -1 +)3 दिन बीसीजी के बाद से फ्लो द्वारा निर्धारित किया गया था। एक प्रयोग के लिए, कम से कम 5 चूहों और 3 बीसीजी संक्रमित समूहों के लिए इस्तेमाल किया गया पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण के लिए। सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि संकेत मिलता है। E1005206 3: प्रत्येक सबसेट के भीतर CFSE लेबल कोशिकाओं की कुल संख्या, PLoS Pathog 2015, 11 Bollampalli एट अल में दिया जाता है।। * बीसीजी-संक्रमित और पीबीएस नियंत्रण के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को दर्शाता है। दो स्वतंत्र दिखाए गए प्रयोगों में से एक। Bollampalli से अनुकूलित चित्रा एट अल, PLoS Pathog 2015, 11:।।। E1005206 3, प्रकाशक से अनुमति के साथ कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. EpCAM कम CD11b उच्च डीसी मुख्य त्वचा डीसी सबसेट लेन हैंDLN बीसीजी लुटेरा के बाद संक्रमण के लिए आईएनजी। C57BL / 6 चूहों चित्रा 2 के रूप में बीसीजी और CFSE के साथ इंजेक्शन थे। (ए) ज़ेबरा भूखंडों रणनीति कार्यरत (शीर्ष पैनल) और प्रत्येक के भीतर CFSE + कोशिकाओं की आवृत्ति gating दिखा रहा है, अलग से परिभाषित सबसेट बीसीजी संक्रमण (नीचे पैनल) के बाद समय अंक। प्रत्येक सबसेट के भीतर आवृत्तियों के संक्रमण के बाद समय बिंदु के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। बीसीजी के 3 दिनों के बाद एक सभी एल.एन. कोशिकाओं के बीच लगभग 0.2% MHC-द्वितीय उच्च CD11c + / कम कोशिकाओं पाने की उम्मीद कर सकते हैं। इनमें से लगभग 6% CD103 + कोशिकाओं रहे हैं। सबसेट MHC-द्वितीय उच्च CD103 नकारात्मक गेट के भीतर पाया के लिए, एक लगभग 42% CD11b उच्च EpCAM कम कोशिकाओं, 27% CD11b कम EpCAM कम कोशिकाओं और 7% साख पत्र प्राप्त कर सकते हैं। (बी) प्रत्येक के भीतर CFSE + कोशिकाओं, बीसीजी के संक्रमण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर परिभाषित सबसेट की कुल संख्या दिखाया गया है। प्रत्येक experime के लिएNT, कम से कम 5 चूहों बीसीजी संक्रमित समूहों और पीबीएस नियंत्रण के लिए 3 के लिए इस्तेमाल किया गया। सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि संकेत मिलता है। * सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेद पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण करने के लिए रिश्तेदार को दर्शाता है। तीन स्वतंत्र दिखाए गए प्रयोगों में से एक। चित्रा फिर से मुद्रित Bollampalli एट अल से, PLoS Pathog 2015, 11:।। E1005206 3, प्रकाशक से अनुमति के साथ कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

noDCs विशेष प्रतिजन कोशिकाओं पेश कि माइक्रोबियल प्रतिजन प्राप्त करने और lymphatics के माध्यम से DLN की ओर पलायन करने से शरीर सतहों पर माइक्रोबियल चुनौती का जवाब कर सकते हैं। वहाँ, डीसी एक तरह से है कि प्राथमिक टी-सेल प्रतिक्रिया ड्राइव में टी कोशिकाओं को यह प्रतिजन प्रस्तुत करते हैं। DLN के लिए ऊतक से डीसी प्रवास की प्रक्रिया को समझने के लिए कैसे एक उत्पादक टी सेल प्रतिक्रिया के लिए शुरू की है इसलिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है। डीसी प्रवास को मापने के लिए तरीके फलस्वरूप उपरोक्त खुलासा करने में बहुत उपयोगी होते हैं।

