Introduction
Transducción-trasplante es un método útil para modelar neoplasias hematológicas en ratones. Esta técnica ha sido particularmente valiosa para el estudio de las neoplasias mieloides que se remontan a la primera demostración de que la expresión ectópica de BCR-ABL1 podría recapitular fielmente la leucemia mielógena crónica en ratones 1. Esta técnica ha facilitado posteriormente el amplio estudio de JAK2 V617F y MPL W515K / L mutado neoplasias mieloproliferativas (MPN).
NMP son un grupo de neoplasias malignas hematológicas caracterizadas por la sobreproducción de células mieloides maduras y fibrosis de la médula ósea. Estas enfermedades generalmente surgen de la expansión clonal de una célula madre hematopoyética que ha adquirido una mutación somática en cualquiera Jak2, MPL, o CALR. Transducción-trasplante de JAK2 V617F y MPL W515K modelos / L presentan las características clínicas de la policitemia vera y mielofibrosis 2 - 5 </ Sup>. Recientemente, un modelo de ratón de la MPN calreticulin mutado también ha sido generado con el método de la transducción-trasplante 6. Estos ratones desarrollan una enfermedad esencial trombocitemia-como con el aumento de las plaquetas, aumento del número de megacariocitos, y fibrosis de médula ósea. En conjunto, estos modelos no sólo han proporcionado la oportunidad de conocer mejor la patogénesis molecular del MPN, sino también la capacidad para desarrollar y estudiar la terapéutica en un entorno preclínico.
Este manuscrito ofrece una descripción detallada de la metodología de la transducción-trasplante con un enfoque en la mutación CALRdel52. Esta técnica implica el trasplante de células de médula ósea transducidas con retrovirus que expresan el mutante constructo en ratones receptores singénicos irradiados.
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Protocol
Este estudio fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California, Irvine. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflurano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. Generación de Ecotropic Retrovirus
- Preparar plásmidos de alta calidad con una concentración de al menos 1 g / l usando un kit maxi-prep comercial o la purificación de cloruro de cesio.
NOTA: Estos incluyen un vector de MSCV columna vertebral que codifica el gen de interés (en este caso CALR 7,8) y marcador de elección (GFP, Neo, etc.), así como un plásmido de empaquetamiento ecotrópico, codificación gag-pol-env (en lo aquí como plásmido). - Descongelación y expandir las células 293T de bajo pasaje en DMEM suplementado con FBS al 10% y L-glutamina con penicilina / estreptomicina (D10). Placa de 5 x 10 6 células en un tejido de 10 cm placa de cultivo tratadas en una atmósfera humidificadacultura incubadora de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Expandir las células 293T en cultivo. En el día antes de la transfección, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío.
- Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado durante 2 - 3 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10.
- Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
- Semilla de 2 x 10 6 células por placa de 10 cm en tres placas de cultivo de tejidos tratados por el virus generados.
NOTA: Para obtener resultados óptimos, no permita que las células se exceden 30 - 50% de confluencia en el momento de la transfección o un rendimiento deficiente del virus puede ser obtenida. - Inmediatamente antes de la transfección,medios de aspirado en un frasco de vacío y reemplazan con 5 ml de D10 fresco.
- Por cada 10 cm placa de Petri a transfectar preparar un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril individual.
- Pipetear 760 l de medio de suero reducido en cada tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir cuidadosamente 40 l de reactivo de transfección directamente en los medios de comunicación. Incubar los tubos en la campana de cultivo de tejido a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir 30 g de MSCV vector con el gen de interés (15 mg si se utiliza el vector vacío), así como 5 g de plásmido a cada tubo respectivo y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. Se incuba a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido durante 15 min adicionales.
NOTA: Los vectores más pequeños tienden a tener rendimientos virales más altas. - Añadir con cuidado el volumen total de cada reacción (aproximadamente 800 l) gota a gota en su respectiva placa de 10 cm de Petri y se incline suavemente el plato de lado a lado para mezclar. Volver a la cu células del tejido humidificadolture incubadora.
- Después de un 8 hr o incubación durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos, medios de aspirado en un frasco de vacío y suavemente reemplazan con 10 ml de D10 fresco.
- A las 48 horas después de la transfección recoger el líquido sobrenadante en una jeringa de 35 ml y se filtra a través de una membrana de 0,45 micras para eliminar los restos celulares.
- OPCIONAL: Colocar 10 ml de vuelta fresca D10 en las células 293T y el virus adicional puede ser cosechado a 72 horas después de la transfección.
- Disponer de células 293T en residuos biológicos peligrosos cuando se recoge ningún virus adicional.
- sobrenadante viral alícuota en volúmenes de un solo uso (por ejemplo 1 ml para el título del virus o 6,5 ml para la infección BM). virus de flash-congelación con nitrógeno líquido y el virus se almacena a -80 ° C.
NOTA: Evitar ciclos de congelación / descongelación repetidos, ya que reducen en gran medida el título de virus.
2. Determinar el título viral relativa por Citometría de Flujo
- Descongelar las células 3T3 y mantener en D10. Cultivar las células en un 10 cmde cultivo de tejidos plato tratada en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Realizar título viral por triplicado. Para preparar las células, lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y el sobrenadante aspirado en un matraz de vacío.
- Para trypsinize células, añadir 2 ml 0,05% de tripsina y se incuba platos en un incubador de cultivo tisular humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Para detener la tripsinización, añadir 3 ml de D10 a plato y las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células a 400 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante en un frasco de vacío sedimento celular y resuspender en 2 ml de D10.
- Contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
- Seed células 3T3 a una densidad de células de 1 x 10 5 en quince 60 mm placas de cultivo de tejidos tratados e incubar durante la noche.
- Hacer 1: 3, 1:10, 1:30, y 1: 100 diluciones de sobrenadante viral descongelado utilizando D10 en un total de 1 ml. También incluir un control libre de virus.
- me aspirardia de células 3T3 en un matraz de vacío y reemplazar con 4 ml de D10.
- Superposición de las células 3T3 con las diluciones de sobrenadante viral y añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml a cada plato. Incubar durante 48 horas en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO2.
- Determinar el título viral relativa por citometría de flujo:
- Para lavar las células, aspirar los medios de comunicación en un matraz de vacío y añadir 5 ml de PBS.
- Aspirar el PBS en un matraz de vacío. Añadir 1 ml 0,05% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min para separar las células del plato.
- Añadir 3 ml de D10 y la pipeta hacia arriba y abajo para separar las células restantes de la placa. Transferir las células a un tubo de FACS y se centrifuga a 400 xg durante 10 min.
- Decantar el sobrenadante y lavar las células con 3 ml de PBS. Centrifugar a 400 xg durante 10 min y el sobrenadante se decanta. Resuspender en 200 l de PBS.
- Las células se ejecutan en un citómetro de flujo 9. Recoger entre 20.000 - 30.000 eventos dentro de tque viven puerta celular (determinada por el FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP + y - GFP células.
NOTA: El título viral se considera aceptable cuando la dilución 01:30 de los rendimientos de sobrenadante viral por lo menos 50% + GFP células 3T3. Si a continuación, se pueden obtener resultados esta dilución en células GFP menos de 50% + de transducción de resultados subóptimos. El cálculo para determinar el título viral fue adaptado de Limón et al. , Blood (1997) 9. - Para determinar el título de virus relativa, utilice la ecuación: el título del virus = unidades formadoras de partículas (UFP) / ml = [(Número de células 3T3 × Frecuencia de células GFP +) / volumen de sobrenadante (ml)] x Factor de dilución.
3. transducir donantes células de médula ósea
- Para preparar ratones donantes de médula ósea (BM) de la cosecha, primero anestesiar los ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% suplementario combinadode oxígeno a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
NOTA: Los ratones donantes (menos de 8 semanas de edad) se deben preparar 5 días antes de la cosecha de médula ósea (8 días antes del trasplante). Uno ratones donantes proporcionarán suficientes células durante al menos 2 receptores. - Inyectar 150 mg / kg 5-fluorouracilo (5-FU) a través de la inyección de retro-orbital en ratones anestesiados utilizando una × ½ "aguja 27 G.
¡PRECAUCIÓN! 5-FU un agente de quimioterapia contra el cáncer. Siempre maneje 5-FU dentro de una campana de humos química certificado o una cabina de bioseguridad por conductos. Consultar con el comité de seguridad en el laboratorio y animal de la institución para determinar el etiquetado apropiado de los ratones tratados con 5-FU.- Coloque el ratón anestesiado en su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza.
- Comenzando con el lateral de la aguja para el canto medial y con el bisel hacia arriba, inserte la aguja en un 45° de ángulo en la dirección medial y se detendrá cuando se inserta la aguja hasta la mitad. Inyecte lentamente las células y eliminar eliminar cuidadosamente la aguja.
NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja. - Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado.
- Extracción de la médula ósea después de 5 días de tratamiento con 5-FU (3 días antes del trasplante).
- Anestesie ratones por vaporizador de isoflurano con un caudal de 5% de oxígeno suplementario combinado a 1 L / min. Una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
- Sacrificar el ratón por dislocación cervical. Esterilizar ratón pulverizando generosamente con EtOH al 70% hasta que la piel se moja.
- Usando tijeras de disección, hacer una incisión en la piel y la fascia diseccionar lejos de los músculos de las piernas. A continuación, diseccionar la pierna lejos de ratón mediante el corte del fémur en la cadera y la tibia en el tobillo.
- curvala pierna en forma de "L" y separar cada hueso de la pierna por el corte en la articulación de la rodilla con las tijeras de disección.
- Para eliminar el cartílago en los extremos distales de cada hueso de la pierna, utilizar las tijeras de disección muscular para raspar suavemente hacia un extremo del hueso de la pierna hasta que se desacopla del cartílago.
- El uso de una jeringa con una aguja de 27 G x ½ pulgadas, a ras cada hueso de la pierna con PBS suplementado con 2% de FBS sobre una membrana de nylon 100 mM en un tubo cónico de 50 ml. hueso Flush hasta que el hueso se vuelve blanco para maximizar el número de células cosechadas.
- Utilice el émbolo de una jeringa para triturar las células a través de la membrana de nylon en el tubo cónico de 50 ml para obtener una suspensión de células individuales. Repita con la otra pierna del ratón.
- centrifugar las células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Resuspender en tampón BM 5 ml de cloruro de amonio potasio (ACK) para lisar las células rojas de la sangre. Se incuban las células en hielo durante 10 min.
- Llenar el tubo con PBS para detener la lisis celular. CentriFUGE células a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante. Repetir el paso de lisis si el sedimento BM es de color rojo.
- Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células por exclusión de azul de tripano usando un hemocitómetro.
- Resuspender las células a 2 x 10 6 células por m con el coctel pre-stim 2x que contiene DMEM suplementado con 20% de FBS, L-glutamina, penicilina / estreptomicina, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) y SCF (112 ng / ml). Placa de 2 ml por pocillo en placas de 6 pocillos.
- Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2.
- Añadir 2 ml de sobrenadante viral a cada uno de las células BM bien que contienen y añadir polibreno (8 mg / ml). placas de giro a 30 ° C durante 90 minutos a 1.500 xg entonces vuelven a la placa de cultivo de tejidos incubadora durante la noche.
- suspensión celular pipeta en tubos cónicos y se centrifuga a 4 ° C durante 10 minutos a 400 xg, no descartan la placa. Resuspender las células en 2 ml 2x fresco cóctel antes de la estimulación por pozo y volver a los pozos originales. Realizar una espinoculación 2º repitiendo los pasos 3.7-3.9.
4. Las células trasplante de donante en ratones receptores
- Preparar los ratones receptores singénicos para el trasplante con dosis de irradiación corporal total letal <24 h antes de la inyección de células BM.
NOTA: la irradiación Dosis letal para los ratones Balb / c es típicamente 800-900 cGy y 1.000-1.200 cGy para C57B / 6 10. La dosis normalmente se divide en dos sesiones de irradiación espaciadas al menos 3-4 horas de diferencia. - Continuación de la etapa 3.11, las células del donante transducidas cosecha de las placas de 6 pocillos pipeteando suavemente sobrenadante en tubos cónicos. Lavar cada pocillo con 1 ml de PBS para recoger las células residuales y añadir a 50 ml tubos cónicos.
- Añadir 0,5 ml de tripsina al 0,05% a los pocillos y se incuba a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos de 5 min.
- Añadir 1 ml de D10 pozos y retire cualquier resto de las células por pipeteo suave. Añadir células al tubo respectivos de la etapa 4.2 y pellet por centrifugación a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g.
- Lavar las células con PBS y centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 400 x g. Volver a suspender en 5 ml de PBS y contar las células usando un hemocitómetro por exclusión de azul de tripano.
NOTA: Si el vector tiene una etiqueta GFP entonces cuantificar el porcentaje de células positivas para GFP con un citómetro de flujo. - Resuspender 5 x 10 5 - 2 x 10 6 células en 50 - 100 l de PBS para inyección en ratones.
- Inyectar células mediante inyección retro-orbital en ratones anestesiados utilizando un 27 G x ½ "aguja estéril.
NOTA: Otras técnicas incluyen la inyección de cola vena, esplénica, o femoral.- Anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta.
- Coloque el ratón sobre su lado y restringir utilizando tanto el pulgar y el índice tal que el ojo sobresale ligeramente de la cabeza.
- Con el bisel hacia arriba, inserte el nEedle lateral al canto medial en un ángulo de 45 °.
NOTA: Si esta técnica se realiza correctamente, el ojo debe retraerse ligeramente y sin resistencia, deben ser sentidas tras la inserción de la aguja. - Examine el ratón para detectar cualquier signo de daño tales como inflamación o sangrado.
NOTA: los ratones después de un trasplante tendrán recuentos sanguíneos bajos durante un número de semanas y por lo tanto son susceptibles a la infección. La profilaxis con antibióticos o el uso de agua acidificada puede ser utilizado.
