Abstract
Dendritiska celler (DC) är viktiga för att initiera immunsvar, bland annat genom sin förmåga att förvärva och pendel antigen till dränerande lymfkörteln (DLN). Mobiliseringen av DC till DLN är komplex och återstår att helt klarlagd under infektion. Häri beskrivs är användningen av en innovativ, enkel analys som bygger på fluorokromen 5- och 6-karboxifluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) att spåra migration av DC under trampdynan infektion med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) i C57BL / 6-möss. Denna analys gör det möjligt karakterisering av huden DC delpopulationer som aktivt flyttar till dränering, Poplietallymfknutor LN som svar på BCG. Detta protokoll kommer från en BCG modell där flyttande hud DC: er identifierades genom flödescytometri. Analysen är älskvärd till studiet och identifiering av DC: er eller andra celler som hem till Poplietallymfknutor LN efter inokulering av mikrober, deras metaboliter eller andra inflammatoriskastimuli i fotsulan, och följaktligen för att studera faktorer som reglerar migrationen av dessa celler.
Introduction
DCs lokaliserade i kroppsytor känner mikrober eller deras produkter, och på så sätt mobilisera via lymfkärl till dränerings LN (DLN) 1,2. Denna omlokalisering behövs för transport av mikrobiell antigen till DLN och den därav följande grundning av immunsvar mot den invaderande mikroben. Faktum är att blockad av eller fel på DCs migrera från den infekterade vävnaden till DLN dämpar T-cellsvaret 3-5. Följaktligen analyser utformade för att spåra migration vid enkelcellnivån är användbara för att hjälpa skriver migratory funktion till en given DC delmängd.
Det finns en stor mängd data om utnyttjande av huden DC till DLN. De senare står för en stor del av kunskapen om DC migration från inflammerade eller infekterade webbplatser 2. Detta är inte förvånande eftersom huden finns en stor population av DCs och är en mycket tillgänglig yta för experiment i laboratoriet musen. Flera tekniker har därför utvecklats för att bedömamigration av murina DC: er från huden till DLN 2. FITC hud målning är den i särklass vanligaste tillvägagångssättet. I denna analys fluorokromen fluorescein-5-isotiocyanat (FITC) framställes i en blandning med aceton och en kontaktirriterande. Denna cocktail appliceras på avhårade eller rakad hud och ackumuleringen av FITC-märkta celler i sin tur analyseras i DLN. Migration kan också studeras genom att injicera huden med fluorokrom-taggade nano- eller mikropartiklar, som möjliggör spårning av fagocytiska celler som har internaliserat det fluorescerande partiklar i huden. Lymfkärl kan också kanyl för att direkt extrahera migrerar DC från lymfan. Detta är dock tekniskt utmanande, särskilt i möss. Antalet DCs erhållna för efterföljande analys är också en begränsande faktor.
Trots många tidigare studier på hud DC migrering, kvarstår en bristen på information avseende hud DC mobilisering för att DLN efter vaccineringnation med Bacille Calmette-Guerin (BCG), den levande, försvagade stam av Mycobacterium bovis användas för att vaccinera mot M. tuberkulos. BCG inokuleras i huden, vilket orsakar en begränsad infektion som utlöser en T-hjälpar-celltypen en respons. Både DC delpopulationer som mobiliserar till DLN från BCG-infekterad hud och de faktorer som reglerar deras migration under denna process inte är helt klarlagda. I ljuset av det ovanstående drogs en enkel men ny metod utvecklats där fluorokromen 5- och 6-karboxifluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiceras in situ för att spåra migration av DC: er in i DLN 3. C57BL / 6-möss injiceras i den bakre trampdynan med en ymp av BCG och dagen före avlivning, injiceras försöksdjuren i samma trampdyna med en hög koncentration av CFSE. Tjugofyra timmar senare avlivas djuren och tömnings Poplietallymfknutor LN (PLN) avlägsnades och preparerades för flödescytometri. Denna analys gör det möjligt för identification av celler som migrerar över natten från trampdynan huden till DLN (Figur 1).