एक माउस मॉडल बीसीजी, एक जीवित टीका है कि त्वचा में चिकित्सकीय इंजेक्ट किया जाता है साथ संक्रमण के बाद DLN करने के लिए त्वचा डीसी प्रवास का अध्ययन करने के लिए नियुक्त किया गया था। लाइन में, बीसीजी टीकाकरण के इस त्वचीय मार्ग नकल करने के लिए हिंद लुटेरा में इंजेक्ट किया जाता है। एक साधारण परख विकसित किया गया था और इसके परिणामस्वरूप निकासी PLN को लुटेरा त्वचा में बीसीजी टीका साइट से त्वचा डीसी उप आबादी के पलायन की जांच करने के लिए इस मॉडल को शामिल किया। इस प्रोटोकॉल धर्मएक ही लुटेरा है कि पहले बीसीजी प्राप्त में fluorochrome CFSE इंजेक्शन लगाने और फिर बाद में draining PLN 24 घंटा अलग-थलग प्रवाह cytometry द्वारा CFSE लेबल कोशिकाओं की उपस्थिति का विश्लेषण करने पर es। हालांकि प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं, तो इस सेटअप से LNS भी इस तरह के एल.एन. 3 में प्रवासी कोशिकाओं की स्थिति के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता, प्रवास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। इसके अलावा, बीसीजी ट्रिगर त्वचा डीसी प्रवास पर इसी तरह के परिणाम दोनों बीसीजी पाश्चर 1173P2 3 और बीसीजी एसएसआई 1331 14 का उपयोग कर प्राप्त किया गया है।

CFSE आमतौर पर इन विट्रो में कोशिकाओं लेबल और सेल स्थानान्तरण के बाद 15 विवो में इस तरह के लेबल की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल हालांकि, यह सीधे बगल में त्वचा कोशिकाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। CFSE लेबलिंग के आणविक आधार FITC, जो भी एक एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंजक है के समान है। CFSE हालांकि विकार के लिए FITC भर में पसंद किया जाता है क्योंकि यह रचनात्मकAtes बहुत स्थिर carboxamide बांड 16। इसके अलावा, CFSE अत्यधिक झिल्ली पारगम्य है और निष्क्रिय कोशिकाओं में diffuses। एक बार अंदर, यह intracellular अमाइन (फ्लोरोसेंट) conjugates कि लेबल सेल 15 में रखा जाता है रूपों।

CFSE आधारित प्रवास लेखकों द्वारा विकसित परख बीसीजी के जवाब में एक 24 घंटे की अवधि के भीतर त्वचा से DLN को स्थानांतरित करने कोशिकाओं की पहचान में सक्षम बनाता है। इस प्रकार यह एक निर्धारित समय सीमा के दौरान तीव्र पलायन के उपाय और एक अलग करने की क्षमता की जांच करने की अनुमति देता है, इंजेक्शन उत्तेजनाओं प्रवास को गति प्रदान करने के लिए। इस परख FITC त्वचा पेंटिंग की शास्त्रीय तकनीक है, जो एक संपर्क संवेदनशील एजेंट की त्वचीय, सामयिक आवेदन से शुरू हो रहा एक संचयी पलायन घटना उपायों से अलग है। इस प्रकार, CFSE आधारित प्रवास परख प्रवासी त्वचा डीसी या अन्य कोशिकाओं है कि एफ में रोगाणुओं, माइक्रोबियल उत्पादों या अन्य भड़काऊ उत्तेजनाओं के इंजेक्शन के बाद PLN के लिए घर की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकताootpad। दरअसल, दोनों न्यूट्रोफिल और γ: δ टी कोशिकाओं बीसीजी 17,18 के जवाब में DLN को त्वचा से स्थानांतरित करने के लिए दिखाया गया है। वास्तव में, परख हाल ही में पता चलता है कि एक आंत स्थानीय निमेटोड संक्रमण DLN से 14 बीसीजी ट्रिगर त्वचा डीसी प्रवास मूक सकता है एक सह-संक्रमण की स्थापना में इस्तेमाल किया गया था।

