Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع Published: October 9, 2016 doi: 10.3791/54620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

Abstract

الخلايا الجذعية (DCS) مهمة للبدء في الاستجابات المناعية، في جزء منه من خلال قدرتها على اكتساب والمستضد المكوك إلى العقدة الليمفاوية استنزاف (DLN). تعبئة البلدان النامية إلى DLN معقدة ويبقى أن توضح تماما خلال العدوى. الموصوفة هنا هو استخدام ل، فحص بسيط المبتكرة التي تعتمد على تألقي 5- و6 carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFSE) لتتبع هجرة البلدان النامية خلال العدوى قاطع الطريق مع المتفطرة البقرية عصيات كالميت غيران (BCG) في C57BL / 6 الفئران. هذا الاختبار يمكن توصيف الجلد العاصمة الفرعية من السكان التي تنقل بشكل فعال في تجفيف، LN المأبضي ردا على BCG. ينشأ هذا البروتوكول من نموذج BCG حيث تم تحديد البلدان النامية الجلد المهاجرة التدفق الخلوي. فحص ودي لدراسة وتحديد البلدان النامية أو الخلايا الأخرى التي موطنا لLN المأبضية بعد التلقيح من الميكروبات أو تمثيل أو غيرها من التهاباتالمحفزات في قاطع الطريق، وبالتالي لدراسة العوامل التي تنظم الهجرة من هذه الخلايا.

Introduction

البلدان النامية محلية في أسطح الجسم بمعنى الميكروبات أو منتجاتها، وبذلك تعبئة عبر الأوعية اللمفاوية إلى LN تجفيف (DLN) 1،2. وهذا مطلوب نقل لنقل مستضد الميكروبي للDLN وما يترتب عليه من فتيلة من الاستجابات المناعية للميكروب الغازية. في الواقع، الحصار أو فشل البلدان النامية إلى الهجرة من الأنسجة المصابة إلى DLN كتم استجابة خلايا T 3-5. وفقا لذلك، المقايسات مصممة لتتبع هجرة على مستوى خلية واحدة هي مفيدة لمساعدة تنسب ظيفة المهاجرة إلى مجموعة فرعية العاصمة معينة.

وهناك مجموعة كبيرة من البيانات على تعبئة البلدان النامية الجلد إلى DLN. الحسابات الأخيرة لكثير من المعرفة حول الهجرة العاصمة من المواقع الملتهبة أو المصابة 2. هذا ليس مستغربا لأن الجلد يضم عدد كبير من البلدان النامية وهو سطح للوصول للغاية لإجراء التجارب في مختبر الفار. وهكذا تم تطوير العديد من التقنيات لتقييمهجرة البلدان النامية الفئران من الجلد إلى DLN 2. FITC اللوحة الجلد هو إلى حد بعيد النهج الأكثر شيوعا. في هذا الاختبار يتم تحضير تألقي فلوريسئين-5-ثيوسيانات (FITC) في خليط مع الأسيتون ومصدر إزعاج للإتصال به. يتم تطبيق هذا المزيج على البشرة نزعه أو حلق وتراكم الخلايا المسمى FITC هو بدوره تحليلها في DLN. ويمكن أيضا أن الهجرة دراستها عن طريق حقن الجلد مع نانو أو المجهرية الدقيقة الموسومة تألقي، والتي تمكن من تتبع الخلايا البلعمية التي قد استوعبت جزيئات الفلورسنت في الجلد. ويمكن أيضا أن مقنى الأوعية اللمفاوية لاستخراج مباشرة البلدان النامية المهاجرة من الليمفاوية. هذا ومع ذلك تحديا تقنيا، خصوصا في الفئران. عدد البلدان النامية التي تم الحصول عليها لتحليلها لاحقا هو أيضا عاملا مقيدا.

على الرغم من العديد من الدراسات السابقة على الجلد هجرة العاصمة، لا تزال هناك ندرة في المعلومات المتعلقة الجلد تعبئة العاصمة لDLN vacci التاليةالأمة مع عصيات كالميت غيران (BCG)، والحية، وسلالة مخففة من المتفطرة البقرية المستخدمة لتطعيم ضد م. السل. وتلقيح BCG في الجلد، مما تسبب في إصابة المحدود الذي يتسبب في نوع T المساعد خلية 1 استجابة. كل من المجموعات الفرعية من السكان العاصمة التي تعبئ إلى DLN من الجلد المصابة BCG-والعوامل التي تنظم هجرتها أثناء هذه العملية ليست مفهومة تماما. في ضوء ما سبق، تم تطوير طريقة بسيطة لكنها رواية حيث يتم حقن تألقي 5- و6 carboxyfluorescein استر ثنائي الأسيتات succinimidyl (CFSE) في الموقع لتتبع هجرة البلدان النامية في DLN 3. يتم حقن C57BL / 6 الفئران في قاطع الطريق الخلفية مع اللقاح من مجموعة بوسطن الاستشارية وقبل يوم واحد تضحية، يتم حقن الحيوانات في نفس قاطع الطريق مع تركيز عال من CFSE. في وقت لاحق أربع وعشرين ساعة والتضحية الحيوانات واستنزاف المأبضية LN (PLN) إزالة وإعدادها للالتدفق الخلوي. هذا الاختبار يمكن للبيئة تطوير متكاملةntification الخلايا التي تهاجر بين عشية وضحاها من الجلد قاطع الطريق إلى DLN (الشكل 1).