Vidare kan gen-riktade möss användas för att identifiera faktorer som krävs för celler att mobilisera till DLN. Med hjälp av denna analys, har författarna till denna rapport tidigare funnit att EpCAM låg CD11b hög migrations hud DC transport BCG till DLN i en process som regleras av interleukin-1-receptor och intracellulära adaptormolekyl MyD88 3. Protokollet för denna CFSE baserad migration assay som härrör från ovanstående rapport från Bollampalli et al. 3 där flödescytometri användes för att detektera och analysera flytt hud DC, beskrivs häri. Fördelarna och nackdelarna med denna analys diskuteras.
Protocol
OBS: C67BL / 6-möss användes för experimenten som visas i detta manuskript. Dessa djur var huset under specifika patogenfria förhållanden vid MTC djuranläggningen, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. Djurförsök utfördes enligt de direktiv och riktlinjer för den svenska Jordbruksverket, Svenska Djurskyddsmyndigheten, och Karolinska Institutet. Experiment har godkänts av Stockholm Nord Animal Etikrådet.
1. Beredning av CFSE Stocks och lagring
- Förbered en 5 mM lager av 5- och 6-karboxifluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) i dimetylsulfoxid. Virvel. Dispensera 100 | il alikvoter i sterila, 0,5 ml med skruvlock mikrorör. Lagra alikvoter vid -80 ° C.
2. Möss
- Använd inavlade manliga eller kvinnliga möss mellan 8 och 12 veckors ålder. Sex- och åldersmatchade djur är föredragna. Se till att nödvändiga djur etiska tillstånd are på plats innan inledandet av experiment.
3. Immobilisering av djur med isofluran gasanestesi
- Ladda anestesi enhet med isofluran. Fylla 10 ml gastät glasspruta med isofluran. Undvika att införa luftbubblor. Koppla sprutan och vätskeinloppet med den medföljande slangen och flytta påskjutaren framåt tills vätskan i förbindelseröret är synbart precis på väg att komma in i förångaren.
OBS: Förvara inte isofluran i sprutan när den inte används. - Söva djuren med isofluran i induktionskammaren, med ett luftflöde som hölls vid ungefär 400 till 500 ml / min och koncentrationen av isofluran vid 3,5%.
OBS: Enheten fungerar inte utan luftflöde. - När djuren sover, vrid kranen på anestesienheten att dirigera isofluran gas till masken stycket. Kontrollera att masken stycket är intakt för att undvika läckage av gas. Luftflöde kan upprätthållas vid 400 ml / min, alternativt minskade till 200 ml / min. Minska Isoflurankoncentration till 2,6%.
OBS: anestetisk effekt kan ökas och / eller minskas genom att justera flödeshastigheten.
4. BCG Injektioner och återställning
- bekräfta visuellt och utföra tester såsom tå nypa reflex test för att försäkra sig om att möss immobiliserade / sover på isofluran mask bit innan du utför injektioner.
- Inokulera i bakre trampdynan, 1 x 10 6 kolonibildande enheter av Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i 30 fil PBS med användning av en spruta som är försedd med en 29 G x ½ inch nål.
OBS: Genereringen av mykobakteriella bestånd beskrivs kortfattat i den ursprungliga beskrivningen av detta förfarande 3, och i väsentlig detalj på annat håll 6. BCG är också lätt tillgängliga från kommersiella källor. Författarna rekommenderar att BCG vara puls sonikerade eller passera genom en spruta för att störa klumpar före dess inoculatipå i möss. BCG upprepas här som en mikrobiell stimuli med tanke på dess arbete i den ursprungliga beskrivningen av detta protokoll 3 men författarna uppmuntra säkert testning av andra mikrobiella stimuli. - Utföra samma procedur som beskrivits ovan för injektion av PBS i kontrollmöss.
- Övervaka djur efter injektioner för att bekräfta att återhämta sig från anestesi är framgångsrik och att djuren kan försörja sig på den injicerade, bakre trampdynan.
