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Immunology and Infection

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con Published: October 9, 2016 doi: 10.3791/54620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

Abstract

Las células dendríticas (DC) son importantes para la iniciación de la respuesta inmune, en parte, a través de su capacidad para adquirir y antígeno de transporte al ganglio linfático de drenaje (DLN). La movilización de los países en desarrollo a la DLN es compleja y aún no se ha aclarado por completo durante la infección. En este documento se describe el uso de un ensayo innovador, simple que se basa en el fluorocromo 5- y éster de diacetato succinimidil 6-carboxifluoresceína (CFSE) para realizar un seguimiento de la migración de los DC durante la infección de la almohadilla plantar con Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (BCG) en ratones C57BL / 6 ratones. Este ensayo permite la caracterización de la piel DC subpoblaciones que se trasladan activamente para el drenaje, LN poplítea en respuesta a BCG. Este protocolo se origina a partir de un modelo de BCG donde DCs piel migratorias se identificaron por citometría de flujo. El ensayo es amigable con el estudio y la identificación de los países en desarrollo o de otras células que alberga la LN poplítea después de la inoculación de microbios, de sus metabolitos o de otro inflamatoriaestímulos en el almohadilla de la pata, y en consecuencia para estudiar los factores que regulan la migración de estas células.

Introduction

DCs localizadas en las superficies del cuerpo detectan microbios o sus productos, y al hacerlo, se movilizan a través de los vasos linfáticos en el LN de drenaje (DLN) 1,2. Se necesita esta reubicación para el transporte de antígeno microbiano a la DLN y la consiguiente cebado de la respuesta inmune a la microbio invasor. De hecho, el bloqueo o el fracaso de los DC para migran desde el tejido infectado a la DLN silencia la respuesta de células T 3-5. En consecuencia, ensayos diseñados para realizar un seguimiento de la migración a nivel de una sola célula son útiles para ayudar a atribuir función migratoria a un subconjunto DC dado.

Hay una gran cantidad de datos sobre la movilización de las DC de la piel a la DLN. Este último representa para muchos de los conocimientos sobre la migración de CC de sitios inflamados o infectados 2. Esto no es sorprendente ya que la piel contiene una gran población de los países en desarrollo y es una superficie muy accesible para la experimentación en el ratón de laboratorio. Varias técnicas de este modo se han desarrollado para evaluarla migración de las CD de murino de la piel para el DLN 2. pintura de la piel FITC es, con mucho, el método más comúnmente utilizado. En este ensayo la fluoresceína-5-isotiocianato de fluorocromo (FITC) se prepara en una mezcla con acetona y un irritante de contacto. Este cóctel se aplica a la piel depilada o afeitado y la acumulación de células marcadas con FITC es a su vez analizado en el DLN. La migración también puede ser estudiada mediante la inyección de la piel con nanopartículas o micropartículas fluorocromo marcado, que permite el seguimiento de las células fagocíticas que han internalizado las partículas fluorescentes en la piel. Los vasos linfáticos también pueden ser canulados para extraer directamente los DC que emigran de la linfa. Esto es sin embargo técnicamente difícil, especialmente en los ratones. El número de países en desarrollo obtenidos para el análisis posterior es también un factor limitante.

A pesar de que muchos estudios anteriores sobre la migración de CC de la piel, sigue habiendo una escasez de información con respecto a la movilización de la piel de CC a DLN siguiente vaccinación con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG), la cepa viva atenuada de Mycobacterium bovis utiliza para vacunar contra M. tuberculosis. BCG se inocula en la piel, causando una infección limitada que desencadena una T de tipo 1 de la célula ayudante respuesta. Tanto las subpoblaciones de DC que movilizan a la DLN de la piel infectada con BCG y los factores que regulan su migración durante este proceso no se entienden completamente. A la luz de lo anterior, se desarrolló un método simple pero novela donde se inyecta el éster fluorocromo de 5 y 6-diacetato de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) in situ para realizar un seguimiento de la migración de las CD en el DLN 3. Ratones C57BL / 6 se inyectaron en la almohadilla de la pata trasera con un inóculo de la vacuna BCG y el día antes del sacrificio, los animales se inyectaron en la misma almohadilla de la pata con una alta concentración de CFSE. Veinticuatro horas después, los animales se sacrifican y el LN poplíteo de drenaje (PLN) eliminan y se prepararon para citometría de flujo. Este ensayo permite la identification de las células que migran durante la noche de la piel de la almohadilla plantar a la DLN (Figura 1).