وعلاوة على ذلك، والفئران التي تستهدف الجينات يمكن أن تستخدم للمساعدة في تحديد العوامل اللازمة للخلايا لتعبئة لDLN. باستخدام هذا الاختبار، والكتاب من هذا التقرير قد وجدت في وقت سابق ان EpCAM منخفضة CD11b عالية المهاجرة BCG البلدان النامية الجلد النقل إلى DLN في عملية ينظمها الانترلوكين 1 مستقبل ومحول داخل الخلايا جزيء MyD88 3. بروتوكول لهذا الاختبار الهجرة القائم على CFSE الذي ينبع من التقرير المذكور من قبل Bollampalli وآخرون. 3 حيث كانت تستخدم التدفق الخلوي للكشف وتحليل البلدان النامية الجلد المهاجرة، ووصفت هذه الوثيقة. وتناقش مزايا وعيوب هذا الاختبار.

Protocol

ملاحظة: استخدمت C67BL / 6 الفئران لهذه التجارب هو مبين في هذه المخطوطة. وكانت هذه الحيوانات منزل في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان MTC، معهد كارولينسكا في ستوكهولم، السويد. وقد أجريت التجارب على الحيوانات وفقا لتوجيهات وإرشادات من المجلس السويدي للزراعة، وكالة حماية الحيوان السويدية، ومعهد كارولينسكا. تمت الموافقة على تجارب من قبل مجلس أخلاقيات شمال الحيوان ستوكهولم.

1. إعداد الأرصدة CFSE والتخزين

  1. إعداد المخزون 5 ملم من 5- و 6 carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFSE) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل. دوامة. الاستغناء عن 100 مكل في العقيمة، 0.5 مل المسمار microtubes الغطاء. مخزن aliquots في -80 درجة مئوية.

2. الفئران

  1. استخدام الذكور الفطرية أو إناث الفئران بين 8 و 12 أسابيع من العمر. ويفضل الحيوانات حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة. تأكد من تصاريح الأخلاقية الحيوانية اللازمة عه في المكان قبل بدء التجارب.

3. الشلل من الحيوانات مع isoflurane التخدير الغاز

  1. تحميل وحدة التخدير مع isoflurane. ملء الحقنة زجاج 10 مل الغاز محكم مع isoflurane. تجنب إدخال فقاعات الهواء. ربط المحاقن ومدخل السائل مع الأنابيب الموردة ونقل انتهازي إلى الأمام حتى السائل في أنبوب يربط هو واضح على وشك دخول المرذاذ.
    ملاحظة: لا تقم بتخزين الأيزوفلورين في حقنة عندما لا تكون قيد الاستعمال.
  2. تخدير الحيوانات مع isoflurane في غرفة الاستقراء، مع تدفق الهواء الحفاظ على ما يقرب من 400-500 مل / دقيقة، وتركيز الأيزوفلورين بنسبة 3.5٪.
    ملاحظة: وحدة لا تعمل دون تدفق الهواء.
  3. وبمجرد أن الحيوانات نائمة، وتحويل محبس على وحدة التخدير لتوجيه الغاز الأيزوفلورين إلى قطعة قناع. تأكد من أن قطعة قناع سليمة لتجنب تسرب الغاز. يمكن الحفاظ على تدفق الهواء في 400 مل / دقيقة، ألترناانخفضت نسبيا إلى 200 مل / دقيقة. تقليل تركيز الأيزوفلورين إلى 2.6٪.
    ملاحظة: تأثير المخدر يمكن زيادة و / أو ينقص عن طريق ضبط معدل التدفق.