5. CFSE Injektioner
- Beredning av CFSE för injektionsvätskor:
- Tina en flaska med 5 mM CFSE förrådslösning från -80 ° C. Späd CFSE 10-faldigt i PBS. Resuspendera lösningen noga innan du fyller sprutan som förberedelse för injektionen.
- CFSE Injection och återställning:
- Upprepa proceduren för anesthetizing djur i avsnitt 3. Injicera 20 pl 0,5 mM CFSE i den bakre trampdynan som tidigare fått BCG eller PBS.
- Upprepa proceduren för anesthetizing djur i avsnitt 3. Injicera 20 pl 0,5 mM CFSE i den bakre trampdynan som tidigare fått BCG eller PBS.
6. Kirurgiskt avlägsnande av Poplietallymfknutor Lymph Node (PLN)
OBS: Användning av steriliserade kirurgiska instrument och deras upprepade sanering i 70% etanol uppmuntras hela detta steg.
- Avliva mössen. Spraya djuret med 70% etanol. Stift djuret i dorsal läge, vid en dissekering ombord.
OBS: Författarna kan rekommendera dödshjälp genom halsdislokation. - Noggrant göra en vertikalt snitt i den bakre låret. Tydlig muskler och fett med hjälp av sax och pincett för att exponera och därmed skära PLN ligger djupt i fettpåse, i knävecket.
- Överföra PLN till 0,5 ml steril PBS, på is.
7. Framställning av encelliga suspension från PLN
- Homogenisera PLN genom en 70-micron cell sil placed i en 6-brunnars-platta innehållande 5 ml PBS eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) buffert (PBS innehållande 2% fetalt kalvserum (FCS), 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 1 mM natriumazid). Homogenisera genom silen med hjälp av den bakre änden av en 3 ml spruta.
OBS: Natriumazid är giftigt och bör hanteras med försiktighet. - Tvätta silen med en annan 5 ml PBS eller FACS-buffert, samla materialet i ett 15 ml rör och pelletera cellerna vid 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) under 5 min, 4 ° C. Alternativt, homogenisera pLNs direkt i mikrocentrifugrör med hjälp av polypropylen homogenisatorer.
- Baserat på den pelletstorlek, resuspendera PLN suspension i en lämplig volym av PBS eller FACS-buffert, till exempel, 200 - 1000 | j, l. Använd en räkningskammare för att kvantifiera det totala antalet celler som erhålls från varje LN suspension. Använd trypanblått för att utesluta döda / döende celler.
8. Cell Färgning och flödescytometri
- transfer 1 - 10 x 10 6 celler till 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Tvätta med FACS-buffert och pelleten genom centrifugering vid 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) under 5 min, 4 ° C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 50 - 100 pl antikropp cocktail (se dendritiska celler [DC] markörer används för ytfärgning, Material tabell) innehållande 0,5 - 1 mikrogram av anti-mus CD16 / CD32 (för att blockera ospecifik Fc-medierad interaktioner) i FACS-buffert under 30 - 45 min, på is. Skydda proverna från ljus.
- Efter inkubation, tvätta cellerna med FACS-buffert och pelleten genom centrifugering vid 277 x g (1200 rpm, R = 172 mm) under 5 min, 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i 50 - 100 | il FACS-buffert. Förvärva data på en flödescytometer 7-10.
OBS: För utmärkta recensioner på flödescytometri vi hänvisar läsaren till följande publikationer som relä både teoretisk och praktisk information om den här metoden.