डीसी प्रवास अक्सर के बाद से FITC लेबल 24 से 72 FITC त्वचा पेंटिंग में मानव संसाधन के बीच मूल्यांकन किया है DCs 19 चित्रकला के बाद 4 से 5 दिनों का पता लगाने के लिए मुश्किल हैं। लेबल DCs पर CFSE संकेत के नुकसान यहाँ प्रस्तुत परख में एक मुद्दे के बाद से पलायन का विश्लेषण 24 घंटा के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया था नहीं है, पीछे यह जा रहा है कि लेखकों को विशेष रूप से अध्ययन करना चाहता था "रात" प्रवास घटनाओं कारण। इस परख में रुचि रखते हैं दूसरों हालांकि CFSE आधारित ट्रैकिंग के लिए पहले या बाद में भी समय बिंदुओं की जांच करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। इसके अलावा, के बाद से CFSE इंजेक्शन द्वारा शुरू की है यह किसी भी निर्धारित समय पर दिया जा सकता है। यह लचीलापन एक की अनुमति दीuthors दिन 5 और 6 बीसीजी संक्रमण (चित्रा -2) 3 के बाद के बीच डीसी प्रवास का आकलन करने के लिए। इंजेक्शन CFSE संभावित प्रकार की कोशिकाओं लेबलिंग प्रतिक्रिया करने के लिए बगल में सुलभ सीमा सकता है। उदाहरण के Langerhans कोशिकाओं (एलसी), जो DCs है कि त्वचा के ऊपर परत में रहते हैं के लिए, एपिडर्मिस, खराब CFSE आधारित प्रवास परख में बीसीजी के जवाब में (चित्रा 3) 3 पलायन। हालांकि, FITC त्वचा चित्रकला, डर्मिस में तैनात डीसी के दौरान, एपिडर्मिस परत के नीचे, आसानी से लेबल और तेजी से साख पत्र 20,21 से DLN की ओर पलायन कर रहे हैं। यह पता चलता है कोशिकाओं fluorochrome लेबल बनने के लिए जरूरी है त्वचा जहां लेबलिंग समाधान लागू किया जाता है की परत करने के लिए स्थानीय स्तर पर प्रसिद्धि की जरूरत के बिना सकते हैं।