4. BCG الحقن والإنعاش

  1. بصريا تأكيد وإجراء اختبارات مثل إصبع القدم اختبار قرصة العاكسة للتأكد من أن الفئران يجمد / نائما على القناع قطعة الأيزوفلورين قبل إجراء الحقن.
  2. تطعيم في قاطع الطريق هند، 1 × 10 6 وحدات تشكيل مستعمرة المتفطرة البقرية عصيات كالميت غيران (BCG) في 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة مزودة 29 G س ½ بوصة إبرة.
    ملاحظة: يتم وصف جيل من أسهم المتفطرات لفترة وجيزة في الوصف الأصلي من هذا الإجراء 3، وبالتفصيل كبير في أي مكان آخر 6. BCG غير متوفرة من مصادر تجارية أيضا. يوصي الباحثون أن BCG تكون أو تمريره sonicated النبض من خلال حقنة لعرقلة كتل قبل inoculati لهاعلى في الفئران. وأكد BCG هنا بمثابة المحفزات الميكروبية نظرا توظيفها في الوصف الأصلي من هذا البروتوكول 3، ولكن من المؤكد أن الكتاب يشجع اختبار المحفزات الميكروبية الأخرى.
  3. تنفيذ نفس الإجراء الموضح أعلاه لحقن برنامج تلفزيوني في السيطرة على الفئران.
  4. مراقبة الحيوانات بعد الحقن للتأكد من أن التعافي من التخدير هو ناجح وأن الحيوانات يمكن أن تدعم نفسها على، قاطع الطريق هند حقن.

5. CFSE الحقن

  1. إعداد CFSE للحقن:
    1. ذوبان الجليد قارورة من 5 ملي CFSE حل الأوراق المالية من -80 درجة مئوية. تخفيف CFSE 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني. Resuspend والحل جيدا قبل ملء المحقن استعدادا للحقن.
  2. CFSE حقن والاسترداد:
    1. كرر الإجراء التخدير الحيوانات في القسم 3. حقن 20 ميكرولتر من 0.5 ملي CFSE في قاطع الطريق الخلفية التي حصلت سابقا BCG أو برنامج تلفزيوني.

6. إزالة جراحية من المأبضي العقدة الليمفاوية (PLN)

ويتم تشجيع استخدام الأدوات الجراحية المعقمة وإزالة التلوث المتكرر في الايثانول 70٪ في جميع أنحاء هذه الخطوة: ملاحظة.

  1. الموت ببطء الفئران. رش الحيوان مع الايثانول 70٪. دبوس الحيوان في موقف الظهرية، على لوحة التشريح.
    ملاحظة: يمكن للمؤلفين يوصي القتل الرحيم من خلال خلع عنق الرحم.
  2. جعل بعناية شق عمودي في الفخذ الخلفية. العضلات واضحة والدهون باستخدام مقص وملاقط لفضح وبالتالي استئصال PLN تقع في عمق الحقيبة الدهون، في الغور في الركبة.
  3. نقل PLN إلى 0.5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني، على الجليد.

7. توليد تعليق خلية واحدة من زلوتي

  1. التجانس PLN من خلال 70 ميكرون خلية مصفاة PLACإد في لوحة جيدا 6 تحتوي على 5 مل برنامج تلفزيوني أو مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) عازلة (PBS تحتوي على 2٪ الجنين مصل العجل (FCS)، 5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 1 ملي أزيد الصوديوم). التجانس من خلال مصفاة باستخدام نهاية الجزء الخلفي من حقنة 3 مل.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم السامة وينبغي التعامل معها بحذر.
  2. غسل مصفاة مع 5 مل أخرى من العازلة في برنامج تلفزيوني أو نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجمع المواد في أنبوب 15 مل وبيليه الخلايا في 277 x ج (1200 دورة في الدقيقة، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، التجانس pLNs مباشرة في أنابيب microcentrifuge باستخدام المجانسة البولي بروبلين.
  3. بناء على حجم بيليه، resuspend وتعليق زلوتي في حجم مناسب من برنامج تلفزيوني أو FACS العازلة، على سبيل المثال، 200 - 1000 ميكرولتر. استخدام غرفة الفرز لتحديد عدد الخلايا الكلي الحصول عليها من كل تعليق LN. استخدام اللون الأزرق التريبان استبعاد الخلايا الميتة / الموت.

8. خلية تلطيخ والتدفق الخلوي

  1. آرansfer 1 - 10 × 10 6 خلايا إلى 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع. يغسل مع العازلة FACS، وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 277 x ج (1200 دورة في الدقيقة، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
  2. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 50-100 ميكرولتر من الكوكتيل الأضداد (انظر الخلايا الجذعية [العاصمة] علامات تستخدم لتلطيخ السطح، مواد الجدول) التي تحتوي على 0،5-1 ميكروغرام من مكافحة فأر CD16 / CD32 (لمنع FC-بوساطة غير محددة التفاعلات) في المخزن FACS ل30 - 45 دقيقة، على الجليد. حماية عينات من الضوء.
  3. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مع العازلة FACS وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 277 x ج (1200 دورة في الدقيقة، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية.
  4. و resuspend الخلايا في 50-100 ميكرولتر من FACS العازلة. الحصول على البيانات على تدفق عداد الكريات 7-10.
    ملاحظة: للحصول على ملاحظات ممتازة على التدفق الخلوي نشير القارئ إلى المنشورات التالية التي تتابع كل من المعلومات النظرية والعملية على هذه الطريقة.

