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Cancer Research

पारगमन प्रत्यारोपण माउस myeloproliferative सूजन का मॉडल

Published: December 22, 2016 doi: 10.3791/54624
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

Introduction

पारगमन प्रत्यारोपण चूहों में कैंसर hematologic मॉडल करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस तकनीक को वापस पहला प्रदर्शन है कि बीसीआर-ABL1 के अस्थानिक अभिव्यक्ति ईमानदारी से चूहों 1 में पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया पुनरावृत्ति कर सकता है के लिए डेटिंग माइलॉयड कैंसर के अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है। इस तकनीक को बाद में JAK2 V617F एमपीएल और W515K / एल की व्यापक अध्ययन में मदद की है म्येलोप्रोलिफेरातिवे सूजन (MPN) उत्परिवर्तित।

एमपीएन परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस के overproduction की विशेषता hematologic कैंसर का एक समूह है। इन रोगों आम तौर पर एक hematopoietic स्टेम सेल का प्रतिरूप विस्तार है कि या तो Jak2, एमपीएल, या CALR में एक दैहिक उत्परिवर्तन का अधिग्रहण किया है से उत्पन्न होती हैं। पारगमन प्रत्यारोपण JAK2 V617F एमपीएल और W515K / एल मॉडल प्रदर्शनी polycythemia वेरा और myelofibrosis 2 के नैदानिक सुविधाओं - 5 </ Sup>। हाल ही में, calreticulin-उत्परिवर्तित एमपीएन के एक माउस मॉडल भी पारगमन प्रत्यारोपण विधि 6 के साथ उत्पन्न किया गया है। इन चूहों में वृद्धि हुई प्लेटलेट्स, megakaryocytes की संख्या में वृद्धि, और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस के साथ एक आवश्यक thrombocythemia-तरह की बीमारी का विकास। साथ में, इन मॉडलों न केवल एमपीएन की आणविक रोगजनन में जानकारी हासिल करने का अवसर है, लेकिन यह भी विकसित करने और एक पूर्व नैदानिक ​​सेटिंग में चिकित्सा विज्ञान का अध्ययन करने के लिए क्षमता प्रदान की है।

यह पांडुलिपि CALRdel52 उत्परिवर्तन पर ध्यान देने के साथ पारगमन प्रत्यारोपण कार्यप्रणाली का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है। इस तकनीक retrovirally transduced अस्थि मज्जा की कोशिकाओं उत्परिवर्ती किरणित syngeneic प्राप्तकर्ता चूहों में निर्माण व्यक्त करने का प्रत्यारोपण शामिल है।

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Protocol

इस अध्ययन को मंजूरी दे दी और कैलिफोर्निया इर्विन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति की सिफारिशों के अनुसार बाहर किया गया था। सभी प्रक्रियाओं isoflurane संज्ञाहरण के तहत किया गया था और सभी प्रयासों पीड़ा को कम करने के लिए किए गए थे।

1. Ecotropic Retrovirus की पीढ़ी

  1. कम से कम 1 माइक्रोग्राम / या तो एक व्यावसायिक मैक्सी प्रस्तुत करने का किट या सीज़ियम क्लोराइड शुद्धि का उपयोग कर μl के एक एकाग्रता के साथ उच्च गुणवत्ता वाले plasmids तैयार करें।
    नोट: ये एक MSCV रीढ़ वेक्टर (इस मामले में CALR 7.8) ब्याज की जीन एन्कोडिंग और विकल्प (GFP, नव, आदि) के मार्कर के रूप में अच्छी तरह से एक ecotropic पैकेजिंग प्लाज्मिड, एन्कोडिंग झूठ पोल-वातावरण में शामिल हैं (के लिए भेजा यहाँ प्लाज्मिड के रूप में)।
  2. पिघलना और विस्तार DMEM में कम पारित होने 293T कोशिकाओं 10% FBS और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (D10) के साथ एल glutamine के साथ पूरक। प्लेट 5 एक्स 10 6 एक humidified में एक 10 सेमी टिशू कल्चर का इलाज डिश में कोशिकाओं37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर और 5% सीओ 2।
  3. संस्कृति में 293T कोशिकाओं का विस्तार करें। अभिकर्मक पहले दिन पर, एक वैक्यूम फ्लास्क में 1 मिलीलीटर पीबीएस और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 - कोशिकाओं trypsinize करने के लिए, 2 के लिए एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin जोड़ने और व्यंजन सेते हैं।
  5. trypsinization रोकने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पकवान 3 मिलीग्राम D10 और हस्तांतरण कोशिकाओं जोड़ें। 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
  6. 2 मिलीलीटर D10 में एक वैक्यूम फ्लास्क और resuspend सेल गोली में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  7. एक hemocytometer का उपयोग trypan नीले बहिष्कार से कोशिकाओं की गणना।
  8. बीज वायरस प्रति तीन 10 सेमी टिशू कल्चर का इलाज व्यंजन उत्पन्न में पकवान प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं।
    ध्यान दें: इष्टतम परिणामों के लिए, कोशिकाओं 30 को पार करने की अनुमति नहीं देते - अभिकर्मक या एक गरीब वायरस उपज प्राप्त किया जा सकता है के समय में 50% संगम।
  9. इसके तत्काल बाद अभिकर्मक से पहले,और एक वैक्यूम फ्लास्क में महाप्राण मीडिया 5 मिलीलीटर ताजा D10 के साथ बदलें।
  10. हर 10 सेमी के लिए पेट्री डिश एक व्यक्ति बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब तैयार ट्रांसफ़ेक्ट हो।
  11. पिपेट प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में कम सीरम मीडिया के 760 μl, तो ध्यान से सीधे मीडिया में अभिकर्मक अभिकर्मक के 40 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर टिशू कल्चर हुड में ट्यूबों सेते हैं।
  12. MSCV वेक्टर के 30 माइक्रोग्राम ब्याज की जीन (15 माइक्रोग्राम यदि खाली वेक्टर का उपयोग) के साथ-साथ 5 माइक्रोग्राम प्रत्येक संबंधित ट्यूब के लिए प्लाज्मिड के साथ जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड में कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    नोट: छोटे वैक्टर उच्च वायरल पैदावार हो जाते हैं।
  13. ध्यान से बूंद के लिहाज से अपने संबंधित 10 सेमी पेट्री डिश में प्रत्येक प्रतिक्रिया (लगभग 800 μl) की कुल मात्रा जोड़ने और धीरे मिश्रण करने के लिए पक्ष की ओर से पकवान झुकाव। humidified ऊतक घन में कोशिकाओं लौटेंlture इनक्यूबेटर।
  14. एक 8 घंटे या टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात ऊष्मायन के बाद, एक वैक्यूम फ्लास्क में महाप्राण मीडिया और धीरे ताजा D10 के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  15. 48 घंटा बाद अभिकर्मक पर एक 35 मिलीलीटर सिरिंज में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और सेल मलबे को हटाने के लिए एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फिल्टर।
  16. वैकल्पिक: 293T कोशिकाओं और अतिरिक्त वायरस पर जगह 10 मिलीलीटर ताजा D10 वापस 72 घंटा बाद अभिकर्मक में काटा जा सकता है।
  17. Biohazard बेकार में 293T कोशिकाओं के निपटान जब कोई अतिरिक्त वायरस एकत्र किया जाता है।
  18. एकल उपयोग की मात्रा (उदाहरण के वायरस अनुमापांक के लिए 1 मिलीलीटर या बी.एम. संक्रमण के लिए 6.5 मिलीलीटर के लिए) में अशेष वायरल सतह पर तैरनेवाला। -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान वायरस के साथ फ्लैश फ्रीज वायरस।
    नोट: दोहराया / फ्रीज पिघलना चक्र से बचें क्योंकि वे बहुत वायरस अनुमापांक कम।

2. से फ्लो द्वारा सापेक्ष वायरल अनुमापांक निर्धारित

  1. 3T3 कोशिकाओं पिघलना और D10 में बनाए रखें। संस्कृति एक 10 सेमी में कोशिकाओंऊतक संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में पकवान इलाज किया गया और 5% सीओ 2।
  2. तीन प्रतियों में वायरल अनुमापांक प्रदर्शन करना। कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक वैक्यूम फ्लास्क में 1 मिलीलीटर पीबीएस और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
  3. कोशिकाओं trypsinize करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin जोड़ने और व्यंजन सेते हैं और 5% सीओ 2।
  4. trypsinization रोकने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पकवान 3 मिलीग्राम D10 और हस्तांतरण कोशिकाओं जोड़ें। 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
  5. 2 मिलीलीटर D10 में एक वैक्यूम फ्लास्क और resuspend सेल गोली में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  6. एक hemocytometer का उपयोग trypan नीले बहिष्कार से कोशिकाओं की गणना।
  7. बीज पंद्रह 60 मिमी टिशू कल्चर का इलाज बर्तन में 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 3T3 कोशिकाओं और रातोंरात सेते हैं।
  8. 3, 1:10, 1:30, और 1: 1 मिलीलीटर के कुल में D10 का उपयोग कर Thawed वायरल सतह पर तैरनेवाला के 100 dilutions 1 बनाओ। इसके अलावा एक वायरस मुक्त नियंत्रण शामिल हैं।
  9. मेरे aspirateएक वैक्यूम फ्लास्क में 3T3 कोशिकाओं से व्यास और D10 के 4 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  10. वायरल सतह पर तैरनेवाला के dilutions के साथ 3T3 कोशिकाओं ओवरले और प्रत्येक पकवान 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 48 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  11. निर्धारित बनाने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा रिश्तेदार वायरल अनुमापांक:
    1. कोशिकाओं को धोने के लिए, एक वैक्यूम फ्लास्क में मीडिया aspirate और 5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें।
    2. एक वैक्यूम फ्लास्क में पीबीएस aspirate। 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 2 के लिए - 5 मिनट पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
    3. 3 मिलीग्राम D10 थाली से किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए जोड़ सकते हैं और विंदुक ऊपर और नीचे। 10 मिनट के लिए 400 XG पर एक FACS ट्यूब और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण।
    4. सतह पर तैरनेवाला छानना और 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 10 मिनट और छानना सतह पर तैरनेवाला के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र। 200 μl पीबीएस में Resuspend।
    5. 9 कोशिकामापी एक प्रवाह पर चलाने के लिए कोशिकाओं। टी के भीतर 30,000 घटनाओं - 20,000 के बीच ले लीजिएवह सेल गेट (एफएससी बनाम एसएससी द्वारा निर्धारित) रहते हैं और + GFP और GFP के प्रतिशत की गणना - कोशिकाओं।
      नोट: वायरल अनुमापांक स्वीकार्य माना जाता है जब वायरल सतह पर तैरनेवाला पैदावार कम से कम 50% + GFP 3T3 कोशिकाओं के कमजोर पड़ने 1:30। यदि कम से कम 50% + GFP कोशिकाओं में इस कमजोर पड़ने परिणाम तो सबऑप्टिमल पारगमन परिणाम प्राप्त किया जा सकता है। वायरल अनुमापांक निर्धारित करने के लिए गणना Limon एट अल से अनुकूलित किया गया था। , रक्त (1997) 9।
    6. वायरस अनुमापांक = कण बनाने इकाइयों (pfu) / एमएल = [(GFP + कोशिकाओं की आवृत्ति × 3T3 कोशिकाओं की संख्या) सतह पर तैरनेवाला (एमएल) के / खंड] × कमजोर पड़ने कारक: रिश्तेदार वायरस अनुमापांक निर्धारित करने के लिए, समीकरण का उपयोग करें।

3. transduce दाता अस्थि मज्जा की कोशिकाओं

  1. अस्थि मज्जा के लिए दाता चूहों तैयार करने के लिए (बी एम) फसल, पहले isoflurane vaporizer द्वारा चूहों 5% संयुक्त पूरक के प्रवाह की दर के साथ anesthetize1 एल / मिनट में ऑक्सीजन। पैर चुटकी जवाबदेही का आकलन करने के लिए।
    नोट: दाता चूहों (कम से कम 8 सप्ताह पुराने) (प्रत्यारोपण के लिए 8 दिन पहले) तैयार किया जाना चाहिए 5 दिनों अस्थि मज्जा फसल से पहले। एक दाता चूहों में कम से कम 2 प्राप्तकर्ताओं के लिए पर्याप्त कक्षों प्रदान करेगा।
  2. इंजेक्षन 150 मिलीग्राम / किग्रा एक 27 जी × साढ़े "सुई का उपयोग 5-फ्लूरोरासिल (5-फू) anesthetized चूहों में रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से।
    सावधान! 5-फू एक विरोधी कैंसर chemotherapeutic एजेंट। हमेशा के लिए एक प्रमाणित रासायनिक धूआं हुड या एक ducted जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर 5-फू संभाल। संस्था की प्रयोगशाला और पशु सुरक्षा समिति के साथ परामर्श 5-फू के साथ इलाज चूहों की उचित लेबलिंग निर्धारित करने के लिए।
    1. उसकी तरफ से anesthetized माउस की स्थिति और दोनों अंगूठे और तर्जनी ऐसी है कि आंख सिर से थोड़ा protrudes का उपयोग करके नियंत्रित।
    2. औसत दर्जे का नेत्रकोण करने और उठाव का सामना करना पड़ के साथ सुई पार्श्व के साथ शुरू, एक 45 में सुई डालनेऔसत दर्जे दिशा में कोण ° और जब सुई आधे रास्ते में डाला जाता है बंद करो। धीरे धीरे कोशिकाओं इंजेक्षन और ध्यान से सुई निकालें।
      नोट: इस तकनीक का सही ढंग से किया जाता है, तो आंख से थोड़ा वापस लेना चाहिए और कोई प्रतिरोध सुई प्रविष्टि पर महसूस किया जाना चाहिए।
    3. इस तरह के सूजन या खून बह रहा है के रूप में चोट के किसी भी लक्षण के लिए माउस का परीक्षण करें।
  3. हार्वेस्ट अस्थि मज्जा 5 दिन 5-फू उपचार (प्रत्यारोपण करने के लिए 3 दिन पहले) के बाद।
    1. 1 एल / मिनट में 5% संयुक्त पूरक ऑक्सीजन के प्रवाह की दर के साथ isoflurane vaporizer द्वारा चूहों anesthetize। पैर चुटकी जवाबदेही का आकलन करने के लिए।
    2. ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान। 70% EtOH के साथ उदारता से छिड़काव तक फर गीला हो जाता है द्वारा माउस जीवाणुरहित।
    3. कैंची विदारक का प्रयोग, त्वचा में एक चीरा बनाने और प्रावरणी पैर की मांसपेशियों से दूर काटना। अगले, कूल्हे में फीमर और टिबिया के टखने में विच्छेद करके माउस से दूर पैर काटना।
    4. झुकनाएक 'एल' आकार में पैर और विदारक कैंची के साथ संयुक्त घुटने पर काटने से एक पैर की हड्डी अलग।
    5. प्रत्येक पैर की हड्डी के बाहर का सिरों पर उपास्थि को दूर करने के लिए, विदारक कैंची का उपयोग धीरे पैर की हड्डी के एक छोर की ओर मांसपेशियों परिमार्जन करने के लिए जब तक उपास्थि ख़ाली है।
    6. एक 27 जी एक्स आधा इंच सुई के साथ एक सिरिंज का प्रयोग, फ्लश पीबीएस के साथ एक पैर की हड्डी एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन झिल्ली पर 2% FBS के साथ पूरक। हड्डी तक फ्लश हड्डी काटा कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए सफेद बदल जाता है।
    7. एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में नायलॉन झिल्ली के माध्यम से कोशिकाओं को मैश एक सिरिंज के सवार का प्रयोग करें। अन्य माउस पैर से दोहराएँ।
  4. 400 XG पर 10 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। 5 मिलीलीटर अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) बफर में Resuspend बीएम लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए। 10 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. पीबीएस के साथ ट्यूब भरें सेल को रोकने के लिए। Centri400 XG पर 10 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें 4 डिग्री सेल्सियस पर Fuge कोशिकाओं। सेल चरण को दोहराएँ यदि बी.एम. गोली लाल रंग की है।
  6. 5 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग trypan नीले बहिष्कार से कोशिकाओं की गिनती।
  7. 2 एक्स 10 6 2x पूर्व stim कॉकटेल जिसमें DMEM 20% FBS, एल glutamine, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक के साथ प्रति मीटर की कोशिकाओं में Resuspend कोशिकाओं, आईएल -3 (14 एनजी / एमएल), आईएल -6 (24 एनजी / मिलीलीटर), और एस सी एफ (112 एनजी / एमएल)। प्लेट 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त बी.एम. कोशिकाओं को वायरल सतह पर तैरनेवाला के 2 मिलीलीटर जोड़ें और Polybrene (8 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। 1,500 XG पर 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन प्लेटों तो रात भर टिशू कल्चर इनक्यूबेटर थाली लौटें।
  10. शंक्वाकार ट्यूब में पिपेट सेल निलंबन और 400 XG पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, थाली त्यागने नहीं है। 2 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं ताजा 2x पूर्व stim अच्छी तरह से प्रति कॉकटेल और मूल कुओं में लौटने। कदम 3.7-3.9 दोहरा द्वारा एक 2 एन डी spinoculation प्रदर्शन करना।

4. प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपण दाता कोशिकाओं

  1. घातक खुराक शरीर के कुल विकिरण <बी.एम. कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए 24 घंटा पहले के साथ प्रत्यारोपण के लिए syngeneic प्राप्तकर्ता चूहों को तैयार है।
    नोट: BALB / ग चूहों के लिए घातक खुराक विकिरण आम तौर पर 800-900 cGy और C57B / 6 से 10 के लिए 1,000-1,200 cGy है। खुराक आम तौर पर कम से कम 3-4 घंटे के अलावा दूरी पर विकिरण के दो सत्रों में विभाजित है।
  2. धीरे शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला pipetting द्वारा 6 अच्छी तरह से प्लेटों से 3.11 कदम, फसल transduced दाता कोशिकाओं से जारी रहेगा। पीबीएस के 1 मिलीलीटर अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को जोड़ने के लिए साथ अच्छी तरह से प्रत्येक को धो लें।
  3. वेल्स को 0.05% trypsin के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. कुओं के लिए 1 मिलीलीटर D10 जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा किसी भी शेष कोशिकाओं को अलग। संबंधित ट्यूब कोशिकाओं जोड़े400 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifugation द्वारा 4.2 कदम और गोली से है।
  5. 400 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं को धो लें। 5 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend और गिनती कोशिकाओं trypan नीले बहिष्कार से एक hemocytometer का उपयोग।
    नोट: वेक्टर एक GFP टैग है तो एक प्रवाह कोशिकामापी साथ GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत यों।
  6. चूहों में इंजेक्शन के लिए 100 μl पीबीएस - 50 में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं - 5 एक्स 10 5 Resuspend।
  7. एक बाँझ 27 जी एक्स साढ़े "सुई का उपयोग anesthetized चूहों में रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से कोशिकाओं इंजेक्षन।
    नोट: अन्य इंजेक्शन तकनीक पूंछ-नस, प्लीहा, या ऊरु शामिल हैं।
    1. isoflurane और चुटकी पैर का उपयोग कर जवाबदेही का आकलन करने के लिए माउस anesthetize।
    2. उसकी तरफ से माउस की स्थिति और दोनों अंगूठे और तर्जनी ऐसी है कि आंख सिर से थोड़ा protrudes का उपयोग करके नियंत्रित।
    3. बेवल का सामना करना पड़ के साथ, एन डालनेeedle एक 45 डिग्री के कोण पर औसत दर्जे का नेत्रकोण के लिए पार्श्व।
      नोट: इस तकनीक का सही ढंग से किया जाता है, तो आंख से थोड़ा वापस लेना चाहिए और कोई प्रतिरोध सुई प्रविष्टि पर महसूस किया जाना चाहिए।
    4. इस तरह के सूजन या खून बह रहा है के रूप में चोट के किसी भी लक्षण के लिए माउस का परीक्षण करें।
      नोट: निम्न प्रत्यारोपण चूहों सप्ताह के एक नंबर के लिए निम्न रक्त मायने रखता होगा और इसलिए संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। एंटीबायोटिक दवाओं या अम्लीय पानी के उपयोग के साथ रोकथाम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  8. एक महीने के बाद प्रत्यारोपण, प्रवाह cytometry द्वारा engrafted दाता कोशिकाओं के लिए एक संकेतक के रूप में परिधीय रक्त में% GFP उपाय।
    नोट: अकेले GFP कोशिकाओं के engraftment की सफलता का निर्धारण नहीं कर सकता। वायरल पारगमन विफल हो सकता है अभी तक engraftment हुई हो सकती है। इस मामले में, कोई GFP + कोशिकाओं का पता चला जाएगा, लेकिन प्रतिरोपित कोशिकाओं के engraftment सफल रहा था।
    1. परिधीय रक्त बी के 10 μl ले लोy एक 21 जी एक्स 1 साढ़े "सिरिंज के साथ saphenous पैर की नस puncturing और पीबीएस में 100 मिमी EDTA के लिए इसे जोड़ने जमावट को रोकने के लिए।
    2. 10 मिनट के लिए बर्फ पर खून और lyse करने के लिए 1 मिलीलीटर एसीके जोड़ें। 10 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    3. एक वैक्यूम फ्लास्क में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने सेल को रोकने के लिए 2% FBS के साथ पूरक। 10 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    4. एक वैक्यूम फ्लास्क और 100 μl पीबीएस में resuspend गोली में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला 2% FBS के साथ पूरक।
    5. एक प्रवाह कोशिकामापी पर चलाने के नमूने और जीवित कोशिका गेट (एफएससी बनाम एसएससी द्वारा निर्धारित) के भीतर 300,000 घटनाओं को इकट्ठा करने और + GFP और GFP के प्रतिशत की गणना - 9 कोशिकाओं।
  9. इसके अतिरिक्त 1 महीने के बाद प्रत्यारोपण में, पूर्ण रक्त मायने रखता है (सीबीसी) एक स्वचालित पशु चिकित्सा रुधिर विश्लेषक 18 का उपयोग कर रोग प्रगति की निगरानी के लिए प्रदर्शन करते हैं।
    नोट:% से रोग की निगरानी के लिए जारीपरिधीय रक्त और सीबीसी मासिक में GFP।
  10. प्रयोग को समाप्त करने के लिए, isoflurane और चुटकी पैर का उपयोग कर जवाबदेही का आकलन करने के लिए माउस anesthetize। ग्रीवा अव्यवस्था और फसल प्लीहा और ऊतकविकृतिविज्ञानी के लिए अस्थि मज्जा से माउस बलिदान।
    नोट: प्रयोग की लंबाई व्यक्तिपरक है और समाप्ति की तारीख रोग फेनोटाइप की उम्मीद के आधार पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

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Representative Results

पारगमन प्रत्यारोपण तकनीक कोशिकाओं हित के जीन व्यक्त के साथ प्राप्तकर्ता चूहों की hematopoietic पुनर्गठन में यह परिणाम है। चित्रा 1 calreticulin के पारगमन प्रत्यारोपण माउस मॉडल उत्परिवर्तित एमपीएन के एक सिंहावलोकन पता चलता है। संक्षेप में, CALRwt या CALRdel52 व्यक्त रेट्रोवायरस एक C57B / 6 दाता माउस से बी.एम. कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Transduced कोशिकाओं पहले महीने के बाद प्रत्यारोपण के दौरान होता है विकिरणित C57B / 6 प्राप्तकर्ता माउस और दाता सेल engraftment में प्रत्यारोपित किया जाता है। 10 महीनों के बाद प्रत्यारोपण - एक बीमारी phenotype के साक्ष्य स्पष्ट 3 महीने के बाद प्रत्यारोपण जहां चूहों प्रदर्शनी में वृद्धि हुई है और प्लेटलेट्स megakaryocytes, 6 पर अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस के द्वारा पीछा किया जाता है। दाता कोशिकाओं टीका लगाना करने में विफल रहते हैं, माउस मौत प्रत्यारोपण के बाद पहले 2 हफ्तों के भीतर हो सकता है। इंजेक्शन के दौरान गरीब इंजेक्शन या मानसिक आघात के अलावा, अन्य तकनीकी त्रुटियों transduce के गरीब engraftment पैदा कर सकता हैडी कोशिकाओं या माउस मौत। अगर यह होता है सबसे hematopoietic कोशिकाओं दाता मूल प्राप्तकर्ता के बजाय का हो जाएगा ये प्राप्तकर्ता चूहों के उप इष्टतम विकिरण शामिल हैं। दूसरी ओर, प्राप्तकर्ताओं की अत्यधिक विकिरण विकिरण प्रेरित बीमारी या मौत भी विकसित करने के लिए चूहों का कारण बन सकता है। कम वायरल titers दाता कोशिकाओं के कम संक्रमण दक्षता में परिणाम होगा। एक परिणाम के रूप में दाता कोशिकाओं की संख्या कम ब्याज की जीन व्यक्त करेंगे और इतने चूहों वांछित phenotype प्रदर्शित नहीं हो सकता। इस कारण से, यह महत्वपूर्ण है कि उच्च titers के साथ वायरस दाता कोशिकाओं transduce करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्रा 2 कैसे रिश्तेदार वायरल अनुमापांक% GFP जीवित कोशिका गेट से एकत्र की घटनाओं से गणना की है, जहां की गणना करने के लिए दिखाता है। (: 3 कमजोर पड़ने 1) के रूप में अच्छी तरह से सेल प्रति एक वायरल कणों के साथ titers (1:30, 1:10, और 1: 100 सतह पर तैरनेवाला) चित्रा 2 बी सेल प्रति एक से अधिक वायरल कण के साथ एक अनुमापांक को दिखाता है। आदर्श रूप में, कम से कम 50% GFP + कोशिकाओं detec होगावायरल सतह पर तैरनेवाला के 1:30 कमजोर पड़ने के साथ टेड। चित्रा 3 एक सफल प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता जहां CALRdel52 चूहों में वृद्धि हुई प्लेटलेट्स के साथ एक एमपीएन phenotype दिखा रहे हैं के सबूत से पता चलता है, अस्थि मज्जा में megakaryocytes वृद्धि हुई है, और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस।

आकृति 1
चित्रा 1: myeloproliferative अर्बुद के पारगमन प्रत्यारोपण माउस मॉडल का अवलोकन। प्रत्यारोपण से पहले 2 सप्ताह - ए) Retrovirus पीढ़ी और वायरल अनुमापांक के निर्धारण 1 होता है। बी) डी (-8) (पांच दिन अस्थि मज्जा फसल से पूर्व), दाता चूहों वंश प्रतिबद्ध कोशिकाओं गिरेगा और hematopoietic स्टेम सेल साइकिल चालन के लिए प्रेरित करने के लिए 5-फू के साथ व्यवहार कर रहे हैं। सी) (डी -3) पर, अस्थि मज्जा पैर की हड्डियों से काटा और 2x पूर्व stim रात भर में संवर्धित hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की कोशिका साइकिल चालन प्रेरित है। डी) दाता कोशिकाओं डी (-2) पर वायरल सतह पर तैरनेवाला से संक्रमित हैं और कोशिकाओं 1 सेंट spinoculation के लिए 1.5 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 400 XG पर centrifuged हैं। ई) डी पर (-1), एक 2 एन डी spinoculation दाता कोशिकाओं पर किया जाता है। इसके अतिरिक्त, चूहों मेजबान अस्थि मज्जा कोशिकाओं आला में व्यय करना दाता सेल engraftment के लिए अनुमति देने के लिए विकिरणित हैं। एफ) transduced दाता कोशिकाओं D0 पर विकिरणित syngeneic प्राप्तकर्ता चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है। जी) दाता कोशिकाओं टीका लगाना करने में विफल रहते हैं तो मौत दिन के 12 से घटित होगा - 14 प्रत्यारोपण के बाद यदि घातक खुराक विकिरण इस्तेमाल किया गया है। एच) एमपीएन phenotype के 3 महीने के बाद प्रत्यारोपण से स्पष्ट हो जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: से फ्लो द्वारा वायरल अनुमापांक का निर्धारण। 3T3 कोशिकाओं वायरस और पारगमन दक्षता के विभिन्न सांद्रता से फ्लो के माध्यम से नजर रखी है साथ transduced रहे हैं। के रूप बनाम एसएससी एफएससी द्वारा कल्पना ए) घटनाओं रहते सेल फाटक के भीतर एकत्र कर रहे हैं। मृत कोशिकाओं GFP विश्लेषण से बाहर रखा गया है। बी) Histograms परीक्षण किया वायरल सतह पर तैरनेवाला के प्रत्येक खंड के लिए% GFP दिखा। वायरल अनुमापांक स्वीकार्य है जब 3T3 कोशिकाओं के कम से कम 50% + GFP जब वायरल सतह पर तैरनेवाला के 1:30 कमजोर पड़ने से संक्रमित हैं। कदम 2.11.6 से समीकरण का प्रयोग, वायरल अनुमापांक 400,000 कोशिकाओं के एक सेल गिनती के आधार पर गणना की गई। एक 1:30 कमजोर पड़ने पर वायरल अनुमापांक के लिए गणना इस प्रकार है: [(400,000 x 0.56) / 1) x 30] = 6.72 x 10 6 pfu / मिलीलीटर। 3.7 चरण, वायरल सतह पर तैरनेवाला के 2 मिलीलीटर के साथ 4 x 10 6 कोशिकाओं को संक्रमित प्रत्येक कोशिका 3 वायरल कणों को प्राप्त करने में नतीजा होगा प्रति।Iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सफल दाता सेल engraftment और एमपीएन phenotype के साक्ष्य। किरणित प्राप्तकर्ता 2 सप्ताह से परे जीवित रहने के बाद प्रत्यारोपण चूहों इंजेक्शन कोशिकाओं के सफल engraftment इंगित करता है। ए) प्रत्यारोपित दाता कोशिकाओं परिधीय रक्त में% GFP द्वारा नजर रखी जा सकती है। बी) इसके अतिरिक्त, सीबीसी मायने रखता रोग प्रगति की निगरानी करने के लिए लिया जाना चाहिए। वृद्धि प्लेटलेट्स CALRdel52 में के रूप में जल्दी के रूप में 2 महीने के बाद प्रत्यारोपण का पता चला जब CALRwt और खाली वेक्टर नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं। सी) समाप्ति के समय, CALRdel52 चूहों तिल्ली का बढ़ना () नहीं दिखाया, अस्थि मज्जा hypercellularity, megakaryocy के विस्तार सहित एमपीएन phenotype की क्लासिक सुविधाओं का प्रदर्शनअस्थि मज्जा में टीईएस, और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तकनीकी त्रुटि का कारण बनता है परिणाम
गरीब इंजेक्शन या मानसिक आघात प्रत्यारोपण अस्वीकृति प्रत्यारोपण विफलता
दाता कोशिकाओं की खराब गुणवत्ता प्रत्यारोपण अस्वीकृति प्रत्यारोपण विफलता या मौत
कम वायरस टिटर एचएससी के गरीब पारगमन प्रत्यारोपण विफलता
उच्च विकिरण खुराक विकिरण प्रेरित बीमारी मौत
कम विकिरण Doएसई प्रत्यारोपण अस्वीकृति प्रत्यारोपण विफलता
ओल्ड दाता चूहों (12 सप्ताह) कम एचएससी इनपुट प्रत्यारोपण विफलता

तालिका 1: तकनीकी त्रुटियों कि माउस मौत या प्रत्यारोपण की विफलता का परिणाम कर सकते हैं। इस तालिका और उनके संबद्ध कारण है कि अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल के साथ हो सकता है तकनीकी त्रुटियों के उदाहरण सूचीबद्ध करता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल कैसे चूहों में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के लिए रोग के चालक के रूप में CALRdel52 उत्परिवर्तन के साथ myelofibrosis के लिए प्रगति के साथ एक आवश्यक thrombocythemia-तरह की बीमारी पुनरावृत्ति के एक विस्तृत वर्णन है। बढ़ी हुई प्लेटलेट्स, megakaryocytes के विस्तार, और अस्थि मज्जा फाइब्रोसिस में CALRdel52 परिणाम व्यक्त कोशिकाओं के सफल प्रत्यारोपण। अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण एक multistep प्रक्रिया है, यह कदम जहां तकनीकी त्रुटि ब्याज या यहां तक ​​कि माउस मौत के जीन व्यक्त कोशिकाओं के गरीब engraftment को रोकने के लिए टाला जा सकता है स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

एक सफल पारगमन प्रत्यारोपण मॉडल है कि अक्सर अनदेखी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक वायरस की गुणवत्ता है। उच्च titers के साथ वायरस अच्छा पारगमन दक्षता और रोग के लिए इस प्रकार एक मजबूत आधार की सुविधा, एक वायरस कम अनुमापांक के साथ जुड़े का उपयोग कर कम कोशिकाओं हित के जीन को व्यक्त करने में परिणाम होगा, जबकि। पारगमन efficiency अभिकर्मकों है कि वायरस और polybrene और retronectin के रूप में ऐसी कोशिकाओं के बीच संपर्क बढ़ाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है। एचएससी के पारगमन भी वायरस की उच्च सांद्रता के साथ मुश्किल हो जाता है, ecotropic रेट्रोवायरस केवल कोशिकाओं को विभाजित को संक्रमित करता है। "पूर्व stim" मीडिया (एससीएफ, आईएल -3, और आईएल -6 युक्त) के उद्देश्य के मौन एचएससी की साइकिल के लिए प्रेरित करने के लिए है। lentiviral प्रणाली अगर गैर विभाजित कोशिकाओं के संक्रमण के लिए आवश्यक है एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक और पहलू वायरस पीढ़ी पर एक प्रभाव हो सकता है कि इस्तेमाल किया अभिकर्मक अभिकर्मक के प्रकार है। इष्टतम अभिकर्मक अभिकर्मकों अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए के रूप में सेल विषाक्तता में चिह्नित मतभेद अनुसंधान समूहों के बीच मनाया गया है। अभिकर्मक अभिकर्मक यहां इस्तेमाल कम सेल विषाक्तता के साथ अच्छा वायरल उपज में हुई है। अन्य आम अभिकर्मक अभिकर्मकों कैल्शियम फास्फेट 11 और इस तरह के रूप में FuGENE nonliposomal अभिकर्मक अभिकर्मक शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल के रूप में उपयोग करता प्लाज्मिडमाउस और चूहे के लिए विशिष्ट ऊतक trophisms के साथ पैकेजिंग वेक्टर। पारगमन के प्रत्यारोपण के लिए अन्य पशु मॉडल पर विचार करते हैं, तो व्यापक trophisms साथ अन्य पैकेजिंग वैक्टर भी amphotrophic (माउस, चूहा, मानव) या pantrophic (व्यापक रेंज trophisms) रेट्रोवायरस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के पारगमन-मॉडल के लिए एक अतिरिक्त लाभ की क्षमता दो अलग दाता आबादी के प्रतिस्पर्धी लाभ की जांच या एक साथ ब्याज की प्रत्येक आबादी को नामित करने के लिए अद्वितीय मार्कर का उपयोग करके ब्याज की कई जीनों को व्यक्त करने के लिए है। इस तरह के प्रत्यारोपण अक्सर एक एकीकृत GFP मार्कर के उपयोग से परे दाता कोशिकाओं को ट्रैक करने के congenic C57BL / 6 चूहों का उपयोग। क्योंकि congenic C57BL / 6 चूहों या तो CD45.1 या CD45.2 के लिए ल्युकोसैट मार्कर व्यक्त कर सकते हैं, दाता कोशिकाओं एक पृष्ठभूमि से प्राप्त की और दूसरे में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। इसके अलावा, एक संकर F1 तनाव दोनों CD45.1 और CD45.2 व्यक्त वंश का उत्पादन करने के लिए उत्पन्न किया जा सकतामार्करों। वैकल्पिक रूप से, MSCV रेट्रोवायरल वेक्टर सहित unicistronic (जैसे, झंडा हा) या bicistronic (जैसे, GFP, आरएफपी, YFP, mCherry, hCD4) का निर्माण कई अलग अलग टैग, साथ उपलब्ध है। इन निर्माणों दाता आबादी के बीच भेदभाव सक्षम करने के लिए प्रतिस्पर्धी प्रत्यारोपण में समवर्ती इस्तेमाल किया जा सकता है और स्थितियों में, जहां CD45.1 / CD45.2 अभिव्यक्ति के माध्यम से भेदभाव उपलब्ध नहीं है, इस तरह के BALB / ग माउस तनाव के रूप में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है।

पारगमन के प्रत्यारोपण का एक और लाभ यह रोग दीक्षा के लिए विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के योगदान की जांच करने की क्षमता है। इस प्रोटोकॉल पूरे अस्थि मज्जा का ही पारगमन प्रत्यारोपण का वर्णन करता है, वहीं अन्य प्रयोगात्मक डिजाइन संवर्धन या अलग एचएससी डिब्बों के अलगाव की जरूरत हो सकती। इन मामलों में, दाता कोशिकाओं की संख्या में इस्तेमाल किया विशिष्ट दाता आबादी के हिसाब से अलग अलग होंगे। इसके अतिरिक्त, एक भोले दाता से बचाव कोशिकाओं चाहिएएचएससी engraftment और विस्तार हो सकता है जब तक माउस का समर्थन करने के लिए एक पूरक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। 15 - 2 टेबल विभिन्न अस्थि मज्जा का प्रत्यारोपण के लिए दाता कोशिकाओं की सिफारिश की संख्या डिब्बों 12 रूपरेखा।

प्रकोष्ठों के # / प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता समर्थन कोशिकाओं की # / प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता
पूरे अस्थि मज्जा 500,000-2,000,000 N / A
सी-किट + 1,000-10,000 200,000
लिन-सी किट + Sca -1 + (LKS) 100-10,000 200,000
LKS CD150 + CD48 - सपा 1-100 200,000
LKS CD150 + CD34 - 1-100 200,000

तालिका 2 दाता कोशिकाओं की संख्या प्रत्यारोपण के लिए।

इसके अलावा, माध्यमिक प्रत्यारोपण भी transduced कोशिकाओं की क्षमता क्रमानुसार रोग प्रत्यारोपण का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

पारगमन प्रत्यारोपण एक बहुत बहुमुखी विधि है कि बहुत तेजी से और काफी अधिक लागत प्रभावी, तोड़े, या xenograft मॉडल ट्रांसजेनिक की तुलना में है। यह एक जल्दी से निर्धारित करने के लिए कि क्या ब्याज की जीन एक hematologic द्रोह प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, और एक विवो पूर्व नैदानिक दवाओं का परीक्षण करने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पारगमन प्रत्यारोपण तकनीक के अन्य लाभ यह है कि यह गैर hematopoietic कोशिकाओं में और रेट्रोवायरल प्रविष्टि साइट एक प्रतिरूप मार्कर के रूप में कार्य करता है कि अभिव्यक्ति टाल रहे हैं। इस तकनीक समेत की सीमाएंई transduced जीन की गैर-शारीरिक स्तर और जीन 16,17 के एकीकरण साइट में मतभेद। खाते में ऊपर उल्लेख लाभ और सीमाओं के सभी ले रहा है, पारगमन प्रत्यारोपण ख्यात hematopoietic ओंकोजीन की प्रारंभिक इन विवो मॉडलिंग के लिए स्पष्ट पसंद है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Lines
DMEM Corning MT-10-013-CV
293T cells ATCC CRL-11268
3T3 cells ATCC CRL-1658
Plasmids
EcoPak, also known as pCL-Eco Addgene 12371 Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG) Addgene 20672 Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
Consumables
27 G x 1/2" needles BD 305620
Fetal bovine serum Corning MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Corning MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning MT-25-052-CI Can be homemade
PBS Corning MT-21-031-CV
10 cm dishes Fisher 172931
15 ml conical tubes Fisher 12565268
60 mm dishes Fisher 150288
Polybrene Fisher NC9840454
5-FU Fisher A13456-06
100 µm cell strainers Fisher 22363549
50 ml conical tubes Fisher 12565270
6-well plate Fisher 130184
FACS tubes Fisher 14-959-5
0.45 μm syringe filters Fisher 0974061B
Opti-MEM Gibco 31985-070
ACK buffer Lonza 10-548E Can be homemade
Recombinant murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant murine SCF Peprotech 250-03
X-tremeGENE 9 Roche 6365809001 Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Equipment
BD Accuri C6
X-ray irradiator

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 118 सूजन पारगमन प्रत्यारोपण Retrovirus hematopoietic स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन Hematologic कैंसर myeloproliferative अर्बुद रक्त कैंसर माउस मॉडल पारगमन प्रत्यारोपण Retrovirus hematopoietic स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन Hematologic कैंसर myeloproliferative अर्बुद रक्त कैंसर माउस मॉडल
पारगमन प्रत्यारोपण माउस myeloproliferative सूजन का मॉडल
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Nguyen, T. K., Morse, S. J., Fleischman, A. G. Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm. J. Vis. Exp. (118), e54624, doi:10.3791/54624 (2016).

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