बीसीजी के संक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में, माउस कान टीका के एक सदाशयी अंतर्त्वचीय मार्ग है कि एक तपेदिक वैक्सीन के रूप में बीसीजी के नैदानिक प्रशासन के साथ लाइन में और अधिक प्रदान करता है। एफओदूसरी तरफ Otpad इंजेक्शन, संभावना अंतर्त्वचीय और चमड़े के नीचे मार्गों का एक संयोजन है। उस ने कहा, यह कौशल और प्रशिक्षण की आवश्यकता को सही ढंग से और reproducibly, डर्मिस 22 को बीसीजी देने के लिए इतनी नैदानिक व्यवहार में यह हमेशा सच अंतर्त्वचीय नहीं दी जा सकती है बल्कि चमड़े के नीचे या दोनों के संयोजन। एक टीका साइट के रूप में लुटेरा कान कि उल्लेख मेरिट पर दो बहुत ही स्पष्ट लाभ होता है। सबसे पहले, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निकासी PLN एक लुटेरा इंजेक्शन के बाद के लिए केंद्रित है और इस प्रतिक्रियाओं की परीक्षा की सुविधा। इस रिपोर्ट के लेखकों में पाया PLN लुटेरा 3 draining पहली और मुख्य एल.एन. होने के लिए। दूसरों के इवान नीले 23 के इंजेक्शन के बाद घुटने की चक्की और subiliac LNS के बीच विभाजन जल निकासी का सुझाव दिया है। फिर भी, कान के संबंध में, वहाँ एक से अधिक कान DLN चूहों में है और इन नियमित रूप से उपस्थित या 24 का पता लगाने के लिए आसान नहीं हो सकता है। उत्तरार्द्ध स्पष्ट रूप से एक LIAB का परिचयDLN में प्रतिक्रियाओं की जांच करने की मांग की पढ़ाई में बड़प्पन। (- 50 μl 10) कान की तुलना में दूसरा, बड़ी मात्रा लुटेरा में टीका जा सकता है। यह बदले में दोनों लसीका प्रवाह में प्रमुख परिवर्तन शुरू करने और बहुत छोटे इंजेक्शन की मात्रा, जो अपने आप में एक मुद्दा है, जब यह माइक्रोबैक्टीरिया की एक बड़ी मात्रा inoculating के लिए आता है के साथ काम करने के लिए होने के दायित्व को कम करता है। कान जहां इंजेक्शन की मात्रा छोटे (1-10 μl) होना है, यहां तक ​​कि 5 μl लसीका प्रवाह को बदलने और संभवतः एक अनियंत्रित ढंग से सीधे DLN में इंजेक्शन सामग्री की एक बड़ी राशि के लिए मजबूर कर सकता है। यह इंजेक्शन की मात्रा के लिए खाते में करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। इस एल.एन. के लिए बैक्टीरिया को ढोने वाली में कोशिकाओं के योगदान को संबोधित कर रहे प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। बीसीजी लुटेरा मॉडल में, कुछ बीसीजी सेलुलर परिवहन के अभाव में DLN तक पहुँच हो सकती। इस अवलोकन है कि एक अभी भी बीसीजी चूहों के DLN में जहां सेल प्रवास पैर से पता लगा सकते हैं पर आधारित हैपैड पूरी तरह से काली खांसी विष 3 के स्थानीय इंजेक्शन द्वारा ablated गया था। क्या यह एक संकेत है कि बीसीजी सीधे lymphatics पहुँच सकते हैं और वास्तव में एक सेल मुक्त ढंग से DLN तक पहुंच सकता है निर्धारित किया जा करने के बाद से यह शामिल नहीं किया जा सकता है कि इस मामले में जहां इंजेक्शन की मात्रा के बल द्वारा lymphatics तक पहुँच दी में माइक्रोबैक्टीरिया।

कान या लुटेरा में टीकाकरण के लिए एक व्यावहारिक विचार है कि पशुओं को पर्याप्त रूप से स्थिर किया जा करने के लिए की है इंजेक्शन सही ढंग से और एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से किया जा रहा है। Isoflurane गैस लुटेरा इंजेक्शन के लिए तैयार करने में जानवरों को नियंत्रित करने के लिए एक विधि के रूप में मौजूदा प्रोटोकॉल में वर्णित है। Isoflurane की मध्यस्थता संज्ञाहरण के लिए अपेक्षाकृत तेजी से प्रेरण और वसूली बार यह एक लोकप्रिय तरीका बना है, लेकिन अन्य संवेदनाहारी एजेंट के समान है, यह शरीर क्रिया विज्ञान, जो प्रयोगात्मक परिणाम 25 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं प्रभावित करता है। दरअसल, दोनों अस्थिर और इंजेक्शन anesthetics खत्म करके लसीका प्रवाह में कमीस्वैच्छिक मांसपेशी आंदोलनों, मांसपेशियों टोन को कम करने, और lymphangion संकुचन 26 कम। इसके अलावा, डीसी के DLN के लिए प्रवास में 5 गुना कमी adoptively लुटेरा में स्थानांतरित anesthetized जानवरों 27 में सूचना दी गई है। उपरोक्त को देखते हुए, और संज्ञाहरण से पहले हैंडलिंग प्रक्रियाओं के बाद इंजेक्शन ही है, जो प्रशासन के लिए दोनों तेजी से और एक कदम वसूली की आवश्यकता नहीं है की तुलना में पशुओं के लिए और अधिक तनाव पैदा होने की संभावना हैं, संभावना पर्याप्त रूप से anesthetics बिना जानवर को नियंत्रित करने के लिए करना चाहिए विचार किया जाए। एक माउस restrainer लुटेरा इंजेक्शन, जहां जानवर तेजी से 30 से 40 सेकंड के भीतर एक स्थिर स्थिति के लिए लाया जा सकता है और टीका लुटेरा में लिए अनुकूलित प्रक्रिया में अपनी शरीर क्रिया विज्ञान के अन्य पहलुओं को बदलने के बिना हिंद लुटेरा में माउस इंजेक्षन करने के लिए आदर्श होगा और lymphatics के माध्यम से सेल प्रवास को संबोधित अध्ययन में अत्यंत उपयोगी होगा।