Representative Results

تم استخدام الهجرة فحص مقرها CFSE (الشكل 1) جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي للكشف عن وتميز الخلايا المسمى CFSE التي تظهر في زلوتي بعد BCG العدوى في قاطع الطريق. تم العثور على جزء كبير من العلامات CFSE في PLN على MHC-II عالية وCD11c و+ / خلايا منخفضة (الشكل 2A)، بما يتفق مع البلدان النامية الجلد التي هاجرت إلى DLN الجلد 11. على وتيرة وعدد المسمى CFSE، CD11c وارتفاع MHC-II + / هي زيادة الخلايا منخفضة في pLNs من الفئران المصابة BCG-مقارنة مع الضوابط حقن برنامج تلفزيوني (الشكل 2B-C)، مما يوحي بأن BCG يعزز نقل هذه الخلايا إلى DLN. منذ هذه الهجرة تدابير الفحص خلال فترة 24 ساعة، كان من الممكن إثبات أن البلدان النامية الجلد لا تزال تدخل DLN 5 أيام بعد الإصابة (الشكل 2C). هذا يمتد هجرة العاصمة في النموذج الحالي إلى ما وراء جدول زمني لactivati ​​الأوليعلى خلايا CD4 + T مستضد معين في زلوتي 3. وعلاوة على ذلك، البلدان النامية الجلد المهاجرة تعبر عن مستويات مرتفعة من شارك في تنشيطية جزيئات CD80 و CD86 (الشكل 2D). وهذا يتفق مع الملاحظات السابقة من الثقافات يزدرع الجلد وFITC الجلد اللوحة 11، ودعم مفهوم أن البلدان النامية المهاجرة هي خلايا تفعيلها. البلدان النامية الأهم من ذلك، على حد سواء LN-المقيمين (خلايا MHC-II + CD11c وعالية) والبلدان النامية بلازماوية الشكل (MHC-II CD11c وانخفاض منخفضة PDCA-1 + الخلايا)، التي تدخل LNS الملتهبة من خلال الأوردة البطانية عالية وليس من الأوعية اللمفاوية وارد 12، حيث سلبية ل CFSE (الشكل 2EF)، مما يشير الواقع أن CFSE وضع العلامات وقعت أساسا في قاطع الطريق.

وبالنظر إلى أن MHC-II عالية CD11c و+ / خلايا المنخفضة تمثل يست واحدة ولكن عدة DC-السكان دون 13، وعلامات سطح إضافية CD103، EpCAM (Cأدرجت D326) وCD11b في لوحة تلوين الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن تدفق cytometric (مواد الجدول) لمزيد من تميز سكان البلدان النامية المهاجرة (الشكل 3). في القيام بذلك، وقد تم تحديد عدد السكان فرعي من EpCAM انخفاض خلايا عالية CD11b كما الجلد المهاجرة العاصمة فرعية رئيسية في الاستجابة للعدوى السل (الشكل 3).

تم الحصول على البيانات تدفق cytometric هو موضح هنا على تدفق عداد الكريات مجهزة 4 الليزر (488، 532، 640 و 405 نانومتر). تم تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الخلية. أجهزة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان الأخرى من تلك المحددة في الجدول مواد يمكن استخدامها للكشف الناجح للعلامات المذكورة في الدراسات المذكورة أعلاه، أو الكشف عن علامات أخرى، على أنواع الخلايا الأخرى في هذا الشأن. لبروتوكول الموصوفة هنا، وهي قادرة الكريات من الكشف عن 6 fluorochromes مختلفة هي necessary. الأهم من ذلك، يتم تحديد الحيوانات المستنسخة لكل الأجسام المضادة المستخدمة (المواد الجدول). اختيار المترافقة تألقي يحتاج إلى اعتبار هذا قد تعتمد على أشعة الليزر وقنوات الكشف على تدفق عداد الكريات المتاحة. وبالمثل، لا بد من معاير لتحديد التخفيفات الأنسب لتلطيخ الأجسام المضادة.

ورسوم بيانية الترددات السكان في BCG- والعينات حقن برنامج تلفزيوني واستخدامها جنبا إلى جنب مع إجمالي عدد الخلايا لحساب الأعداد المطلقة للتعريف مجموعات فرعية بوابات من البلدان النامية. تم تحليل دلالة الفروق في الوسائل مجموعة البيانات عن طريق اختبار الحادي وطالب "أو أنوفا عند الاقتضاء، مع قطع من ف <0.05. تم استبعاد القيم المتطرفة من التحليل التالي اختبار جرابز الصورة لالقيم المتطرفة.