Además, los ratones con genes dirigidos pueden utilizarse para ayudar a identificar los factores necesarios para que las células movilizar a la DLN. Utilizando este ensayo, los autores de este informe han encontrado previamente que EpCAM baja CD11b alta migratoria BCG transporte de los países en desarrollo de la piel a la DLN en un proceso regulado por la interleucina-1 receptor intracelular y el adaptador molécula de MyD88 3. El protocolo de este ensayo de migración basada en la CFSE que se origina en el informe anterior por Bollampalli y col. 3, donde se utilizó citometría de flujo para detectar y analizar los DC piel migratorias, se describe en el presente documento. Se discuten las ventajas y desventajas de este ensayo.

Protocol

NOTA: C67BL / 6 ratones fueron utilizados para los experimentos mostrados en este manuscrito. Estos animales fueron casa bajo condiciones libres de patógenos específicos en las instalaciones de animales de MTC, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices y lineamientos de la Dirección Nacional de Agricultura, la Agencia de Protección de Animales de Suecia, y el Instituto Karolinska. Los experimentos fueron aprobados por el Consejo de Ética Animal del Norte de Estocolmo.

1. Preparación de las poblaciones de CFSE y almacenamiento

  1. Preparar una solución madre 5 mM de éster de diacetato de succinimidilo de 5 y 6-carboxifluoresceína (CFSE) en sulfóxido de dimetilo. Vórtice. Agregue 100 ml de alícuotas en recipientes estériles de 0,5 ml microtubos tornillo de tapa. almacenar alícuotas a -80 ° C.

2. Los ratones

  1. Utilice los ratones de ambos sexos consanguínea o entre 8 y 12 semanas de edad. Se prefieren animales por sexo y de la misma edad. Asegúrese de que los permisos éticos animales necesarios are en su lugar antes de la iniciación de los experimentos.

3. La inmovilización de los animales con isoflurano Gas Anestesia

  1. Cargar la unidad de la anestesia con isoflurano. Llene la jeringa de vidrio de 10 ml hermética a los gases con isoflurano. Evitar la introducción de burbujas de aire. Conectar la jeringa y la entrada de líquido con el tubo suministrado y mover el empujador hacia adelante hasta que el líquido en el tubo de conexión es visible a punto de entrar en el vaporizador.
    NOTA: No almacene isoflurano en la jeringa cuando no esté en uso.
  2. Anestesiar los animales con isoflurano en la cámara de inducción, con un flujo de aire mantiene a aproximadamente 400 a 500 ml / min y la concentración de isoflurano al 3,5%.
    NOTA: La unidad no funcionará sin flujo de aire.
  3. Una vez que los animales están dormidos, gire la llave de paso en la unidad de anestesia para encaminar el gas isoflurano a la pieza de máscara. Compruebe que la pieza está intacto máscara para evitar la fuga de gas. El flujo de aire se puede mantener a 400 ml / min, alternativamente se redujo a 200 ml / min. Reducir la concentración de isoflurano al 2,6%.
    NOTA: efecto anestésico se puede aumentar y / o disminuir mediante el ajuste de la velocidad de flujo.

4. BCG Inyecciones y Recuperación

  1. Visualmente confirmar y realizar pruebas como la prueba del pellizco reflejo de los pies para comprobar que los ratones se inmovilizan / dormido en la pieza máscara isoflurano antes de realizar inyecciones.
  2. Inocular en la pata trasera, 1 x 10 6 unidades formadoras de colonias de Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (BCG) en 30 l de PBS utilizando una jeringa provista de un 29 G x ½ pulgada de la aguja.
    NOTA: La generación de las poblaciones de micobacterias se describe brevemente en la descripción original de este procedimiento 3, y en detalle en otras partes: 6. BCG también es fácilmente disponible de fuentes comerciales. Los autores recomiendan que BCG ser pulso-sonicado o pasado a través de una jeringa para romper grumos antes de su inoculatien en ratones. BCG se reitera aquí como un estímulo microbianas dan su empleo en la descripción original de este protocolo 3, pero los autores ciertamente fomentar el ensayo de otros estímulos microbianos.
  3. Realice el mismo procedimiento descrito anteriormente para la inyección de PBS en los ratones de control.
  4. Observar a los animales después de las inyecciones de confirmar que la recuperación de la anestesia se realiza correctamente y que los animales pueden mantenerse a sí mismos en la inyectada, pata trasera.

5. Las inyecciones CFSE

  1. Preparación de CFSE para inyección:
    1. Descongelar un vial de 5 CFSE mM solución madre de -80 ° C. Diluir la CFSE 10 veces en PBS. Resuspender bien la solución antes de llenar la jeringa en la preparación para la inyección.
  2. CFSE inyección y recuperación:
    1. Repetir el procedimiento para anestesiar a los animales en la sección 3. Inyectar 20 l de CFSE 0,5 mM en la pata trasera que anteriormente recibió BCG o PBS.

6. La eliminación quirúrgica del poplíteo de ganglios linfáticos (PLN)

NOTA: El uso de instrumentos quirúrgicos esterilizados y su descontaminación repetida en etanol al 70% se anima a lo largo de este paso.

  1. La eutanasia a los ratones. Pulverizar el animal con 70% de etanol. Pin el animal en posición dorsal, en una tabla de disección.
    NOTA: Los autores pueden recomendar la eutanasia a través de la dislocación cervical.
  2. Con cuidado, hacer una incisión vertical en el muslo posterior. Claro muscular y grasa usando tijeras y pinzas para exponer y, en consecuencia escindir las PLN localizan en la profundidad de la bolsa de grasa, en el hueco de la rodilla.
  3. Transferir el PLN a 0,5 ml de PBS estéril, en el hielo.

7. Generación de suspensión de células individuales desde PLN

  1. Homogeneizar el PLN a través de un 70 micrones plac filtro de célulased en un pozo de la placa 6 que contiene 5 ml de PBS o células activadas por fluorescencia (FACS) de tampón (PBS que contiene 2% de suero de ternera fetal (FCS), 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y azida de sodio 1 mM). Homogeneizar a través del filtro usando el extremo posterior de una jeringa de 3 ml.
    NOTA: La azida sódica es tóxica y debe manipularse con precaución.
  2. Lavar el filtro con otros 5 ml de tampón de PBS o FACS, recoger el material en un tubo de 15 ml y sedimentar las células a 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C. Alternativamente, homogeneizar PLNS directamente en tubos de microcentrífuga utilizando homogeneizadores de polipropileno.
  3. Basándose en el tamaño de pellets, resuspender la suspensión PLN en un volumen apropiado de PBS o tampón FACS, por ejemplo, 200 - 1000 l. Utilice una cámara de recuento para cuantificar el número total de células obtenida a partir de cada suspensión LN. Utilice azul de tripano para excluir las células muertas / moribundos.

8. La tinción celular y citometría de flujo

  1. Transfer 1 - 10 x 10 6 células a 5 ml tubos de poliestireno de fondo redondo. Lavado con tampón FACS, y pellet por centrifugación a 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C.
  2. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 - 100 l de cóctel de anticuerpos (ver células dendríticas [DC] marcadores utilizados para la tinción de la superficie, Tabla de Materiales) que contiene 0,5 - 1 mg de anti-ratón CD16 / CD32 (para bloquear Fc mediada inespecífica interacciones) en tampón FACS de 30 - 45 minutos, en hielo. Proteger de la luz.
  3. Después de la incubación, lavar las células con tampón FACS y pellet por centrifugación a 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) durante 5 min, 4 ° C.
  4. Resuspender las células en 50 - 100 l de tampón de FACS. Adquirir datos en un citómetro de flujo 7-10.
    NOTA: Para obtener excelentes críticas en citometría de flujo El lector puede referirse a las siguientes publicaciones que transmiten tanto información teórica y práctica sobre este método.

Representative Results

El ensayo de migración a base de CFSE (Figura 1) se utiliza junto con la citometría de flujo para detectar y caracterizar las células marcadas con CFSE que aparecen en la infección PLN después de BCG en el de la almohadilla plantar. Una gran parte de CFSE etiquetado en el PLN se encuentra en el MHC-II alto y CD11c + / baja células (Figura 2A), en consonancia con los DC de la piel que han migrado a DLN la piel 11. Tanto la frecuencia y el número total de CFSE marcado, MHC-II alta CD11c + / baja células se incrementan en plns de ratones infectados con BCG en comparación con los controles inyectados con PBS (Figura 2B-C), lo que sugiere que la BCG mejora la reubicación de éstos células a la DLN. Desde esta migración ensayo mide durante un período de 24 horas, fue posible establecer que los DC de la piel todavía están entrando en la infección DLN 5 días después (Figura 2C). Esto amplía la migración de CC en el modelo actual más allá de la línea de tiempo para activati ​​inicialen las células T CD4 + específicas de antígeno en el PLN 3. Además, las DC de la piel migratorias expresan niveles elevados de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 (Figura 2D). Esto es consistente con observaciones anteriores de cultivos de explantes de piel y la piel FITC pintura 11, apoyando el concepto de que las DC son células migratorias activadas. DC Es importante destacar que, tanto LN-residentes (células MHC-II + CD11c alto) y DCS plasmocitoide (MHC-II bajo CD11c bajos-1 PDCA + células), que entran en los LN inflamadas través de vénulas de endotelio alto y no linfáticos aferentes 12, donde negativa para CFSE (Figura 2EF), lo que sugiere de hecho que el etiquetado CFSE se produjo principalmente en la almohadilla plantar.

Dado que las células MHC-II + CD11c alta / baja no representan una sino varias subpoblaciones de DC 13, los marcadores de superficie adicionales CD103, EpCAM (CD326) y CD11b se incluyeron en el panel de la tinción de anticuerpos utilizada para la detección de citometría de flujo (Tabla de Materiales) para caracterizar aún más la población de los países en desarrollo migratorias (Figura 3). De este modo, una sub-población de células de alta EpCAM bajas CD11b fue identificado como el principal subconjunto DC piel migratoria en respuesta a la infección por BCG (Figura 3).

Los datos de citometría de flujo se muestran aquí se adquirieron en un citómetro de flujo equipado con 4 rayos láser (488, 532, 640 y 405 nm). Los datos se analizaron con el software de análisis de células. Otros citómetros de flujo de múltiples colores que la especificada en la Tabla de Materiales se pueden emplear para la detección exitosa de los marcadores mencionados en los estudios anteriores, o la detección de otros marcadores, en otros tipos de células para el caso. Para el protocolo descrito en el presente documento, un citómetro capaz de detectar diferentes fluorocromos 6 es necesario. Es importante destacar que los clones para cada anticuerpo utilizados están especificados (Tabla de Materiales). La elección de conjugado de fluorocromo necesita ser considerado como este puede depender de los láseres y canales de detección en el citómetro de flujo disponible. Del mismo modo, los anticuerpos deben ser valorada para determinar las diluciones más apropiados para la tinción.

frecuencias de la población en BCG y las muestras inyectadas con PBS y se graficaron utilizan junto con el total de células para calcular los números absolutos de subconjuntos cerrados, definidos de los países en desarrollo. La significación de las diferencias en las medias de grupo de datos se analizaron mediante la prueba t de Student o ANOVA en su caso, con un valor de corte de p <0,05. Los valores atípicos se excluyeron del análisis siguiente prueba de Grubbs 's para los valores atípicos.

Figura 1
Figura 1. Esquema: BCG almohadilla plantar InfecciónModelo y CFSE-Based Migración de ensayo. BCG se inocula en la pata trasera de ratones C57BL / 6. En diferentes puntos de tiempo después de la infección y 24 horas antes del sacrificio, el fluorocromo CFSE se inyecta en la misma almohadilla de la pata que recibió previamente BCG. El drenaje, ganglio linfático poplíteo se aísla y células caracterizadas por el flujo de CFSE marcado con citometría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. DC piel migratorios son una población importante volver a poner a la infección DLN Después de BCG almohadilla plantar. C57BL / 6 ratones fueron infectados con 1 x 10 6 UFC de BCG en la almohadilla plantar. Veinticuatro horas antes del sacrificio, los animales fueron inyectados con CFSE 0,5 mM en la misma almohadilla de la pata. Se recogieron los LN poplíteo homogeneizaronen suspensiones de una sola célula y se sometieron a citometría de flujo. Para las mediciones efectuadas 1 día después de BCG, CFSE se inyectó 2 horas después de BCG. (A y B) parcelas cebra que muestran expresión predominante de CFSE en las células de baja MHCII alta y CD11c + / en BCG-drenaje PLN 3 días después de la infección. (C) frecuencia y el número total de CFSE marcado alta CD11c + MHCII / baja células en PLN de BCG y de los ratones inyectados con PBS se representan gráficamente en diferentes puntos temporales. Se determinó (D) intensidad media de fluorescencia (MFI) para CD80 y CD86 en las DC de la piel + / bajas en PLN 3 días después de la infección con BCG CFSE + y CFSE neg MHC-II CD11c alta. (E) la expresión CFSE dentro de las CD de la piel (MHC-II + CD11c alta / baja), LN-residente DC (MHC-II + CD11c alta) y (F) plasmacytoid países en desarrollo (MHC-II bajo CD11c baja PDCA-1 +)se determinó por citometría de flujo de 3 días después de BCG. Para cada experimento, se utilizaron al menos 5 ratones para los grupos infectados con BCG y 3 para los controles inyectados con PBS. Las barras indican el error estándar de la media. Número total de células marcadas con CFSE dentro de cada subgrupo se dan en Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Indica diferencias estadísticamente significativas entre los controles infectados con BCG y PBS. Uno de los dos experimentos independientes se muestran. Figura adaptada de Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:... E1005206 3, con el permiso del editor Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. EpCAM baja CD11b altas DC son la piel principal DC subconjunto Trafficking a la infección DLN Después de BCG de la almohadilla plantar. C57BL / 6 ratones fueron inyectados con BCG y CFSE como en la Figura 2. parcelas (A) cebra que muestra gating estrategia empleada (panel superior) y la frecuencia de células CFSE + dentro de cada, define subconjunto a diferentes puntos de tiempo después de la infección BCG (paneles inferiores). Las frecuencias dentro de cada subconjunto puede variar dependiendo del punto de tiempo después de la infección. Después de 3 días de BCG uno puede esperar encontrar + / células de baja aproximadamente un 0,2% de MHC-II CD11c alta entre todas las células LN. De estos, aproximadamente el 6% son CD103 + células. Para los subgrupos que se encuentran dentro de la puerta negativa alta CD103 MHC-II, se pueden encontrar aproximadamente 42% de células CD11b alta EpCAM bajos, el 27% de células bajas bajo EpCAM CD11b y 7% CL. (B) se muestran los números totales de CFSE + células dentro de cada uno, subconjunto definido en diferentes puntos temporales después de la infección BCG. Para cada EXPERIMEnt, se utilizaron al menos 5 ratones para los grupos infectados con BCG y 3 para los controles de PBS. Las barras indican el error estándar de la media. * Indica diferencias estadísticamente significativas respecto a los controles inyectados con PBS. Uno de los tres experimentos independientes se muestran. . La figura de Bollampalli et al re-impreso, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3, con el permiso del editor Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

NODC son células presentadoras de antígeno especializadas que pueden responder a la exposición microbiana en las superficies del cuerpo mediante la adquisición de antígeno microbiano y la migración a través de los vasos linfáticos DLN. Allí, DCs presentan este antígeno a las células T de una manera que conduce a respuestas de células T primarias. El proceso de migración de DC a partir de tejido de DLN es por lo tanto muy importante para la comprensión de cómo se inicia una respuesta de células T productiva. Métodos para medir la migración de CC son por lo tanto muy útil en el desarrollo de lo anterior.

Se empleó un modelo de ratón para estudiar la migración de la piel DC a DLN después de la infección con BCG, una vacuna viva que se inyecta en la piel clínicamente. En consonancia, la BCG se inyecta en la pata trasera para imitar esta vía cutánea de la vacunación. Un simple ensayo fue desarrollado y por lo tanto incorpora a este modelo para investigar la migración de la piel DC subpoblaciones desde el punto de inoculación de BCG en la piel de la almohadilla plantar al PLN drenaje. Este protocolo relies en inyectar el fluorocromo CFSE en la misma almohadilla de la pata que recibió previamente BCG y luego aislar el drenaje PLN 24 horas más tarde para analizar la presencia de células marcadas con CFSE por citometría de flujo. Aunque no se describe en el protocolo, los LN de esta configuración también se pueden preparar para el análisis por microscopía confocal, para estudiar los procesos de migración, como el posicionamiento de las células migratorias en la LN 3. Además, los resultados similares en la migración DC piel provocada por BCG han sido obtenidos utilizando tanto BCG Pasteur 1173P2 3 y BCG SSI 1331 14.

CFSE se utiliza comúnmente para marcar las células in vitro y para realizar un seguimiento de este tipo de células marcadas en vivo después de las transferencias de células 15. En el protocolo actual, sin embargo, se utiliza para etiquetar células de la piel directamente in situ. La base molecular de etiquetado CFSE es similar a FITC, que es también un colorante fluorescente reactivo con amina. CFSE Sin embargo se prefiere más de FITC para la conjugación, ya que creAtes bonos carboxamida muy estables 16. Por otra parte, es altamente CFSE membrana permeable y pasivamente se difunde en las células. Una vez dentro, se forma intracelular amina (fluorescente) conjugados que son retenidos en la celda marcada 15.

El ensayo de migración basada en la CFSE desarrollado por los autores permite la identificación de células se trasladan desde la piel hasta DLN en un plazo de 24 horas en respuesta a BCG. Por lo tanto, mide la migración aguda durante un período de tiempo definido y permite investigar la capacidad de los diferentes, inyecta estímulos para desencadenar la migración. Este ensayo es diferente de la técnica clásica de la pintura de la piel FITC, que mide un evento de migración acumulada provocada por cutánea aplicación, tópica de un agente de contacto es sensibilizante. Por lo tanto, el ensayo de migración a base de CFSE se puede emplear para identificar los DC de la piel u otras células migratorias que alberga el PLN después de la inyección de los microbios, productos microbianos u otros estímulos inflamatorios en el footpad. De hecho, tanto los neutrófilos y γ: delta células T se ha demostrado que trasladarse de piel para DLN en respuesta a BCG 17,18. De hecho, el ensayo se utilizó recientemente en un entorno co-infección para mostrar que una infección por nematodos gut-localizada podría silenciar piel migración DC-desencadenó BCG a DLN 14.

La migración de CC se evalúa a menudo entre el 24 a 72 horas en la pintura de la piel desde FITC marcado con FITC-DC son difíciles de detectar de 4 a 5 días después de pintar 19. La pérdida de la señal de CFSE en países en desarrollo marcado no es un problema en el ensayo que aquí se presenta ya que el análisis de la migración se restringió a las 24 horas; la razón detrás de esto es que los autores querían estudiar específicamente "durante la noche" eventos de migración. Otras personas interesadas en este ensayo son, sin embargo les anima a investigar anteriores o incluso posteriores del tiempo de seguimiento basado en la CFSE. Además, dado que CFSE es introducido por inyección se puede administrar en cualquier momento definido. Esta flexibilidad permite que el unautores para evaluar la migración de CC entre los días 5 y 6 después de la infección con BCG (Figura 2 C) 3. Inyectar CFSE potencialmente podría limitar los tipos de células accesibles in situ para la reacción de marcaje. Para las células de Langerhans (CL ejemplo), que son los DC que residen en la capa superior de la piel, la epidermis, migran mal en respuesta a BCG en el ensayo de migración basada en CFSE (Figura 3) 3. Sin embargo, durante la pintura de la piel FITC, países en desarrollo situados en la dermis, la capa debajo de la epidermis, se marcan fácilmente y migrar a la DLN más rápido que las CL 20,21. Esto sugiere que las células pueden llegar a ser marcado con fluorocromo sin necesariamente pueda localizar a la capa de la piel donde se aplica la solución de etiquetado.

Como modelo para la infección por el BCG, la oreja de ratón proporciona una vía intradérmica de buena fe de la inoculación que está más en línea con la administración clínica de la vacuna BCG como una vacuna contra la tuberculosis. foinyección otpad por otra parte, es probable que una combinación de la intradérmica y subcutánea. Dicho esto, requiere habilidad y entrenamiento para entregar correctamente y reproducible BCG a la dermis 22, por lo que en la práctica clínica puede que no siempre se da realmente intradérmica sino más bien subcutánea o una combinación de ambos. Como un sitio de la inoculación de la almohadilla de la pata tiene dos ventajas muy claras sobre la oreja que merecen mención. En primer lugar, la respuesta inmune se concentra en el PLN drenaje después de una inyección de la almohadilla plantar y esto facilita el examen de las respuestas. Los autores de este informe se determinó que el PLN para ser el primero y principal LN drenaje de la almohadilla de la pata 3. Otros han sugerido drenaje división entre los LN poplíteo y subilíacos después de la inyección de azul de Evans 23. Sin embargo, en lo que respecta a la oreja, hay más de un oído DLN en ratones y estos puede no ser regularmente presente o fácil de localizar 24. Este último presenta claramente un liability en los estudios que tratan de investigar las respuestas en DLN. En segundo lugar, los volúmenes más grandes se pueden inocular en la almohadilla de la pata (10 - 50 l) en comparación con la oreja. Esto a su vez minimiza tanto la responsabilidad de introducir modificaciones importantes en el flujo linfático y de tener que trabajar con volúmenes de inyección muy pequeños, lo cual es en sí mismo un problema cuando se trata de inocular grandes cantidades de micobacterias. En la oreja, donde los volúmenes de inyección tienen que ser pequeños (1-10 l), incluso 5 l pueden alterar el flujo linfático y potencialmente obligar a una mayor cantidad de material inyectado directamente en el DLN de una manera incontrolada. Por tanto, es importante tener en cuenta los volúmenes de inyección. Esto es especialmente importante en los experimentos que abordan la contribución de las células en transportar las bacterias a la LN. En el modelo de almohadilla de la pata BCG, algunos BCG puede haber alcanzado el DLN en ausencia de transporte celular. Esto se basa en la observación de que todavía se puede detectar BCG en el DLN de ratones donde la migración celular desde el piealmohadilla se realiza la ablación por completo por inyección local de la toxina pertussis 3. Si esto es una indicación de que BCG puede acceder directamente a los vasos linfáticos y llegar a la DLN de una manera verdaderamente libre de células que queda por determinar, ya que no se puede excluir que las micobacterias en este caso en el que da acceso a los vasos linfáticos por la fuerza del volumen inyectado.

Una consideración práctica de las inmunizaciones en el oído o la almohadilla de la pata es que los animales tienen que ser inmovilizada adecuadamente para las inyecciones se lleven a cabo correctamente y de manera reproducible. el gas isoflurano se describe en el protocolo actual como un método para sujetar a los animales en la preparación para las inyecciones de la almohadilla plantar. Los tiempos de inducción y recuperación relativamente rápidos para la anestesia de isoflurano mediada lo convierten en un método popular, pero similar a otros agentes anestésicos, que afecta a la fisiología, lo que puede interferir con los resultados experimentales 25. De hecho, los anestésicos volátiles e inyectables tanto disminuyen el flujo linfático, aboliendolos movimientos musculares voluntarios, lo que reduce el tono muscular y la disminución de la contracción lymphangion 26. Por otra parte, una reducción de 5 veces en la migración a DLN de DCs adoptivamente transferida en la almohadilla de la pata se ha informado en animales anestesiados 27. Teniendo en cuenta lo anterior, y puesto que los procedimientos de manipulación antes de la anestesia es probable que causen más estrés a los animales que la inyección en sí, que es a la vez rápido de administrar y no requiere una etapa de recuperación, la posibilidad de frenar adecuadamente el animal sin anestesia debe ser considerado. Un retenedor de ratón personalizado para inyecciones plantares, donde el animal puede ser llevado rápidamente a una posición inmovilizada y se inocularon en la almohadilla de la pata dentro de 30 a 40 seg sería ideal para inyectar el ratón en la almohadilla de la pata trasera sin alterar otros aspectos de su fisiología en el proceso de , y sería extremadamente útil en estudios relacionados con la migración celular a través de los vasos linfáticos.

En conclusión, este informedestaca un nuevo protocolo para el seguimiento de los DC de la piel durante su movilización a la DLN utilizando un ensayo que monitorea la migración durante una ventana de 24 horas definido. Este ensayo de migración a base de CFSE permite la detección y el análisis de las células migratorias por citometría de flujo, tal como se detalla aquí, así como por microscopía confocal 3. Proporciona una plataforma flexible para el estudio de una variedad de estímulos inyectados y su capacidad para desencadenar la migración de DC, y esto es importante, se puede emplear para realizar un seguimiento no sólo DCs sino también otras poblaciones se mueven desde la piel a DLN durante diferentes parámetros experimentales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Baxter 1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
(CFSE)		 Invitrogen C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG) strain Pasteur, in house
Trypan blue solution Sigma T8154
EDTA In house
Sodium azide Sigma S2002
PBS In house
Filtered water In house
BD Plastipak 3 ml syringe BD Medical Surgical Systems 309658 alternative: 5 ml syringe 
6 well plates TPP 92006
15 ml centrifuge tubes TPP 91015 Polypropylene
5 ml round bottom tubes BD Falcon 3272948 Polystyrene
Univentor 400 anesthesia unit Univentor 8323001
Monojet 3/10 ml syringe Medicarrier 8881511144 29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit TPP 99500 PES membrane 
EPPI-Pistill homogenizer Schuett biotech 3.200 512 Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B01145
Bürker counting chamber VWR 631-0920
0.5 ml screw cap microtube  Sarstedt 72.730 Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube VWR 700-5239 Polypropylene
70 micron cell strainers VWR 734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software BD Biosciences Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software Tree Star
Antibody Clone Company 
MHC-II I-A/I-E  M5/114.15.2 BD Biosciences
CD11b M1/70 BD Biosciences
CD11c HL3 BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block) 2.4G2 BD Biosciences
CD326/EpCAM G8.8 Biolegend
CD103 2E7 Biolegend
CD80 16-10A1 Biolegend
CD86 GL-1 Biolegend

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References

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Infección No. 116 las células dendríticas etiquetado CFSE la migración los ganglios linfáticos BCG ratón piel
Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin
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Bollampalli, V. P., Nylén, S.,… More

Bollampalli, V. P., Nylén, S., Rothfuchs, A. G. A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (116), e54620, doi:10.3791/54620 (2016).

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