अंत में, इस रिपोर्टDLN करने के लिए उनकी लामबंदी के दौरान त्वचा डीसी नजर रखने वाले एक परख है कि एक निर्धारित 24 घंटे की खिड़की के दौरान पलायन मॉनिटर का उपयोग कर के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला गया। इस CFSE आधारित प्रवास परख प्रवाह cytometry, के रूप में यहाँ विस्तृत है, साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 से पता लगाने और प्रवासी कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है। यह इंजेक्शन उत्तेजनाओं की एक किस्म है और उनके डीसी प्रवास को गति प्रदान करने की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक लचीला मंच प्रदान करता है, और महत्वपूर्ण बात, न केवल DCs बल्कि अन्य आबादी विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग दौरान DLN को त्वचा से चलती ट्रैक करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Baxter 1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
(CFSE)		 Invitrogen C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG) strain Pasteur, in house
Trypan blue solution Sigma T8154
EDTA In house
Sodium azide Sigma S2002
PBS In house
Filtered water In house
BD Plastipak 3 ml syringe BD Medical Surgical Systems 309658 alternative: 5 ml syringe 
6 well plates TPP 92006
15 ml centrifuge tubes TPP 91015 Polypropylene
5 ml round bottom tubes BD Falcon 3272948 Polystyrene
Univentor 400 anesthesia unit Univentor 8323001
Monojet 3/10 ml syringe Medicarrier 8881511144 29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit TPP 99500 PES membrane 
EPPI-Pistill homogenizer Schuett biotech 3.200 512 Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B01145
Bürker counting chamber VWR 631-0920
0.5 ml screw cap microtube  Sarstedt 72.730 Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube VWR 700-5239 Polypropylene
70 micron cell strainers VWR 734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software BD Biosciences Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software Tree Star
Antibody Clone Company 
MHC-II I-A/I-E  M5/114.15.2 BD Biosciences
CD11b M1/70 BD Biosciences
CD11c HL3 BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block) 2.4G2 BD Biosciences
CD326/EpCAM G8.8 Biolegend
CD103 2E7 Biolegend
CD80 16-10A1 Biolegend
CD86 GL-1 Biolegend

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
  2. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  3. Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
  4. Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
  5. Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
  6. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
  7. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
  8. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
  9. Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
  10. Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
  11. Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
  12. Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
  13. Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
  14. Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
  15. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
  16. Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
  17. Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
  18. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
  19. Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
  20. Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
  21. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
  22. Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
  23. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
  24. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
  25. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
  26. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
  27. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).

Tags

संक्रमण अंक 116 वृक्ष के समान कोशिकाओं CFSE लेबलिंग प्रवास लिम्फ नोड बीसीजी माउस त्वचा
Draining लिम्फ नोड्स में Murine त्वचा वृक्ष के समान कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के साथ संक्रमण के दौरान एक CFSE आधारित परख<em&gt; माइकोबैक्टीरियम बोविस</em&gt; Bacille Calmette-Guérin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bollampalli, V. P., Nylén, S.,… More

Bollampalli, V. P., Nylén, S., Rothfuchs, A. G. A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (116), e54620, doi:10.3791/54620 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter