Abstract
Dendritiske celler (DCS) er vigtige for at indlede immunreaktioner, dels gennem deres evne til at tilegne sig og shuttle antigenet til drænende lymfeknude (DLN). Mobiliseringen af DC'er til DLN er kompleks og er endnu ikke fuldstændigt belyst under infektion. Beskrevet heri er anvendelsen af en innovativ, enkel assay, der bygger på fluorchrom 5- og 6-carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) at spore migreringen af DC'er under trædepuden infektion med Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i C57BL / 6-mus. Denne analyse muliggør karakterisering af huden DC delpopulationer, der aktivt flytter til dræning, popliteale LN som reaktion på BCG. Denne protokol stammer fra en BCG model, hvor vandrende hud DC'er blev identificeret ved flowcytometri. Assayet er venlig til studiet og identifikation af DC'er eller andre celler, der huser den popliteale LN efter inokulering af mikrober, deres metabolitter eller andre inflammatoriskestimuli i trædepuden, og følgelig at studere faktorer, der regulerer migreringen af disse celler.
Introduction
DC'er lokaliseret i kroppens overflader fornemmer mikrober eller deres produkter, og dermed mobilisere via lymfekar til dræning LN (DLN) 1,2. Der er behov for denne flytning til transport af mikrobiel antigen til DLN og den deraf priming af immunresponser på den invaderende mikrobe. Faktisk blokade eller svigt af DC'er at migrere fra det inficerede væv til DLN muter T-celle-respons 3-5. Følgelig assays designet til at spore migration på enkelt-celle niveau er nyttige til at hjælpe tilskriver vandrende funktion til en given DC delmængde.
Der er en stor mængde data om mobiliseringen af huden DC'er til DLN. Sidstnævnte står for meget af den viden om DC migration fra betændte eller inficerede sites 2. Dette er ikke overraskende, da huden huser en stor population af DC'er og er en meget tilgængelig overflade til forsøg i laboratoriet mus. Flere teknikker er således blevet udviklet til at vurderemigration af murine DC'er fra huden til DLN 2. FITC hudpensling er langt den mest anvendte metode. I dette assay fluorochromet fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) fremstilles i en blanding med acetone og en kontakt irriterende. Denne cocktail påføres afhåret eller barberet hud og akkumuleringen af FITC-mærkede celler igen er analyseret i DLN. Migration kan også undersøges ved at injicere huden med fluorochrom-mærkede nano- eller mikropartikler, som muliggør sporing af fagocytiske celler, der har internaliseret de fluorescerende partikler i huden. Lymfekar kan også være kanylerede til direkte udtrække migrerer DC'er fra lymfeknuder. Dette er imidlertid teknisk udfordrende, især i mus. Antallet af DC'er opnået til efterfølgende analyse er også en begrænsende faktor.
På trods af mange tidligere undersøgelser af huden DC migration, er der stadig en mangel på oplysninger om hud DC mobilisering til DLN efter vaccination med Bacille Calmette-Guérin (BCG), den levende, svækket stamme af Mycobacterium bovis anvendes til at vaccinere mod M. tuberkulose. BCG inokuleres i huden, hvilket medfører en begrænset infektion, der udløser en T-hjælper-celle type 1 respons. Både DC delpopulationer, der mobiliserer til DLN fra BCG-inficerede hud og de faktorer, der regulerer deres vandring i løbet af denne proces er ikke fuldt forstået. På baggrund af ovenstående blev en enkel, men hidtil ukendt fremgangsmåde udvikles, hvor fluorochromet 5- og 6-carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) injiceres in situ at spore migreringen af DC'er i DLN 3. C57BL / 6 mus injiceres i bagpote med et inokulum på BCG og dagen før aflivning blev dyrene injiceret i den samme trædepude med en høj koncentration af CFSE. Fireogtyve timer senere aflives dyrene, og drænende popliteale LN (PLN) fjernet og forberedt for flowcytometri. Dette assay muliggør identification af celler, der vandrer natten over fra trædepuden huden til DLN (figur 1).
Desuden kan gen-målrettede mus anvendes til at hjælpe med at identificere faktorer, der kræves for celler at mobilisere til DLN. Anvendelse af dette assay har forfatterne af denne rapport tidligere fundet, at EpCAM lav CD11b høj vandrende hud DC'er transport BCG til DLN i en proces reguleres af interleukin-1-receptor og det intracellulære adapter molekyle MyD88 3. Protokollen for dette CFSE-baserede migration assay, som stammer fra ovennævnte rapport fra Bollampalli et al. 3, hvor flowcytometri blev anvendt til at detektere og analysere vandrende hud DC'er, er beskrevet heri. Fordelene og ulemperne ved dette assay er diskuteret.
Protocol
BEMÆRK: C67BL / 6 mus blev anvendt til eksperimenterne er vist i dette håndskrift. Disse dyr var hus under specifikke patogenfrie forhold på MTC dyr facilitet, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. Dyreforsøg blev udført i henhold til de direktiver og retningslinjer fra svenske landbrugsstyrelse, den svenske Animal Protection Agency, og Karolinska Institutet. Eksperimenter blev godkendt af Stockholm North Dyreetiske Råd.
1. Udarbejdelse af CFSE Aktier og opbevaring
- Forbered en 5 mM bestand af 5- og 6-carboxyfluorescein diacetat succinimidylesteren (CFSE) i dimethylsulfoxid. Vortex. Dispenser 100 pi prøver i sterile, 0,5 ml skruelåg mikrorør. Opbevar portioner ved -80 ° C.
2. Mus
- Brug indavlede han- eller hunmus, mellem 8 og 12 uger gamle. Køns- og alders-matchede dyr foretrækkes. Sørg de nødvendige dyr etiske tilladelser are på plads inden indledningen af eksperimenter.
3. Immobilisering af dyr med Isofluran Gas Anæstesi
- Læg anæstesi enhed med isofluran. Fyld 10 ml gastæt glassprøjte med isofluran. Undgå indføre luftbobler. Tilslut sprøjten og væskeindløbet med den medfølgende slange og flyt pusher fremad, indtil væsken i studsen er synligt lige ved at komme ind i fordamperen.
BEMÆRK: Opbevar ikke isofluran i sprøjten, når den ikke er i brug. - Bedøver dyr med isofluran i induktionen kammer, med en luftmængde holdes ved ca. 400 - 500 ml / min, og koncentrationen af isofluran på 3,5%.
BEMÆRK: Enheden vil ikke fungere uden luftstrøm. - Når dyrene sover, tænde for stophanen på anæstesi enhed til at dirigere isofluran gas til masken stykke. Kontroller at masken brik er intakt for at undgå udsivning af gas. Luftstrømmen kan opretholdes på 400 ml / min, alternativt faldt til 200 ml / min. Reducer isofluran koncentration til 2,6%.
BEMÆRK: anæstetiske virkning kan øges og / eller formindskes ved at justere strømningshastigheden.
4. BCG Injektioner og Recovery
- Visuelt bekræfte og udføre test som f.eks tå knivspids refleks test at fastslå, at mus immobiliseres / søvn på isofluran maske stykke, før du udfører injektioner.
- Indpodes i bagpote, 1 x 10 6 kolonidannende enheder af Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) i 30 pi PBS ved anvendelse af en sprøjte udstyret med en 29 G x ½ inch nål.
BEMÆRK: Produktion af mycobakterielle lagre er kort beskrevet i den oprindelige beskrivelse af denne procedure 3, og i væsentlig detalje andetsteds 6. BCG er også let tilgængelige fra kommercielle kilder. Forfatterne anbefaler, at BCG være puls-ultralydbehandlet eller ledes gennem en sprøjte til at forstyrre klumper før sine inoculatipå i mus. BCG er gentaget her som en mikrobielle stimuli givet sin ansættelse i den oprindelige beskrivelse af denne protokol 3, men forfatterne sikkert fremme afprøvning af andre mikrobielle stimuli. - Udfør den samme procedure som beskrevet ovenfor til injektion af PBS i kontrolmus.
- Overvåg dyr efter injektioner at bekræfte, at genopretning af anæstesi er vellykket, og at dyr kan forsørge sig selv på den injicerede, bagbenstrædepude.
5. CFSE Injektioner
- Forberedelse af CFSE til injektionsvæsker:
- Optø et hætteglas med 5 mM CFSE stamopløsning fra -80 ° C. Fortynd CFSE 10 gange i PBS. Resuspender opløsningen grundigt, før sprøjten fyldes i forberedelse til injektion.