Representative Results
Migrations analys (Figur 1) CFSE-baserade användes tillsammans med flödescytometri att upptäcka och karakterisera CFSE-märkta celler som visas i PLN efter BCG-infektion i fotsulan. En stor del av CFSE märkning PLN finns på MHC-II hög och CD11c + / låga celler (figur 2A), i linje med hud DC som har migrerat till huden DLN 11. Både frekvensen och antalet CFSE-märkta MHC-II hög CD11c + / låga celler ökar i pLNs från BCG-infekterade möss jämfört med PBS-injicerade kontroller (Figur 2B-C), vilket tyder på att BCG ökar omlokalisering av dessa celler till DLN. Eftersom denna analys mäter migration under en 24-timmarsperiod, var det möjligt att fastställa att huden DC fortfarande in i DLN 5 dagar efter infektion (figur 2C). Detta förlänger DC migration i den nuvarande modellen långt bortom tidslinjen för första activatipå av antigenspecifika CD4 + T-celler i PLN 3. Vidare, flytt hud DC uttrycker förhöjda nivåer av samstimulerande molekyler CD80 och CD86 (figur 2D). Detta överensstämmer med tidigare observationer från huden Explantation kulturer och FITC hud målning 11, stöder konceptet att migrations DCs är aktiverade celler. Viktigt, både LN bosatta DC (MHC-II + CD11c höga celler) och plasmacytoid DCS (MHC-II låg CD11c låg PDCA-1 + celler), som träder inflammerade LNS genom höga endotelvenuler och inte afferenta lymfkärlen 12, där negativa för CFSE (Figur 2ef), vilket tyder på verkligen att CFSE märkning skedde främst i trampdynan.
Med tanke på att MHC-II hög CD11c + / låga celler representerar inte en utan flera DC subpopulationer 13, ytterligare ytmarkörer CD103, EpCAM (CD326) och CD11b ingick i antikroppsfärgning panelen används för flödescytometrisk detektion (Material tabell) för att ytterligare karakterisera befolkningen i migrations DCs (Figur 3). På så sätt blev en sub-population av EpCAM låga CD11b hög celler identifierades som den viktigaste migrations huden DC delmängd som svar på BCG-infektion (Figur 3).
De flödescytometriska data som visas här förvärvades på en flödescytometer utrustad med 4 lasrar (488, 532, 640 och 405 nm). Data analyserades med cellanalys programvara. Andra flerfärgade flödescytometrar än den som anges i Material tabell kan användas för att kunna upptäcka av markörerna som nämns i ovanstående studier, eller detektering av andra markörer, på andra celltyper för den delen. För det protokoll som beskrivs häri, en cytometer kan detektera 6 olika fluorokromer är necessary. Viktigt är klonerna för varje antikropp som används anges (Material tabell). Valet av fluorokrom konjugat behöver beaktas eftersom detta kan bero på de lasrar och detekteringskanaler på flödescytometern tillgängliga. På samma sätt, antikroppar måste titreras för att fastställa de mest lämpliga utspädningar för färgning.
Befolknings frekvenser i BCG- och PBS-injicerade proverna plottas och används tillsammans med totala celltal för att beräkna absoluta antal definierade, gated delmängder av DC. Betydelsen av skillnaderna i datagruppen medel analyserades med Student 'st test eller ANOVA i förekommande fall, med en cut-off av p <0,05. Extremvärden uteslöts från analys efter Grubbs: s test för extremvärden.
Figur 1. Disposition: BCG trampdynan InfektionModell och CFSE-Based Migration analys. BCG ympas i den bakre trampdynan hos C57BL / 6-möss. Vid olika tidpunkter efter infektion, och 24 timmar före avlivandet fluorokrom CFSE injiceras i samma trampdyna som tidigare fått BCG. Dräneringen, knävecket lymfkörtel isoleras och CFSE-märkta celler som kännetecknas av flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flytt Skin DC är en stor befolknings flytta till DLN Efter BCG trampdynan infektion. C57BL / 6-möss infekterades med 1 x 10 6 CFU av BCG i trampdynan. Tjugofyra timmar före avlivning, injicerades djuren med 0,5 mM CFSE i samma trampdyna. Poplietallymfknutor LNS skördades, homogeniseradesin i encelliga suspensioner och utsattes för flödescytometri. För mätningar en dag efter BCG var CFSE injicerades 2 h efter BCG. (A och B) Zebra diagram som visar övervägande uttryck för CFSE på MHCII höga och CD11c + / låga celler i BCG-dränerande PLN 3 dagar efter infektion. (C) frekvens och totala antalet CFSE-märkt MHCII hög CD11c + / låga celler i PLN från BCG- och PBS-injicerade möss visas vid olika tidpunkter. (D) genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för CD80 och CD86 bestämdes på CFSE + och CFSE neg MHC-II hög CD11c + / låga hud DC i PLN 3 dagar efter BCG-infektion. (E) CFSE uttryck inom hud DC (MHC-II hög CD11c + / låg), LN-bosatt DC (MHC-II + CD11c hög) och (F) plasmacytoid DC (MHC-II låg CD11c låg PDCA-1 +)bestämdes genom flödescytometri 3 dagar efter BCG. För varje experiment, var minst 5 möss användes för BCG-infekterade grupperna och 3 för PBS-injicerade kontroller. Staplar anger standardfel av medelvärdet. Totala antalet CFSE-märkta celler inom varje delmängd ges i Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Betecknar statistiskt signifikanta skillnader mellan BCG-infekterade och PBS-kontroller. En av två oberoende experiment visas. Figur anpassad från Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, med tillstånd från förlaget Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. EpCAM låg CD11b hög DC är huvud Skin DC delmängd Trafficking till DLN Efter BCG trampdynan Infektion. C57BL / 6-möss injicerades med BCG och CFSE som i figur 2. (A) Zebra tomter visar gating strategi användes (övre panelen) och frekvensen av CFSE + celler inom varje, definierad delmängd vid olika tidpunkter efter BCG-infektion (bottenpanelema). Frekvenser inom varje undergrupp kan variera beroende på den tidpunkt efter infektion. Efter 3 dagar av BCG man kan förvänta sig att hitta cirka 0,2% MHC-II hög CD11c + / låga celler bland alla LN-celler. Av dessa är cirka 6% är CD103 + celler. För undergrupper inom den höga CD103 negativa gate MHC-II, kan man hitta cirka 42% CD11b hög EpCAM låga celler, 27% CD11b låg EpCAM låga celler och 7% LCS. (B) Totalt antal CFSE + celler inom varje definierad delmängd vid olika tidpunkter efter BCG-infektion visas. För varje experiment, var åtminstone 5 möss används för BCG-infekterade grupper och tre för PBS-kontroller. Staplar anger standardfel av medelvärdet. * Betecknar statistiskt signifikanta skillnader i förhållande till PBS-injicerade kontroller. En av tre oberoende experiment visas. Figur åter ut från Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, med tillstånd från förlaget Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
noDCs är specialiserade antigenpresenterande celler som kan svara på mikrobiell utmaning på kroppsytor genom att förvärva mikrobiell antigen och migrera till DLN via lymfkärlen. Där, DCs presentera detta antigen för T-celler på ett sätt som driver primära T-cellsvar. Processen för DC migrering från vävnad till DLN är därför mycket viktigt för att förstå hur en produktiv T-cellssvar initieras. Metoder för att mäta DC migration är därför mycket användbara i utspelas ovan.
En musmodell användes för att studera huden DC migration till DLN efter infektion med BCG, ett levande vaccin som injiceras kliniskt i huden. I linje är BCG injiceras i den bakre trampdynan för att efterlikna denna kutan väg för vaccinering. En enkel analys utvecklades och därmed införlivas i denna modell för att undersöka migration av huden DC delpopulationer från BCG ympning platsen i trampdynan huden dränerings PLN. Detta protokoll relies på injicera fluorokromen CFSE i samma trampdyna som tidigare fått BCG och därefter isolering av den dränerande PLN 24 tim senare för att analysera närvaron av CFSE-märkta celler genom flödescytometri. Även om det inte beskrivs i protokollet, kan LNS från denna inställning också framställas för analys av konfokalmikroskopi, för att studera migrationsprocesser såsom placeringen av migrations celler i LN 3. Dessutom har liknande resultat på BCG-utlöst hud DC migration erhållits med hjälp av både BCG Pasteur 1173P2 3 och BCG SSI 1331 14.
CFSE är vanligen används för att märka celler in vitro och för att spåra sådana märkta celler in vivo efter cellöverföringar 15. I det nuvarande protokollet men det var för att direkt märka hudceller in situ. Den molekylära grunden för CFSE märkning liknar FITC, som också är en aminreaktiv fluorescerande färgämne. CFSE är dock att föredra framför FITC för konjugering som det creates mycket stabila karboxamid obligationer 16. Dessutom är CFSE starkt membran genomsläpplig och passivt diffunderar in i celler. Väl inne, bildar den intracellulära amin (fluorescerande) konjugat som behålls i den märkta cellen 15.
Migrationen analys CFSE baserade utvecklats av författarna möjliggör identifiering av celler flyttar från huden till DLN inom en 24-timmarsperiod som svar på BCG. Den mäter alltså akut migration under en definierad tidsperiod och gör att man kan undersöka förmågan hos olika, injicerade stimuli för att utlösa migreringen. Denna analys skiljer sig från den klassiska tekniken med FITC hud målning, som mäter en kumulativ migration händelse utlöst av kutan, topikal applicering av en kontakt-sensibiliserande medel. Således kan CFSE-baserade migration analysen användas för att identifiera migrations hud DC eller andra celler som hem till PLN efter injektion av mikrober, mikrobiella produkter eller andra inflammatoriska retningar i footpad. Faktum är att både neutrofiler och γ: har ö T-celler visat att flytta från huden till DLN som svar på BCG 17,18. I själva verket var analysen nyligen använts i en samtidig infektion inställning för att visa att en gut-lokaliserad nematod infektion kan stänga BCG-utlöst hud DC migration till DLN 14.
DC migration bedöms ofta mellan 24-72 timmar i FITC hud målning sedan FITC-märkta DCs är svåra att upptäcka fyra till fem dagar efter målning 19. Förlust av CFSE signalen på märkt DC är inte en fråga i analysen presenteras här eftersom analys av migration begränsades till 24 h; Orsaken till detta är att författarna ville specifikt studera "över natten" migrationshändelser. Andra som är intresserade i denna analys men uppmuntras att undersöka tidigare eller ännu senare tidpunkter för CFSE-baserad spårning. Eftersom CFSE introduceras genom injektion kan ges vid varje bestämd tid. Denna flexibilitet möjliggjorde enuthors att bedöma DC migration mellan dag 5 och 6 efter BCG-infektion (figur 2C) 3. Injicera CFSE skulle kunna begränsa celltyper tillgängliga in situ till märkningsreaktionen. Till exempel Langerhans celler (ULF), som är DC som uppehåller sig i det översta lagret av huden, överhuden, migrera dåligt som svar på BCG i CFSE-baserade migration analysen (Figur 3) 3. Under FITC hud målning, DC placerade i dermis skiktet under överhuden, är lätt märkt och migrera till DLN snabbare än LC 20,21. Detta tyder på att celler kan bli fluorokrommärkta utan att nödvändigtvis behöva lokalisera till skiktet av huden där märkningen lösningen appliceras.
Som en modell för BCG-infektion, ger musen örat en bona fide intradermal rutt ympning som är mer i linje med den kliniska administrationen av BCG som tuberkulosvaccin. footpad injektion å andra sidan, är sannolikt en kombination av den intradermala och subkutana vägar. Som sagt, det kräver skicklighet och utbildning för att korrekt och reproducerbart leverera BCG till dermis 22, så i klinisk praxis kan inte alltid ges verkligen intradermal utan subkutan eller en kombination av båda. Som inokulationsstället fotsulan har två mycket tydliga fördelar jämfört med örat som förtjänar att nämnas. För det första är immunsvaret koncentrerades till dräneringen PLN efter en trampdynan injektion och detta underlättar undersökningen av reaktioner. Författarna till denna rapport fann PLN att vara den första och viktigaste LN dränering trampdynan 3. Andra har föreslagit delad dränering mellan knävecken och subiliac LNS efter injektion av Evans blå 23. Men i fråga om örat, det finns mer än ett öra DLN i möss och dessa kan inte vara regelbundet närvarande eller lätt att hitta 24. Den senare introducerar tydligt en LIABbilitet i studier som syftar till att undersöka svar i DLN. För det andra, kan större volymer inokuleras in i trampdynan (10-50 | il) jämfört med örat. Detta i sin tur både minimerar ansvar att införa stora förändringar i lymfatiska flödet och för att behöva arbeta med mycket små injektionsvolymer, vilket i sig är ett problem när det gäller att ympa stora mängder mykobakterier. I örat där injektionsvolymer måste vara liten (1-10 l), kan även 5 ^ ändra lymfatiska flödet och eventuellt tvinga fram en större mängd av det injicerade materialet direkt in i DLN på ett okontrollerat sätt. Det är därför viktigt att ta hänsyn till injektionsvolymer. Detta är särskilt viktigt i experiment adresse bidraget av celler i ferrying bakterier till LN. I BCG trampdynan modellen, kan en del BCG har nått DLN i frånvaro av cell transport. Detta grundar sig på observationen att man fortfarande kan detektera BCG i DLN av möss, där cellmigration från fotenkudden helt ablation genom lokal injektion av pertussistoxinet 3. Huruvida detta är en indikation på att BCG direkt kan få tillgång till lymfkärlen och nå DLN i en verkligt cellfritt sätt återstår att fastställa, eftersom det inte kan uteslutas att mykobakterier i detta fall få tillgång till lymfkärlen med våld av den injicerade volymen.
En praktisk fråga för vaccinationer i örat eller trampdynan är att djuren måste vara tillräckligt orörlig under injektioner utföras korrekt och på ett reproducerbart sätt. Isofluran gas beskrivs i det nuvarande protokollet som en metod för att hålla djur i förberedelse för trampdyna injektioner. De relativt snabb induktion och återhämtningstider för isofluran-medierad anestesi gör det till en populär metod, men liknar andra anestesimedel, påverkar det fysiologi, som kan störa experimentella resultat 25. I själva verket, både flyktiga och injicerbara anestetika minskar lymfflödet genom att avskaffafrivilliga muskelrörelser, vilket minskar muskeltonus och minskande lymphangion kontraktion 26. Dessutom har en minskning med 5 gånger i migrationen till DLN av DCs adoptivt överförd i fotsulan rapporterats i bedövade djur 27. Med tanke på ovanstående, och eftersom de procedurer före anestesi kan orsaka mer stress för djuren än själva injektionen, vilket är både snabb att administrera och kräver inte ett utvinningssteg, möjlighet att på ett adekvat hålla djuret utan bedövningsmedel bör vägas. En mus restrainer anpassad för trampdyna injektioner, där djuret kan snabbt bringas till en immobiliserad position och inokulerats i trampdynan inom 30-40 sek skulle vara idealiskt att injicera musen i bakre trampdynan utan att ändra andra aspekter av dess fysiologi i processen och skulle vara mycket användbart i studier som behandlar cellvandring genom lymfkärlen.
Sammanfattningsvis, den här rapportenbelyser ett nytt protokoll för att spåra hud DC under deras mobilisering till DLN användning av en analys som övervakar migration under en definierad 24-hr fönster. Detta CFSE-baserade migration analys möjliggör detektion och analys av migrations celler genom flödescytometri, som beskrivs här, liksom med konfokalmikroskopi 3. Den ger en flexibel plattform för att studera en mängd olika injicerade stimuli och deras förmåga att utlösa DC migration, och viktigare, kan användas för att spåra inte bara DCs utan även andra populationer som flyttar från huden för att DLN under olika experimentella inställningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
- Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
- Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
- Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
- Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
- Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
- Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
- Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
- Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
- Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
- Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
- Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
- Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).