شكل 1
الشكل 1. الخطوط العريضة: BCG قاطع الطريق العدوىوتلقيح نموذج وCFSE القائم على الهجرة الفحص. BCG في قاطع الطريق الخلفية من C57BL / 6 الفئران. في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى، و 24 ساعة قبل التضحية، يتم حقن CFSE تألقي في نفس قاطع الطريق التي حصلت سابقا BCG. يتم عزل تجفيف، العقدة الليمفاوية المأبضية والخلايا التي تتميز تدفق CFSE المسمى الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. البلدان النامية الجلد المهاجرة هي السكانية الرئيسية ينقل إلى وDLN بعد BCG قاطع الطريق العدوى. أصيب C57BL / 6 الفئران مع 1 × 10 6 CFUs من BCG في قاطع الطريق. قبل أربع وعشرين ساعة التضحية، تم حقن الحيوانات مع 0.5 ملي CFSE في نفس قاطع الطريق. كانت تحصد LNS المأبضية، المتجانسفي تعليق وحيد الخلية وتعرض لالتدفق الخلوي. لالقياسات التي أجريت يوم 1 بعد BCG، تم حقن CFSE 2HR بعد BCG. (A و B) المؤامرات حمار وحشي يظهر التعبير السائد من CFSE على MHCII عالية وCD11c و+ / خلايا منخفضة في مجموعة بوسطن الاستشارية استنزاف PLN بعد 3 أيام من العدوى. ورسوم بيانية (C) التردد وعدد المسمى CFSE-MHCII CD11c وعالية + / خلايا منخفضة في زلوتي من BCG- وحقن الفئران برنامج تلفزيوني في نقاط زمنية مختلفة. تم تحديد (D) يعني مضان كثافة (MFI) لCD80 و CD86 على CFSE + وCFSE NEG MHC-II CD11c وعالية + / منخفضة البلدان النامية الجلد في زلوتي بعد 3 أيام من العدوى BCG. (E) التعبير CFSE في البلدان النامية الجلد (MHC-II CD11c وعالية + / منخفض)، LN مقيم البلدان النامية (MHC-II + CD11c وارتفاع) و (F) البلدان النامية بلازماوية الشكل (CD11c وانخفاض MHC-II منخفضة PDCA-1 +)تم تحديدها من قبل التدفق الخلوي بعد 3 أيام BCG. لكل تجربة، تم استخدام ما لا يقل عن 5 الفئران للمجموعات المصابة BCG-و 3 لضوابط حقن برنامج تلفزيوني. الحانات وتشير الخطأ المعياري للمتوسط. يتم إعطاء العدد الكلي للخلايا المسمى CFSE داخل كل مجموعة فرعية في Bollampalli وآخرون، بلوس Pathog عام 2015، 11: e1005206 3. * تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين الضوابط BCG-المصابة وبرنامج تلفزيوني. واحدة من تجربتين مستقلة مبين. شخصية مقتبسة من Bollampalli وآخرون، بلوس Pathog عام 2015، 11:... e1005206 3، بإذن من الناشر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. EpCAM CD11b منخفضة البلدان النامية عالية هي الجلد الرئيسي العاصمة الثانوية Traffickتم حقن جي إلى DLN بعد BCG قاطع الطريق العدوى. C57BL / 6 الفئران مع مجموعة بوسطن الاستشارية وCFSE كما في الشكل (2). المؤامرات (A) زيبرا تظهر النابضة الاستراتيجية المستخدمة (أعلى لوحة) وتواتر CFSE + الخلايا داخل كل منها، تعريف فرعية في مختلف نقاط الوقت بعد الإصابة BCG (لوحات أسفل). قد تختلف الترددات داخل كل مجموعة فرعية تبعا لنقطة زمنية بعد العدوى. بعد 3 أيام من BCG يمكن للمرء أن يتوقع أن يجد ما يقرب من 0.2٪ MHC-II عالية CD11c و+ / خلايا منخفضة بين جميع الخلايا LN. من هؤلاء، ما يقرب من 6٪ من CD103 + الخلايا. لمجموعات فرعية وجدت داخل عالية CD103 بوابة السلبية MHC-II، يمكن للمرء أن يجد ما يقرب من 42٪ CD11b عالية EpCAM خلايا المنخفضة، 27٪ CD11b خلايا منخفضة منخفضة EpCAM و 7٪ خطابات الاعتماد. (ب) يظهر مجموع أعداد CFSE + الخلايا داخل كل منهما، فرعية محددة في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى BCG. لكل experimeالإقليم الشمالي، واستخدمت لا يقل عن 5 الفئران للمجموعات المصابة BCG-و 3 لعناصر برنامج تلفزيوني. الحانات وتشير الخطأ المعياري للمتوسط. * تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية النسبية لضوابط حقن برنامج تلفزيوني. واحدة من ثلاث تجارب مستقلة مبين. . الشكل من Bollampalli آخرون المطبوعة إعادة، بلوس Pathog عام 2015، 11: e1005206 3، بإذن من الناشر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

noDCs هي الخلايا المتخصصة العارضة للمستضد التي يمكن الرد على التحدي الميكروبي في أسطح الجسم عن طريق الحصول على مستضد الجراثيم والهجرة إلى DLN عبر الأوعية اللمفاوية. هناك، البلدان النامية تمثل هذا المستضد للخلايا T بطريقة يدفع الردود تي الخلية الأولية. عملية الهجرة العاصمة من الأنسجة لDLN ذلك فمن المهم للغاية لفهم كيف يبدأ استجابة خلايا T الإنتاجية. أساليب لقياس الهجرة العاصمة هي بالتالي مفيدة جدا في تتكشف أعلاه.

كان يعمل الفأر نموذج لدراسة الجلد العاصمة الهجرة إلى DLN بعد الإصابة مع مجموعة بوسطن الاستشارية، على لقاح التي يتم ضخها سريريا في الجلد. في الخط، ويتم حقن BCG في قاطع الطريق الخلفية لتقليد هذا الطريق الجلدي التطعيم. وقد تم تطوير فحص بسيط وبالتالي أدرجت لهذا النموذج للتحقيق في الهجرة من الجلد العاصمة الفرعية من السكان من موقع التلقيح BCG في الجلد قاطع الطريق إلى PLN تجفيف. هذا RELI بروتوكولوفاق على حقن CFSE تألقي في نفس قاطع الطريق التي حصلت سابقا BCG ثم عزل استنزاف PLN 24 ساعة في وقت لاحق لتحليل وجود الخلايا المسمى CFSE من قبل التدفق الخلوي. وإن لم يكن هو موضح في البروتوكول، LNS من هذا الإعداد ويمكن أيضا أن يكون مستعدا لتحليلها بواسطة المجهر متحد البؤر، لدراسة عمليات الهجرة مثل تحديد المواقع من الخلايا المهاجرة في LN 3. وعلاوة على ذلك، تم الحصول على نتائج مماثلة على أثار BCG-الجلد الهجرة العاصمة باستخدام كل BCG باستور 1173P2 3 و BCG مباحث أمن الدولة 1331 14.

يستخدم CFSE عادة لتسمية الخلايا في المختبر، وتعقب هذه الخلايا المسمى في الجسم الحي بعد نقل خلية 15. في البروتوكول الحالي على الرغم من انه كان يستخدم لتسمية مباشرة خلايا الجلد في الموقع. الأساس الجزيئي للCFSE وضع العلامات يشبه FITC، الذي هو أيضا صبغة الفلورسنت-أمين رد الفعل. هو المفضل ولكن CFSE على FITC لتصريف الافعال كما لجنة المساواة العرقيةآتش السندات carboxamide مستقرة جدا 16. وعلاوة على ذلك، CFSE هو غاية نفاذية الغشاء وينشر بشكل سلبي في الخلايا. مرة واحدة داخل، وأنها تشكل أمين الخلايا (الفلورية) تقارن التي يتم الاحتفاظ بها في الخلية المسمى 15.

فحص الهجرة القائم على CFSE وضعت من قبل المؤلفين يمكن تحديد خلايا ينتقلون من الجلد لDLN خلال فترة 24 ساعة ردا على BCG. وبالتالي فهو يقيس الهجرة حادة خلال فترة زمنية محددة ويسمح احد لتحقيق قدرة مختلفة، حقن محفزات لتحريك الهجرة. هذا الاختبار هو يختلف عن الأسلوب التقليدي من FITC اللوحة الجلد، والذي يقيس حدث الهجرة التراكمي الناجم عن جلدي، التطبيق الموضعي للوكيل اتصال تحسس. وهكذا، فإن فحص الهجرة استنادا CFSE-يمكن استخدام لتحديد البلدان النامية الجلد المهاجرة أو غيرها من الخلايا التي موطنا لPLN بعد حقن الميكروبات، المنتجات الميكروبية أو غيرها من محفزات للالتهابات في وootpad. في الواقع، على حد سواء العدلات وγ: وقد ثبت δ خلايا T للانتقال من الجلد لDLN ردا على BCG 17،18. في الواقع، كانت تستخدم في فحص مؤخرا في إعداد الاصابات المشتركة لإظهار أن عدوى الديدان الخيطية مترجمة الأمعاء يمكن كتم أثار BCG-الجلد العاصمة الهجرة إلى DLN 14.

وغالبا ما تقيم العاصمة الهجرة ما بين 24 إلى 72 ساعة في FITC اللوحة الجلد منذ FITC المسمى البلدان النامية هي صعبة للكشف عن 4-5 أيام بعد اللوحة 19. فقدان إشارة CFSE على البلدان النامية وصفت ليست قضية في مقايسة المقدمة هنا منذ اقتصر تحليل للهجرة إلى 24 ساعة. السبب وراء ذلك هو أن الكتاب أراد أن يدرس على وجه التحديد "بين عشية وضحاها" أحداث الهجرة. لكن الجهات المهتمة في هذا الاختبار يتم تشجيعهم على تحقيق نقاط وقت سابق أو حتى في وقت لاحق لتتبع مقرها CFSE. وعلاوة على ذلك، حيث يتم عرض CFSE عن طريق الحقن يمكن أن يعطى في أي وقت محدد. سمحت هذه المرونة ولuthors لتقييم هجرة العاصمة بين يوم 5 و 6 بعد الإصابة BCG (الشكل 2C) 3. الحقن CFSE يمكن أن تحد من أنواع الخلايا يمكن الوصول إليها في الموقع إلى رد فعل العلامات. لخلايا سبيل المثال انجرهانز (خطابات الاعتماد)، والتي هي البلدان النامية الموجودة في الطبقة العليا من الجلد، والبشرة، تهاجر سيئة ردا على BCG في فحص الهجرة استنادا CFSE (الشكل 3) 3. ومع ذلك، خلال FITC اللوحة الجلد، والبلدان النامية المتمركزة في الأدمة، وطبقة تحت البشرة، وصفت بسهولة والهجرة إلى DLN أسرع من خطابات الاعتماد 20،21. وهذا يشير إلى أن الخلايا يمكن أن تصبح تألقي المسمى دون الحاجة بالضرورة إلى توطين لطبقة من الجلد حيث يتم تطبيق الحل وضع العلامات.

كنموذج لعدوى السل، وتقدم الأذن الماوس طريق الأدمة الحقيقيين التلقيح التي هي أكثر انسجاما مع الإدارة السريرية للقاح بي سي جي كلقاح السل. فوحقن otpad من ناحية أخرى، من المرجح أن يكون مزيجا من الأدمة تحت الجلد وطرق. قال ذلك، فإنه يتطلب مهارة وتدريب بشكل صحيح وبتكاثر تقديم BCG إلى الأدمة 22، وذلك في الممارسة السريرية فإنه قد لا يكون دائما تعطى حقا الأدمة تحت الجلد ولكن بدلا أو مزيج من الاثنين معا. كموقع التلقيح لا قاطع الطريق واثنين من المزايا واضحة جدا على الأذن التي تستحق الذكر. أولا، يتركز الاستجابة المناعية للPLN تجفيف بعد الحقن قاطع الطريق وهذا يسهل فحص الاستجابات. وقد وجد الباحثون من هذا التقرير PLN أن يكون LN الأول والرئيسي استنزاف قاطع الطريق 3. واقترح آخرون الصرف الانقسام بين مأبضي وتحت الحرقفة LNS بعد حقن الأزرق البالغ عددهم 23 ايفان. ومع ذلك، في ما يخص الأذن، هناك الأذن أكثر من DLN في الفئران وهذه قد لا تكون موجودة بشكل منتظم أو السهل العثور على 24. هذا الأخير يدخل بوضوح liability في الدراسات التي تسعى إلى التحقيق الردود في DLN. ثانيا، كميات أكبر يمكن تلقيح في قاطع الطريق (10-50 ميكرولتر) مقارنة الأذن. وهذا بدوره يقلل من كلا مسؤولية إدخال تغييرات كبيرة في التدفق اللمفاوي والحاجة إلى العمل مع حقن كميات صغيرة جدا، والتي هي في حد ذاتها مشكلة عندما يتعلق الأمر بتلقيح كميات كبيرة من المتفطرات. في الأذن حيث يكون حجم الضخ إلى أن تكون صغيرة (1-10 ميكرولتر)، قد حتى 5 ميكرولتر يغير التدفق اللمفاوي وربما يجبر على كمية أكبر من المواد حقنها مباشرة في DLN بطريقة خارجة عن السيطرة. ولذلك فمن المهم لحساب كميات الحقن. هذا مهم بشكل خاص في التجارب معالجة مساهمة من الخلايا في تنقل البكتيريا إلى LN. في نموذج قاطع الطريق BCG، بعض BCG قد وصلت إلى DLN في غياب النقل الخلوي. ويستند هذا على ملاحظة أنه يمكن للمرء أن لا يزال الكشف عن مجموعة بوسطن الاستشارية في DLN من الفئران حيث هجرة الخلايا من سفحوقد ذاب لوحة تماما عن طريق الحقن المحلي من السعال الديكي السم 3. إذا كان هذا هو إشارة إلى أن BCG يمكن الوصول مباشرة إلى الأوعية اللمفاوية والوصول إلى DLN بطريقة حقا خالية من الخلايا يزال يتعين تحديد لأنه لا يمكن استبعاد أن المتفطرات في هذه الحالة حيث تتاح لهم فرص الوصول إلى الأوعية اللمفاوية بالقوة من حجم حقن.

وهناك اعتبار عملي للتحصينات في الأذن أو قاطع الطريق هو أن الحيوانات وأن يجمد بشكل كاف لحقن التي يتعين القيام بها بشكل صحيح وبطريقة قابلة للتكرار. يوصف الغاز الأيزوفلورين في البروتوكول الحالي كوسيلة لكبح جماح الحيوانات استعدادا لحقن قاطع الطريق. والاستقراء والانتعاش مرة السريعة نسبيا للتخدير بوساطة الأيزوفلورين جعله وسيلة شعبية، ولكن على غرار وكلاء مخدر آخر، فإنه يؤثر على علم وظائف الأعضاء، والتي قد تتداخل مع النتائج التجريبية 25. في الواقع، ومواد التخدير على حد سواء المتقلبة والحقن انخفاض تدفق الليمفاوية من خلال إلغاءحركات العضلات الطوعية، والحد من قوة العضلات، وخفض lymphangion الانكماش 26. وعلاوة على ذلك، تم الإبلاغ عن انخفاض 5 أضعاف في الهجرة إلى DLN من البلدان النامية نقل adoptively في قاطع الطريق في الحيوانات تخدير (27). بالنظر إلى ما سبق، وبما أن إجراءات التعامل مع قبل التخدير من المحتمل أن يسبب المزيد من الضغط على الحيوانات من حقن نفسه، والذي هو على حد سواء السريع لإدارة ولا يتطلب خطوة الانتعاش، وإمكانية لكبح كاف الحيوان دون التخدير ينبغي يعتبر. ومن شأن رادع الماوس مخصصة لحقن قاطع الطريق، حيث الحيوان لا يمكن أن تتحقق بسرعة إلى موقف يجمد وتلقيح في قاطع الطريق ضمن 30 إلى 40 ثانية تكون مثالية لحقن الماوس في قاطع الطريق الخلفية دون تغيير الجوانب الأخرى من علم وظائف الأعضاء في عملية وسيكون من المفيد للغاية في الدراسات التي تتناول الهجرة الخلية من خلال الأوعية اللمفاوية.

وفي الختام، فإن هذا التقريريسلط الضوء على بروتوكول رواية لتتبع البلدان النامية الجلد أثناء تعبئتها لDLN باستخدام الفحص التي تراقب الهجرة خلال نافذة على مدار 24 ساعة محددة. هذا الاختبار الهجرة القائم على CFSE يسمح كشف وتحليل الخلايا المهاجرة التي التدفق الخلوي، كما هو مفصل هنا، وكذلك عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر 3. أنه يوفر منصة مرنة لدراسة مجموعة متنوعة من المحفزات حقن وقدرتها على تحريك هجرة العاصمة، والأهم من ذلك، يمكن استخدامها لتتبع البلدان النامية فحسب، بل أيضا الشعوب الأخرى تتحرك من الجلد لDLN خلال إعدادات التجريبية المختلفة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Baxter 1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
(CFSE)		 Invitrogen C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG) strain Pasteur, in house
Trypan blue solution Sigma T8154
EDTA In house
Sodium azide Sigma S2002
PBS In house
Filtered water In house
BD Plastipak 3 ml syringe BD Medical Surgical Systems 309658 alternative: 5 ml syringe 
6 well plates TPP 92006
15 ml centrifuge tubes TPP 91015 Polypropylene
5 ml round bottom tubes BD Falcon 3272948 Polystyrene
Univentor 400 anesthesia unit Univentor 8323001
Monojet 3/10 ml syringe Medicarrier 8881511144 29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit TPP 99500 PES membrane 
EPPI-Pistill homogenizer Schuett biotech 3.200 512 Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B01145
Bürker counting chamber VWR 631-0920
0.5 ml screw cap microtube  Sarstedt 72.730 Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube VWR 700-5239 Polypropylene
70 micron cell strainers VWR 734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software BD Biosciences Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software Tree Star
Antibody Clone Company 
MHC-II I-A/I-E  M5/114.15.2 BD Biosciences
CD11b M1/70 BD Biosciences
CD11c HL3 BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block) 2.4G2 BD Biosciences
CD326/EpCAM G8.8 Biolegend
CD103 2E7 Biolegend
CD80 16-10A1 Biolegend
CD86 GL-1 Biolegend

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
  2. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  3. Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
  4. Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
  5. Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
  6. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
  7. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
  8. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
  9. Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
  10. Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
  11. Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
  12. Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
  13. Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
  14. Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
  15. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
  16. Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
  17. Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
  18. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
  19. Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
  20. Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
  21. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
  22. Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
  23. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
  24. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
  25. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
  26. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
  27. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).

Tags

عدوى، العدد 116، والخلايا الجذعية، CFSE وضع العلامات، والهجرة، والعقدة الليمفاوية، BCG، والماوس، والجلد
مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bollampalli, V. P., Nylén, S.,… More

Bollampalli, V. P., Nylén, S., Rothfuchs, A. G. A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (116), e54620, doi:10.3791/54620 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter