Introduction
形質移植は、マウスにおける血液悪性腫瘍をモデル化するための有用な方法です。この技術は、バックBCR-ABL1の異所性発現が忠実にマウス1に慢性骨髄性白血病を再現できた最初の実証にまでさかのぼる骨髄性悪性疾患を研究するために特に有用となっています。この技術は、その後骨髄増殖性腫瘍（MPN）を変異させJAK2 V617FおよびMPL W515K / Lの広範な研究を促進してきました。
MPNは、成熟骨髄細胞と骨髄線維症の過剰産生を特徴とする血液悪性腫瘍のグループです。これらの疾患は、一般的にはJak2、MPL、またはCALRのいずれかで体細胞変異を獲得した造血幹細胞のクローン性増殖から生じます。形質移植JAK2 V617FおよびMPL W515K / Lモデルの展示真性多血と骨髄線維症2の臨床的特徴- 5 </ SUP>。最近、カルレティキュリン変異MPNのマウスモデルはまた、形質移植法6で生成されています。これらのマウスは、増加した血小板、巨核球数の増加、および骨髄線維症本態性血小板血症のような疾患を発症します。一緒に、これらのモデルはMPNの分子病態だけでなく、前臨床設定において治療薬を開発し、研究するための能力への洞察を得る機会を提供していません。
この原稿はCALRdel52突然変異を中心とした形質導入移植方法論の詳細な説明を提供します。この技術は、変異体が照射同系のレシピエントマウスに構築物を発現するレトロウイルスで形質導入した骨髄細胞の移植を含みます。
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Protocol
本研究では、承認され、カリフォルニア大学アーバイン校で施設内動物管理使用委員会の勧告に準じて行きました。すべての手順は、イソフルラン麻酔下で実施し、すべての努力は苦痛を最小限に抑えるために行われました。
同種指向性レトロウイルスの1世代
- 商用マキシプレップキットまたは塩化セシウム精製のどちらかを使用して、少なくとも1μgの/μlの濃度で高品質のプラスミドを準備します。
注：言及（これらは、（この場合はCALR 7,8）目的の遺伝子をコードするMSCVのバックボーンベクターが含まれており、選択のマーカー（ など GFP、ネオ、）だけでなく、同種指向性パッケージングプラスミド、エンコードギャグ-POL-ENVここでは、プラスミドなど）。 - DMEM中で解凍し、展開した低継代293T細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシン（D10）で、10％FBSおよびL-グルタミンを補充しました。プレート加湿さ10cm組織培養処理皿の中で5×10 6個の細胞組織培養を37℃にてインキュベーター、5％CO 2。
- 培養中の293T細胞を展開します。トランスフェクションの前日には、真空フラスコに1mlのPBSを吸引上清を添加することにより、細胞を洗浄。
- 細胞をトリプシン処理するには、2ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、インキュベート料理を2加湿組織培養インキュベーター中- 3分37℃、5％CO 2。
- トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。
- 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。
- 血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。
- シード生成されたウイルスごとに3つの10cmの組織培養処理皿に皿当たり2×10 6個の細胞。
注 ： -トランスフェクションまたは悪いウイルス収量の時点で50％コンフルエンスを得ることができる最適な結果を得るためには、30を超える細胞が許可されていません。 - すぐにトランスフェクションの前に、真空フラスコに培地を吸引し、5mlの新鮮なD10と交換します。
- すべての10 CMのペトリ皿は、個々の滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブを準備するトランスフェクトします。
- ピペット減少血清培地の760μlの各マイクロ遠心チューブには、慎重に直接メディアへのトランスフェクション試薬の40μlを添加します。 5分間室温で組織培養フード中で管をインキュベートします。
- 目的の遺伝子（空のベクターを用いて、15μgの場合）だけでなく、それぞれのチューブに5μgのプラスミドでMSCVベクター30μgのを追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。さらに15分間組織培養フード中で室温でインキュベートします。
注：小さいベクターは、ウイルスの収量を有する傾向があります。 - 慎重に滴下、そのそれぞれ10センチメートルペトリ皿に各反応（約800μl）を、総容量を追加し、穏やかに混合するために左右に料理を傾けます。加湿した組織のcuに細胞を返しますltureインキュベーター。
- 組織培養インキュベーター中で8時間または一晩のインキュベーション後、静かに吸引真空フラスコにメディアとは、新鮮なD10の10ミリリットルと交換してください。
- 48時間後、トランスフェクション時に35ミリリットル注射器に上清を回収し、細胞破片を除去するために0.45μmの膜でろ過します。
- オプション：バック293T細胞および追加のウイルスに置き10ミリリットル新鮮なD10は72時間トランスフェクション後に収穫することができます。
- 追加のウイルスが回収されない場合、バイオハザード廃棄物中の293T細胞を処分。
- 単回使用量（ウイルス力価のために例えば1ミリリットルまたはBM感染の6.5ミリリットル）にアリコートウイルス上清。 -80℃で液体窒素とストアウイルスによるフラッシュ凍結ウイルス。
注：彼らは非常にウイルス力価を減少させるように繰り返し凍結/融解の繰り返しは避けてください。
2.フローサイトメトリーによって相対ウイルス力価を決定します
- 3T3細胞を解凍し、D10に維持します。 10センチメートル文化細胞加湿した組織培養37℃インキュベーター、5％CO 2で組織培養処理皿。
- 三重でウイルス力価を実行します。細胞を調製するために、真空フラスコに1mlのPBSと吸引上清を添加することによって細胞を洗浄します。
- 細胞をトリプシン処理するために2mlの0.05％トリプシンを追加し、インキュベート皿を加湿組織培養インキュベーター中、37℃で、5％CO 2。
- トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。
- 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。
- 血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。
- シード15 60ミリメートル組織培養処理皿に1×10 5細胞の密度で3T3細胞と一晩インキュベートします。
- 3、1：10、1：30、および1：1ミリリットルの合計にD10を使用して解凍したウイルス上清の100希釈液1を加えます。また、ウイルスフリーコントロールが含まれています。
- 私を吸引真空フラスコに3T3細胞から径とD10の4ミリリットルと交換してください。
- ウイルス上清の希釈液で3T3細胞をオーバーレイし、各ディッシュに最終濃度8μg/ mlとなるようにポリブレンを追加します。 37℃で組織培養インキュベーター中で48時間、5％CO 2インキュベートします。
- フローサイトメトリーによる相対的なウイルス力価を決定します。
- 細胞を洗浄するために、真空フラスコにメディアを吸引し、5ミリリットルのPBSを追加します。
- 真空フラスコにPBSを吸引除去します。 1ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、2、37℃でインキュベート - 5分は皿から細胞を剥離します。
- プレートから残りの細胞を剥離するには、上下3ミリリットルのD10とピペットを追加します。 10分間400×gでFACSチューブと遠心分離機に細胞を移します。
- 上清を除去し、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 10分であり、デカンテーション、上清のための400×gで遠心分離します。 200μlのPBSで再懸濁。
- 9フローサイトメーターで細胞を実行します。トン内3万イベント - 20,000を収集彼は（SSC 対 FSCによって決定される）セルゲートを生き、GFP +およびGFPの割合を計算-細胞を。
注：ウイルス力価が許容できると考えられているときにウイルス上清の収率は、少なくとも50％のGFP + 3T3細胞の1時30希釈。 50％未満のGFP +細胞におけるこの希釈の結果は、その後、次善の変換結果を得ることができる場合。ウイルス力価を決定するための計算は、リモンらから適合させました。 、 ブラッド （1997）9。 - 希釈ファクター×ウイルス力価=粒子形成単位（PFU）/ mlの= [上清の（GFP +細胞の頻度×3T3細胞の数）/容量（ml）]：相対的なウイルス力価を決定するために、式を使用します。
3.伝達のドナー骨髄細胞
- 骨髄（BM）収穫のためのドナーマウスを準備するには、最初の5％を合わせ補足の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔1L /分の酸素。応答性を評価するために足をつまみます。
注：（未満8週齢）ドナーマウス（8日、移植前に）5日前骨髄採取に準備する必要があります。一つのドナーマウスは、少なくとも2つの受信者のために十分な細胞を提供します。 - 注入150ミリグラム/キログラム27 G×½ "針を用いて麻酔したマウスにおける眼窩後部注射による5-フルオロウラシル（5-FU）。
注意！ 5-FUの抗癌化学療法剤。常に認定された化学ヒュームフードやダクトバイオセーフティキャビネット内の5-FUを処理します。 5-FUで処置したマウスの適切なラベル付けを決定するために、金融機関の実験室および動物安全委員会に相談してください。- その側に麻酔をかけたマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。
- 内側眼角へと上向きにベベルと横針で出発し、45時に針を挿入します針が途中まで挿入され、内側方向、停止中の°の角度。ゆっくりと細胞を注入し、慎重に針を外してください。
注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。 - このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。
- 収穫骨髄5日（移植の3日前）、5-FU処置後。
- 1L /分で酸素補給を組み合わせた5％の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔。応答性を評価するために足をつまみます。
- 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。毛皮が濡れになるまで、70％EtOHで寛大に噴霧することにより、マウスを滅菌します。
- 解剖ハサミを使用して、皮膚に切開を行い、離れて足の筋肉から筋膜を分析。次に、ヒップで大腿骨と足首で脛骨を切断することによって、マウスから離れて足を解剖。
- ベンド「L」字型に脚部とは、解剖ハサミで膝関節で切断することにより、各脚の骨を分離します。
- 各脚の骨の遠位端部に軟骨を除去するために、軟骨が解除されるまで、そっと足骨の一端に向かって筋肉をこすり取る際には、解剖ハサミを使用しています。
- 27 Gのx½インチの針と注射器を使用して、PBSと面一に各脚の骨は、50ミリリットルコニカルチューブに100μMのナイロン膜の上に、2％FBSを補充しました。骨まで洗浄骨が採取された細胞の数を最大化するためにホワイトになります。
- 単一細胞懸濁液を得るために、50mLのコニカルチューブにナイロン膜を介して細胞をマッシュシリンジのプランジャーを使用します。他のマウスの足で繰り返します。
- 400×gで10分間4℃で遠心し細胞と上清を捨てます。再懸濁BMを5mlの塩化アンモニウムカリウム（ACK）緩衝液中の赤血球を溶解します。氷上で10分間細胞をインキュベートします。
- 細胞溶解を停止するためにPBSでチューブを埋めます。 Centri400×gで10分間、4℃でFUGE細胞と上清を捨てます。 BMペレットは、赤い色を持っている場合は溶解ステップを繰り返します。
- 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、血球計数器を用いてトリパンブルー排除によって細胞をカウントします。
- DMEM、20％FBS、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充含まれている2回プレstimのカクテルメートルあたり2×10 6個の細胞で細胞を再懸濁し、IL-3（14 ngの/ ml）を、IL-6（24 ngの/ミリリットル）、およびSCF（112 ngの/ mlで）。プレート6ウェルプレート中のウェルあたり2ミリリットル。
- 37℃で一晩細胞をインキュベートし、5％のCO 2。
- 含む各ウェルBM細胞にウイルス上清の2ミリリットルを追加し、ポリブレン（/ミリリットル8μgの）を追加します。 1,500×gで90分間、30℃で回転プレートを一晩組織培養インキュベーターにプレートを戻します。
- 400×gで10分間、4℃でコニカルチューブと遠心分離機にピペット細胞懸濁液、プレートを破棄することはありません。 2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、ウェルあたりの新鮮な2×プレstimのカクテルとオリジナルのウェルに戻ります。 ステップ3.7から3.9を繰り返して、2 番目のスピノキュレーションを実行します。
レシピエントマウスに4移植ドナー細胞
- BM細胞の注入前に致死量の全身照射<24時間で移植用同系レシピエントマウスを準備します。
注 ：BALB / cマウスのための致死量の放射線照射は、一般的に800〜900センチグレイとC57B / 6 10 1,000-1,200 cGyです。用量は、典型的には少なくとも3-4時間間隔を空け照射の二つのセッションに分割されます。 - 優しくコニカルチューブに上清をピペットでステップ3.11、6ウェルプレートから収穫形質導入されたドナー細胞から続きます。残留細胞を回収し、50mlコニカルチューブに追加する1mlのPBSで各ウェルを洗浄します。
- ウェルに0.05％トリプシンを0.5mlを加え、5分間組織培養インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- ウェルに1ミリリットルのD10を追加し、穏やかにピペッティングすることにより、残りの細胞を剥離。それぞれのチューブに細胞を追加400×gで10分間4℃で遠心分離することによって、ステップ4.2およびペレットからの。
- 400×gで10分間4℃でPBSと遠心で細胞を洗浄します。 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、トリパンブルー排除により血球計数器を用いて細胞数を計測します。
注 ：ベクターは、GFPタグを有する場合には、フローサイトメーターを用いてGFP陽性細胞の割合を定量化します。 - マウスに注入するための100μlのPBS - 50で2×10 6細胞- 5×10 5を再懸濁します。
- 滅菌27 Gのx½ "針を用いて麻酔したマウスに眼窩後部注射を介して細胞を注入します。
注：他の注射技術は、尾静脈、脾臓、または大腿骨が含まれます。- 応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を使用して、マウスを麻酔。
- その側にマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。
- 傘を上に向けて、n個の挿入45°の角度で内側眼角に横eedle。
注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。 - このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。
注：次の移植マウスは、数週間のための低血球数を持っているので、感染しやすいでしょう。抗生物質または酸性水を用いて予防を使用することができます。
- 移植後1ヶ月、フローサイトメトリーによる生着したドナー細胞の指標として、末梢血中の％のGFPを測定します。
注：だけではGFPは細胞の移植の成功を決定することはできません。ウイルス形質導入に失敗した可能性があり、まだ生着が発生している可能性があります。この場合には、GFP +細胞が検出されないだろうが、移植細胞の生着が成功しました。- 末梢血Bの10μLを取りますyの21 G×1½ "シリンジで伏在足の静脈を穿刺し、血液凝固を防ぐために、PBS中の100mMのEDTAに追加します。
- 10分間氷上で血液と溶解に1ミリリットルACKを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。
- 上清を吸引し、真空フラスコ中とPBSは、溶解を停止するには、2％のFBSを補充した1ミリリットルを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。
- 100μlのPBS中の真空フラスコ再懸濁ペレット中の上清を吸引し、2％FBSを補充しました。
- フローサイトメーターでサンプルを実行し、（SSC 対 FSCによって決定される）生細胞ゲート内30万イベントを収集し、GFP +およびGFPの割合を計算-セル9を 。
- さらに1ヶ月の移植後に、疾患の進行を監視するために自動化された獣医の血液分析器18を使用して完全血球数（CBC）を行います。
注：％によって病気を監視し続けます毎月の末梢血とCBCでGFP。 - 実験を終了するには、応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を用いてマウスを麻酔。組織病理学のための頸椎脱臼や収穫脾臓および骨髄によってマウスを生け贄に捧げます。
注：この実験の長さは主観的なものであると終了日は、予想される疾患の表現型に基づいて評価されるべきです。
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Representative Results
形質移植技術は、細胞は、目的の遺伝子を発現するレシピエントマウスの造血再構成をもたらします。 図1は、MPN変異したカルレティキュリンの導入-移植マウスモデルの概要を示しています。簡単に言えば、CALRwtまたはCALRdel52を発現しているレトロウイルスはC57B / 6ドナーマウスからのBM細胞を感染させるために使用されます。形質導入した細胞を照射C57B / 6レシピエントマウスおよびドナー細胞の生着に移植された最初の月、移植後の間に起こります。 10ヶ月の移植後 - 疾患表現型の証拠が明らかに3ヶ月をマウスの展示は6で骨髄線維症に続いて、血小板及び巨核球を増加させ、移植後になります。ドナー細胞が生着しなかった場合は、マウスの死は、移植後の最初の2週間以内に発生する可能性があります。注入中貧しい注射または外傷に加えて、他の技術的なエラーが伝達の乏しい生着を引き起こす可能性がありますD細胞またはマウス死亡。これらは、これは、ほとんどの造血細胞を生じた場合、受信者ではなく、ドナー由来であろう、レシピエントマウスの次善の照射が挙げられます。一方、受信者の過剰照射は、照射によって誘導される病気や死を開発するために、マウスを引き起こす可能性があります。低いウイルス力価は、ドナー細胞の低感染効率をもたらします。結果として、ドナー細胞の低い数字は、目的の遺伝子を発現するので、マウスは、所望の表現型を示さないことがあります。このため、高い力価を有するウイルスは、ドナー細胞を形質導入するために使用されることが重要です。 図2は、％GFPは生細胞ゲートから収集されたイベントから計算される相対的なウイルス力価を計算する方法を示しています。 （：3希釈1）ならびに細胞ごとに単一のウイルス粒子と力価（1：30、午前1時10分、および1：100上清） 図2Bは 、複数のウイルス細胞あたりの粒子と力価を示しています。理想的には、少なくとも50％のGFP +細胞はdetecなりウイルス上清の1：30希釈とテッド。 図3は、CALRdel52マウスが増加血小板とMPN表現型を示す成功移植レシピエントの証拠を示し、骨髄中の巨核球の増加、および骨髄線維症。
図1：骨髄増殖性腫瘍の形質導入-移植マウスモデルの概要。 2週間前に移植へ- A）ウイルス力価のレトロウイルスの生成と決意が1 に発生します。 B）D（-8）（5日）、骨髄採取の前に、ドナーマウスを、系統コミット細胞を枯渇させると、造血幹細胞の循環を誘導するために5-FUで処理されます。 D（-3）でC）、骨髄は、造血幹細胞の細胞周期を誘導するために足の骨から採取し、2×プレSTIM一晩中培養します。 D）ドナー細胞 D（-2）にウイルス上清を用いて感染させ、細胞を1 番目のスピノキュレーションのために1.5時間、30℃で400×gで遠心分離します。 D（-1）でE）は 、2 番目のスピノキュレーションは、ドナー細胞上で行われます。さらに、マウスは、ドナー細胞の生着を可能にするために、ホスト骨髄ニッチ内の細胞を枯渇させる照射されます。 F）形質導入ドナー細胞はD0に照射同系のレシピエントマウスに移植されています。 G）ドナー細胞が生着しなかった場合、死は一日12により発生します-致死量の放射線照射が使用されている場合は移植後14。 H）MPN表現型は、3ヶ月後に移植することによって明らかになる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2： フローサイトメトリーによるウイルス力価の決意。 3T3細胞を、フローサイトメトリーを介して監視されたウイルスとの形質導入効率の異なる濃度を用いて形質導入されています。 SSC 対 FSCにより可視化A）イベントは、生細胞ゲート内で収集されます。死細胞は、GFP分析から除外されます。 B）ヒストグラムは、試験したウイルス上清の各ボリュームの％のGFPを示しました。ウイルス力価は、ウイルス上清1:30希釈物に感染したとき、3T3細胞の少なくとも50％がGFP +であるときに許容可能です。ステップ2.11.6の式を用いて、ウイルス力価40万細胞の細胞数に基づいて計算しました。 1：30希釈でウイルス力価の計算は次のとおりです。[（40万のx 0.56）/ 1）×30] = 6.72×10 6 PFU / mlでした。 3ウイルス粒子を受けて、各セルにつながるウイルス上清の2ミリリットルで4×10 6細胞を感染ステップ3.7、パー。ジル/ ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 成功したドナー細胞生着とMPN表現型の証拠。 2週間を超えて移植後の生存照射レシピエントマウスは、注入された細胞の移植の成功を示しています。 A）移植ドナー細胞は、末梢血中の％GFPによってモニターすることができます。 B）また、CBC数は、疾患の進行をモニターするために取られるべきです。 CALRwtおよび空のベクターコントロールと比較した場合、増加した血小板はCALRdel52で早くも2ヶ月移植後に検出されます。 C）終了時には、CALRdel52マウスは、脾腫（図示せず）、骨髄過形成、megakaryocyの拡大を含むMPN表現型の古典的な特徴を示します骨髄中のTES、および骨髄線維症。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 技術的エラー | 原因 | 結果 |
| 悪いインジェクションやトラウマ | 移植片拒絶反応 | 移植障害 |
| ドナー細胞の品質が悪いです | 移植片拒絶反応 | 移植失敗または死 |
| 低ウイルス力価 | HSCの悪い伝達 | 移植障害 |
| 高照射線量 | 照射誘起される病気 | 死 |
| 低照射ドSE | 移植片拒絶反応 | 移植障害 |
| 古いドナーマウス（12週） | 低HSC入力 | 移植障害 |
表1：マウスの死亡または移植の失敗をもたらすことができる技術的なエラー。このテーブルには、骨髄移植プロトコルで発生する可能性がある技術的なエラーの例とそれに関連する原因が示されています。
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Discussion
このプロトコルは、疾患のドライバーとしてCALRdel52変異を有する骨髄線維症への進行と本態性血小板血症のような疾患を再現するために、マウスに骨髄移植を実行する方法の詳細な説明を提供します。増加した血小板、巨核球の拡大、および骨髄線維症にCALRdel52結果を発現する細胞の移植の成功。骨髄移植は、多段階プロセスであるので、技術的なエラーは、目的の遺伝子、あるいはマウスの死亡を発現する細胞の乏しい生着を防止するために回避することができるステップを認めることが重要です。
見落とされがち成功した形質導入 - 移植モデルへの重要な要因は、ウイルスの品質です。低力価に関連したウイルスを使用して、目的の遺伝子を発現する細胞がより少ないことになるのに対し、高い力価を有するウイルスは、良好な形質導入効率、したがって、病気のための強固な基盤を容易にします。形質導入efficiencyは、ウイルスとポリブレンとレトロネクチンような細胞間の接触を増加させる試薬によって向上させることができます。 HSCの形質導入があっても、ウイルスの高濃度では困難であることが知られている、エコトロピックレトロウイルスは、分裂細胞に感染します。 「プレSTIM「メディア（SCF、IL-3、およびIL-6を含む）の目的は、静止状態の造血幹細胞の循環を誘導することです。レンチウイルス系は、非分裂細胞の感染は、必要であれば別のアプローチとして使用することができます。
ウイルスの生成に影響を与えることができる別の要因は、使用されるトランスフェクション試薬の一種です。細胞毒性の著しい差異は、研究群の間で観察されたように、最適なトランスフェクション試薬は、経験的に決定されるべきです。ここで使用されるトランスフェクション試薬は、低細胞毒性との良好なウイルス収量をもたらしました。他の一般的なトランスフェクション試薬は、リン酸カルシウム11などのFugeneなどの非リポソームトランスフェクション試薬を含みます。このプロトコルは、のように、プラスミドを使用していますマウスおよびラットのための特定の組織trophismsとパッケージングベクター。形質導入移植のための他の動物モデルを考慮した場合、より広いtrophisms有する他のパッケージングベクターはまた、両性（マウス、ラット、ヒト）またはpantrophic（広範囲trophisms）レトロウイルスを生成するために使用することができます。
骨髄形質導入 - 移植モデルへの付加的な利点は、能力二つの異なるドナー集団の競争上の優位性を調査したり、関心の各集団を指定するユニークなマーカーを使用することにより、同時に複数の関心の遺伝子を発現させることです。このような移植は、多くの場合、統合されたGFPマーカーの使用を越えてドナー細胞を追跡するためにコンジェニックC57BL / 6マウスを利用しています。コンジェニックC57BL / 6マウスCD45.1またはCD45.2のいずれかのために白血球マーカーを発現することができるので、ドナー細胞は、一つのバックグラウンドから得られ、他に移植することができます。また、ハイブリッドF1株は、CD45.1およびCD45.2の双方を発現する子孫を生成するために生成することができますマーカー。また、MSCVレトロウイルスベクターはunicistronic（ 例えば、FLAG、HA）またはシストロン性（ 例えば 、GFP、RFP、YFP、mCherryを、hCD4）構築物を含む、いくつかの異なるタグを使用してご利用いただけます。これらの構築物は、ドナー集団間の区別を可能にするために競争力のある移植で同時に使用することができ、このようなBALB / cマウス株とCD45.1 / CD45.2の発現を介した分化が利用できない状況で特に有用であることができます。
形質移植のもう一つの利点は、疾患の開始に特定の細胞型の寄与を研究する能力です。このプロトコルは、全骨髄の唯一の伝達移植を説明しているが、他の実験デザインが異なるHSCコンパートメントの濃縮または単離を必要とするかもしれません。これらのケースでは、ドナー細胞の数は、使用される特定のドナー集団に応じて変化するであろう。さらに、ナイーブドナーからの救出細胞がすべきHSCの生着および増殖が起こることができるまで、マウスをサポートするためのサプリメントとして使用されます。 15 - 表2は、様々な骨髄コンパートメント12の移植のためのドナー細胞の推奨数の概要を説明します。
| 細胞/移植レシピエントの＃ | 支持細胞/移植レシピエントの＃ | |
| 全骨髄 | 500,000-2,000,000 | N / A |
| c-kit + | 1,000-10,000 | 20万 |
| 林-のc-kit +のSca-1 +（LKS） | 100〜10,000 | 20万 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 20万 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 20万 |
移植のドナー細胞の表2数。
また、二次移植はまた、直列疾患を移植するために形質導入された細胞の能力を評価するために実施されてもよいです。
形質導入 - 移植は、ノックイン、または異種移植モデルトランスジェニックと比較して、より速く、はるかに多くの費用効率的で汎用性の高い方法です。それは1つが素早く目的の遺伝子は、血液悪性腫瘍を誘導するのに十分であり、そして薬物を試験するためのin vivo前臨床モデルとして使用することができるかどうかを決定することができます。形質移植法の他の利点は、それが、非造血細胞における発現を回避し、レトロウイルス挿入部位にクローンマーカーとして機能することです。この技術はこちらよりの制限事項電子非生理的形質導入遺伝子のレベルおよび遺伝子16,17の組込み部位の違い。アカウントに上記の利点と限界のすべてを取って、形質導入-移植が推定される造血癌遺伝子の最初のin vivoでのモデリングのための当然の選択です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
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