- CFSE Injection and Recovery:
- Gentag proceduren for at bedøve dyr i afsnit 3. Injicer 20 ul 0,5 mM CFSE i bagpote som tidligere modtog BCG eller PBS.
- Gentag proceduren for at bedøve dyr i afsnit 3. Injicer 20 ul 0,5 mM CFSE i bagpote som tidligere modtog BCG eller PBS.
6. Kirurgisk Fjernelse af knæhaselymfeknuderne lymfeknuder (PLN)
Bemærk: Brug af steriliserede kirurgiske instrumenter og deres gentagne dekontaminering i 70% ethanol opfordres hele dette trin.
- Aflive musene. Spray dyret med 70% ethanol. Pin dyret i dorsale beliggenhed, ved en dissektion bord.
BEMÆRK: Forfatterne kan anbefale eutanasi gennem cervikal dislokation. - gøre forsigtigt en lodret snit i hind låret. Klar muskler og fedt ved hjælp af saks og pincet til at afsløre og dermed udskære PLN ligger dybt i fedtstoffet pose, i knæhasen.
- Overfør PLN til 0,5 ml sterilt PBS, på is.
7. generation af Single-celle Suspension fra PLN
- Homogenisere PLN gennem en 70-micron cellefilter placed i en 6 brønd-plade indeholdende 5 ml PBS eller fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) buffer (PBS indeholdende 2% føtalt kalveserum (FCS), 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 1 mM natriumazid). Homogeniseres gennem sien under anvendelse bagenden af en 3 ml sprøjte.
BEMÆRK: Natriumazid er giftigt og bør håndteres med forsigtighed. - Vask sien med yderligere 5 ml PBS eller FACS buffer, indsamle materialet i en 15 ml rør og pelletere cellerne ved 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C. Alternativt, homogenisere pLNs direkte i mikrocentrifugerør hjælp polypropylen homogenisatorer.
- Baseret på pelleten størrelse, resuspender PLN suspension i en passende volumen af PBS eller FACS buffer, fx 200 - 1.000 pi. Brug en tællekammer at bestemme den samlede celleantal opnået fra hver LN suspension. Brug trypanblåt at udelukke døde / døende celler.
8. Cell Farvning og flowcytometri
- transfer 1 - 10 x 10 6 celler til 5 ml rundbundet polystyrenrør. Vask med FACS buffer, og pellet ved centrifugering ved 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C.
- Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 50 - 100 pi antistof cocktail (se dendritisk celle [DC] markører anvendes til overfladefarvning, Materialetabel) indeholdende 0,5 - 1 ug anti-muse CD16 / CD32 (for at blokere uspecifik Fc-medieret interaktioner) i FACS-buffer i 30 - 45 min på is. Beskytte prøver fra lys.
- Efter inkubation vaskes cellerne med FACS buffer og pellet ved centrifugering ved 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) i 5 min, 4 ° C.
- Resuspender celler i 50 - 100 pi FACS buffer. Erhverve data på et flowcytometer 7-10.
BEMÆRK: For fremragende anmeldelser på flowcytometri henvises læseren til følgende publikationer, som relay både teoretisk og praktisk information om denne metode.
Representative Results
Den CFSE-baserede migration assay (figur 1) blev anvendt sammen med flowcytometri til at opdage og karakterisere de CFSE-mærkede celler, der vises i PLN efter BCG-infektion i trædepuden. En stor del af CFSE mærkning i PLN findes på MHC-II høj og CD11c + / lave celler (figur 2A), i overensstemmelse med hud DC'er, der er migreret til huden DLN 11. Både hyppigheden og samlede antal CFSE-mærket, MHC-II høj CD11c + / lave celler forøges i pLNs fra BCG-inficerede mus sammenlignet med PBS-injicerede kontroller (figur 2B-C), hvilket antyder, at BCG forbedrer flytning af disse celler til DLN. Da dette assay måler migration løbet af en 24-timers periode, var det muligt at fastslå, at huden DC'er stadig ind i DLN 5 dage efter infektion (figur 2C). Dette udvider DC migration i den nuværende model langt ud over tidslinjen til indledende activatipå af antigenspecifikke CD4 + T-celler i PLN 3. Endvidere vandrende hud DC'er udtrykker forhøjede niveauer af co-stimulerende molekyler CD80 og CD86 (figur 2D). Dette er i overensstemmelse med tidligere observationer fra huden eksplantatkulturer og FITC hud maleri 11, understøtter det koncept, at vandrende DC'er er aktiverede celler. Vigtigere, både LN-hjemmehørende DCs (MHC-II + CD11c høje celler) og plasmacytoide DC'er (MHC-II lav CD11c lave PDCA-1 + celler), der træder betændte LN gennem højendotelvenoler og ikke afferente lymfekar 12, hvor negativ for CFSE (figur 2EF), hvilket tyder faktisk, at CFSE mærkning forekom hovedsageligt i trædepuden.
I betragtning af, at MHC-II høj CD11c + / lav celler repræsenterer ikke én, men flere DC subpopulationer 13, de ekstra overflademarkører CD103, EpCAM (CD326) og CD11b indgik i antistoffarvning panel anvendes til flowcytometrisk detektion (Materialer tabel) for yderligere at karakterisere populationen af migrerende DC'er (figur 3). Herved blev en underpopulation af EpCAM lave CD11b høje celler identificeret som de vigtigste vandrende hud DC delmængde som reaktion på BCG infektion (figur 3).
De flowcytometriske data vist her blev erhvervet på et flowcytometer udstyret med 4 lasere (488, 532, 640 og 405 nm). Dataene blev analyseret med celle analysesoftware. Andre flerfarvede flowcytometre end den der er angivet i Materials tabel kan anvendes for at kunne afsløre af de i de ovennævnte undersøgelser markører, eller påvisning af andre markører på andre celletyper for den sags skyld. For protokollen beskrevet heri, en cytometer stand til at påvise 6 forskellige fluorokromer er necessary. Vigtigere er de kloner for hvert antistof anvendes specificeret (Materialer Table). Valget af fluorchrom konjugat skal overvejes, da dette kan afhænge af laserne og påvisningsmetoder kanaler på flowcytometer tilgængelige. Ligeledes skal titreres at fastlægge de mest passende fortyndinger til farvning antistoffer.
Befolkning frekvenser i BCG- og PBS-injicerede prøver blev afbildet og anvendt sammen med samlede celletal til at beregne absolutte antal definerede, gated delmængder af DC'er. Betydningen af forskelle i datagruppen middel blev analyseret ved Student 'st test eller ANOVA eventuelt med en cut-off på p <0,05. Outliers blev udelukket fra analysen efter Grubbs 's test for outliers.
Figur 1. Skitse: BCG Footpad InfektionModel og CFSE-Based Migration analysen. BCG podes i bagpote af C57BL / 6 mus. På forskellige tidspunkter efter infektion, og 24 timer før aflivning, er fluorochromet CFSE injiceret i den samme trædepude at tidligere modtagne BCG. Dræningen, popliteale lymfeknude er isoleret og CFSE-mærkede celler er karakteriseret ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. vandrende Skin DC'er er en Major Befolkning Flytte til DLN Efter BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 mus blev inficeret med 1 x 10 6 CFU af BCG i trædepuden. Fireogtyve timer før aflivning blev dyrene injiceret med 0,5 mM CFSE i samme trædepude. Popliteale LN blev høstet, homogenisereti enkelt-cellesuspensioner og underkastet strømningscytometri. For målinger foretaget 1 dag efter BCG blev CFSE injiceret 2 timer efter BCG. (A og B) Zebra plots viser fremherskende ekspression af CFSE på MHCII høje og CD11c + / lave celler i BCG-drænende PLN 3 dage efter infektion. (C) Frekvens og samlede antal CFSE-mærket MHCII høj CD11c + / lave celler i PLN fra BCG- og PBS-injicerede mus blev afbildet på forskellige tidspunkter. (D) Mean fluorescensintensiteten (MFI) for CD80 og CD86 blev bestemt på CFSE + og CFSE neg MHC-II høj CD11c hud DCs + / lav i PLN 3 dage efter BCG-infektion. (E) CFSE udtryk inden for hud DCs (MHC-II høj CD11c + / lav), LN-resident DCs (MHC-II + CD11c høj) og (F) plasmacytoide udviklingslandene (MHC-II lav CD11c lav PDCA-1 +)blev bestemt ved flowcytometri 3 dage efter BCG. For hvert eksperiment blev mindst 5 mus anvendes til BCG-inficerede grupper og 3 for PBS-injicerede kontroller. Streger indikerer standardafvigelser på middelværdien. Samlet antal CFSE-mærkede celler inden for hver undergruppe er givet i Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 tre. * Angiver statistisk signifikante forskelle mellem BCG-smittede og PBS-kontroller. En af to uafhængige forsøg er vist. Figur tilpasset fra Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, med tilladelse fra udgiveren Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. EpCAM lav CD11b høje udviklingslandene er Main Skin DC Subset Trafficking til DLN Efter BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 mus blev injiceret med BCG og CFSE som i figur 2. (A) Zebra plots viser gating anvendte strategi (øverste panel) og hyppigheden af CFSE + -celler inden for hver, defineret undergruppe på forskellige tidspunkter efter BCG infektion (nederste paneler). Frekvenser inden hver delmængde kan variere efter det tidspunkt efter infektion. Efter 3 dage med BCG kan man forvente at finde ca. 0,2% MHC-II høj CD11c + / lave celler blandt alle LN-celler. Af disse var ca. 6% er CD103 + celler. For delmængderne inden MHC-II høj CD103 negativ gate, kan man finde ca. 42% CD11b høj EpCAM lave celler, 27% CD11b lav EpCAM lave celler og 7% LC'ere. (B) Total antal CFSE + celler i hver, defineret undergruppe på forskellige tidspunkter efter BCG infektion er vist. For hver experiment blev mindst 5 mus anvendes til BCG-inficerede grupper og 3 for PBS-kontroller. Streger indikerer standardafvigelser på middelværdien. * Angiver statistisk signifikante forskelle i forhold til PBS-injicerede kontroller. En af tre uafhængige forsøg er vist. Figur re-udskrives fra Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, med tilladelse fra udgiveren Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
noDCs er specialiserede antigen-præsenterende celler, som kan reagere på mikrobiel udfordring på kroppens overflader ved at erhverve mikrobiel antigen og migrere til DLN via lymfekarrene. Der, DC'er præsentere dette antigen til T-celler på en måde, der driver de primære T-celleresponser. Processen med DC migration fra væv til DLN er derfor meget vigtigt for at forstå hvordan en produktiv T-celle-respons initieres. Metoder til at måle DC migration er derfor meget nyttige i at udfolde ovenstående.
En musemodel blev anvendt til at studere huden DC migration til DLN efter infektion med BCG, en levende vaccine, der injiceres klinisk i huden. I tråd, er BCG injiceres i bagbenstrædepude at efterligne denne kutan rute for vaccination. En simpel analyse blev udviklet og derfor indført til denne model til at undersøge migration af huden DC delpopulationer fra BCG podningsstedet i trædepuden huden til dræning PLN. Denne protokol relies om indsprøjtning af fluorokrom CFSE i den samme trædepude at tidligere modtagne BCG og derefter isolering af den drænende PLN 24 timer senere for at analysere tilstedeværelsen af CFSE-mærkede celler ved flowcytometri. Selvom det ikke er beskrevet i protokollen, kan LN fra denne opsætning også være forberedt til analyse ved konfokal mikroskopi, for at studere migration processer såsom placeringen af migrerende celler i LN 3. Desuden lignende resultater på BCG-udløst hud DC migration er blevet opnået, ved hjælp af både BCG Pasteur 1173P2 3 og BCG SSI 1331 14.
CFSE er almindeligt anvendt til at mærke celler in vitro og at spore sådanne mærkede celler in vivo efter celle overførsler 15. I den nuværende protokol dog, blev det brugt til direkte mærke hudceller in situ. Den molekylære basis for CFSE mærkning ligner FITC, som også er en amin-reaktivt fluorescerende farvestof. CFSE er imidlertid foretrukket frem FITC til konjugation som det creAtes meget stabile carboxamidderivater obligationer 16. Desuden CFSE er stærkt membran permeabel og passivt diffunderer ind i celler. Når du er inde, det danner intracellulær amin (fluorescerende) konjugater, der bevares i den mærkede celle 15.
Den CFSE-baserede migration assay udviklet af forfatterne muliggør identifikation af celler, flytter fra hud til DLN inden for en 24-timers periode som reaktion på BCG. Den måler således akut migration under en defineret tidsramme, og gør det muligt at undersøge muligheden af forskellige, injicerede stimuli til at udløse migration. Dette assay er forskellig fra den klassiske teknik med FITC hudpensling, som måler en kumulativ migration begivenhed udløses af kutan, topisk påføring af en kontakt-sensibiliserende middel. Således kan CFSE-baserede migration assay anvendes til at identificere vandrende hud DC'er eller andre celler, hjem til PLN efter injektionen af mikrober, mikrobielle produkter eller andre inflammatoriske stimuli i footpad. Faktisk både neutrofiler og γ: har A T celler vist sig at flytte fra huden til DLN som reaktion på BCG 17,18. Faktisk blev analysen nylig brugt i en co-infektion indstilling til at vise, at en gut-lokaliseret nematode-infektion kunne slå BCG-udløst hud DC migration til DLN 14.
DC migration er ofte vurderes mellem 24 til 72 timer i FITC hudpensling siden FITC-mærkede DC'er er vanskelige at opdage 4 til 5 dage efter at male 19. Tab af CFSE signalet på mærket udviklingslandene er ikke et problem i analysen præsenteres her siden analyse af migration var begrænset til 24 timer; Grunden til dette er, at forfatterne ville specifikt studere "overnight" migration begivenheder. Andre interesserede i denne analyse er dog opfordres til at undersøge tidligere eller endda senere tidspunkter for CFSE-baserede tracking. Eftersom CFSE introduceres ved injektion, kan gives på et defineret tidspunkt. Denne fleksibilitet tillod enuthors at vurdere DC migration mellem dag 5 og 6 efter BCG-infektion (figur 2C) 3. Intravenøse CFSE potentielt kunne begrænse de celletyper tilgængelige in situ til mærkningsreaktionen. For eksempel Langerhanske celler (LCS), som er DC'er, der findes i det øverste lag af huden, epidermis, migrerer dårligt som reaktion på BCG i CFSE-baserede migration assay (figur 3) 3. Men under FITC hudpensling, DC'er placeret i dermis, laget under epidermis, let mærkes og migrere til DLN hurtigere end LC'ere 20,21. Dette antyder, at celler kan blive fluorochrommærkede uden nødvendigvis at skulle lokalisere til laget af huden, hvor mærkningen opløsningen påføres.
Som model for BCG-infektion, muse øre giver en bona fide intradermal rute podning, der er mere på linje med den kliniske administration af BCG som tuberkulose vaccine. footpad injektion på den anden side, er sandsynligvis en kombination af den intradermale og subkutane veje. Som sagt, det kræver dygtighed og uddannelse til korrekt og reproducerbart levere BCG til dermis 22, så i klinisk praksis kan det ikke altid gives virkelig intradermal men snarere subkutan eller en kombination af begge. Som en podningsstedet trædepuden har dog to meget klare fordele over øret der fortjener at nævne. Først er immunresponset koncentreret til dræning PLN efter en trædepudeinjektion og dette letter undersøgelsen af svarene. Forfatterne til denne rapport fundet PLN at være den første og vigtigste LN dræne trædepuden 3. Andre har foreslået split dræning mellem popliteale og subiliac LN efter injektion af Evans blå 23. Men i forhold til øret, der er mere end én øre DLN i mus, og disse kan ikke være regelmæssigt til stede eller let at lokalisere 24. Sidstnævnte klart introducerer en LIABility i undersøgelser, der søger at undersøge reaktioner i DLN. For det andet kan større mængder blive inokuleret i trædepuden (på 10 - 50 pi) i forhold til øret. Dette vil til gengæld både minimerer ansvar for at indføre større ændringer i lymfe flow og for at skulle arbejde med meget små injektionsvolumener, hvilket er et problem i sig selv, når det kommer til at pode store mængder mykobakterier. I øret, hvor injektionsvolumener skal være lille (1-10 pi), kan endda 5 pi ændre lymfe flow og potentielt tvinge en større mængde af det injicerede materiale direkte ind i DLN sig ukontrolleret. Det er derfor vigtigt at tage højde for injektionsvolumener. Dette er især vigtigt i forsøg rettet bidraget af celler i færger bakterier til LN. I BCG trædepude-modellen, kan nogle BCG har nået DLN i fravær af cellulære transport. Dette er baseret på den iagttagelse, at man stadig kan detektere BCG i DLN af mus, hvor cellemigrering fra fodenpuden blev fuldstændig ablateres ved lokal injektion af pertussis toksin 3. Om dette er en indikation af, at BCG direkte adgang lymfekar og nå DLN i et ægte cellefri måde skal stadig bestemmes, da det ikke kan udelukkes, at mykobakterier i dette tilfælde, hvor får adgang til lymfekarrene med magt af det injicerede volumen.
En praktisk overvejelse for immuniseringer i øret eller trædepuden er, at dyr har at være tilstrækkeligt immobiliseret til injektion skal udføres korrekt og på en reproducerbar måde. Isofluran gas er beskrevet i den nuværende protokol som en metode til at begrænse dyr som forberedelse til trædepuden injektioner. De relativt hurtig induktion og nyttiggørelse tider for isofluran-medierede anæstesi gør det en populær metode, men ligner andre bedøvelsesmidler, det påvirker fysiologi, der kan forstyrre eksperimentelle resultater 25. Faktisk både flygtige og injicerbare anæstetika sænke lymfeknuder flow ved at afskaffefrivillige muskelbevægelser, reducere muskeltonus, og faldende lymphangion sammentrækning 26. Desuden har en 5 gange reduktion i migrationen til DLN af DC'er adoptivt overført i trædepuden blevet rapporteret i bedøvede dyr 27. På baggrund af ovenstående og da procedurerne forud for anæstesi håndtering kan forårsage mere stress for dyrene end injektionen selv, som er både hurtig at administrere og kræver ikke et opsving skridt, at muligheden tilstrækkeligt begrænse dyret uden bedøvelsesmidler bør blive overvejet. En mus harpiksstopperen tilpasset trædepuden injektioner, hvor dyret kan hurtigt bragt til en immobiliseret position og inokuleret i trædepuden inden for 30 til 40 sekunder ville være ideelt at injicere mus i bagpote uden at ændre andre aspekter af dens fysiologi i processen , og ville være meget nyttigt i undersøgelser vedrørende celle migration gennem lymfekarrene.
Afslutningsvis denne rapportfremhæver en ny protokol til sporing hud udviklingslandene under deres mobilisering til DLN ved hjælp af en analyse, der overvåger migration under en defineret 24-timers-vinduet. Denne CFSE-baserede migration analysen muliggør detektion og analyse af migrerende celler ved flowcytometri som beskrevet her, såvel som ved konfokal mikroskopi 3. Den giver en fleksibel platform til at undersøge forskellige injicerede stimuli og deres evne til at udløse DC migration, og vigtigere, kan anvendes til at spore ikke blot DC'er men også andre befolkningsgrupper, der flytter fra hud til DLN under forskellige eksperimentelle indstillinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
| 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) |
Invitrogen | C1157 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Bacille Calmette-Guérin (BCG) | strain Pasteur, in house | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| EDTA | In house | ||
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | In house | ||
| Filtered water | In house | ||
| BD Plastipak 3 ml syringe | BD Medical Surgical Systems | 309658 | alternative: 5 ml syringe |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 15 ml centrifuge tubes | TPP | 91015 | Polypropylene |
| 5 ml round bottom tubes | BD Falcon | 3272948 | Polystyrene |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Monojet 3/10 ml syringe | Medicarrier | 8881511144 | 29 G x 1/2 in. |
| Sterile filter unit | TPP | 99500 | PES membrane |
| EPPI-Pistill homogenizer | Schuett biotech | 3.200 512 | Polypropylene |
| Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B01145 | |
| Bürker counting chamber | VWR | 631-0920 | |
| 0.5 ml screw cap microtube | Sarstedt | 72.730 | Polypropylene |
| 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube | VWR | 700-5239 | Polypropylene |
| 70 micron cell strainers | VWR | 734-0003 | |
| BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software | BD Biosciences | Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed | |
| FlowJo cell analysis software | Tree Star | ||
| Antibody | Clone | Company | |
| MHC-II I-A/I-E | M5/114.15.2 | BD Biosciences | |
| CD11b | M1/70 | BD Biosciences | |
| CD11c | HL3 | BD Biosciences | |
| CD16/CD32 (Fc-block) | 2.4G2 | BD Biosciences | |
| CD326/EpCAM | G8.8 | Biolegend | |
| CD103 | 2E7 | Biolegend | |
| CD80 | 16-10A1 | Biolegend | |
| CD86 | GL-1 | Biolegend |
References
- Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206 (2015).
- Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
- Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11 (2007).
- Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1 (2002).
- Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3 (2001).
- Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
- Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
- Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
- Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9 (2009).
- Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
- Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
- Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
- Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
- Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).