- Un mes después del trasplante, medir la GFP% en la sangre periférica como un indicador de las células del donante injertadas por citometría de flujo.
NOTA: GFP sola no puede determinar el éxito de injerto de las células. La transducción viral puede haber fallado sin embargo, el injerto puede haber ocurrido. En este caso, se detectaron células GFP +, pero el injerto de las células trasplantadas se ha realizado correctamente.- Tomar 10 l de sangre periférica by punción de la vena safena de la pierna con un 21 G 1 ½ "x jeringa y añadirlo a EDTA 100 mM en PBS para evitar la coagulación.
- Añadir 1 ml ACK a la sangre y se lisan en hielo durante 10 min. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y se añade 1 ml de PBS suplementado con 2% de FBS para detener la lisis. Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante en un matraz de vacío y pellet se resuspende en 100 l de PBS suplementado con 2% de FBS.
- Ejecutar las muestras en un citómetro de flujo y recoger 300.000 eventos dentro de la puerta de células vivas (determinado por FSC frente a SSC) y calcular el porcentaje de GFP y GFP + - células 9.
- Adicionalmente a 1 mes después del trasplante, realizar recuentos sanguíneos completos (CBC) utilizando un analizador de hematología veterinaria automatizado 18 para controlar la progresión de la enfermedad.
NOTA: Continúe controlando la enfermedad por%GFP en sangre periférica y CBC mensual. - Para terminar el experimento, anestesiar ratón utilizando isoflurano y una pizca de pie para evaluar la capacidad de respuesta. Sacrificio ratón por dislocación cervical y el bazo y la médula ósea de la cosecha para histopatología.
NOTA: La duración del experimento es subjetiva y la fecha de terminación debe ser evaluada en base al fenotipo de la enfermedad se esperaba.
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Representative Results
La técnica de transducción-trasplante resulta en la reconstitución hematopoyética de los ratones receptores con células que expresan el gen de interés. La Figura 1 muestra una visión general del modelo de ratón de transducción-trasplante de calreticulin mutado MPN. Brevemente, retrovirus que expresan CALRwt o CALRdel52 se utiliza para infectar las células BM a partir de un ratón donante C57B / 6. Las células transducidas se trasplantan en irradiado C57B / 6 ratón receptor y el donante del injerto celular que ocurre durante el primer mes posterior al trasplante. La evidencia de un fenotipo de la enfermedad se torna visible 3 meses después del trasplante, donde exhiben los ratones plaquetas y megacariocitos aumentó, seguido de fibrosis de la médula ósea a los 6 - 10 meses después del trasplante. Si las células del donante no pueden injertarse, la muerte del ratón puede ocurrir dentro de las primeras 2 semanas después del trasplante. Además de la inyección pobres o trauma durante la inyección, otros errores técnicos pueden causar una mala injerto de transduced células o la muerte del ratón. Estos incluyen la irradiación sub-óptima de los ratones receptores, si esto ocurre mayoría de las células hematopoyéticas serán de destinatario en lugar de origen del donante. Por otro lado, la irradiación excesiva de los receptores puede causar los ratones de desarrollar la enfermedad inducida por irradiación o incluso la muerte. Los títulos virales bajas darán como resultado una baja eficiencia infección de las células del donante. Como consecuencia números bajos de células del donante expresarán el gen de interés y por lo tanto los ratones no pueden demostrar el fenotipo deseado. Por esta razón, es crucial que el virus con títulos elevados se utiliza para transducir las células del donante. La figura 2 ilustra cómo calcular el título viral relativa donde la GFP% se calcula a partir de eventos recogidos de la puerta de células vivas. La Figura 2B ilustra un título con más de una partícula viral por célula (dilución 1: 3), así como los títulos con partículas virales individuales por célula (01:30, 1:10, y 1: 100 sobrenadante). Idealmente, al menos 50% de células GFP + serían DETECted con 1:30 dilución de sobrenadante viral. La Figura 3 muestra evidencia de un receptor de trasplante con éxito en ratones CALRdel52 exhiben un fenotipo de NMP con un aumento de las plaquetas, el aumento de megacariocitos en la médula ósea, y la fibrosis de médula ósea.
Figura 1: Visión general de la transducción-Trasplante modelo de ratón de mieloproliferativas. A) Generación de retrovirus y la determinación del título viral se produce 1 - 2 semanas antes del trasplante. B) D (-8) (cinco días antes de la extracción de la médula ósea), ratones donantes son tratados con 5-FU para agotar las células de linaje comprometido e inducir el ciclismo de células madre hematopoyéticas. C) En D (-3), la médula ósea se recoge de huesos de la pierna y se cultivaron durante la noche en pre-stim 2x para inducir el ciclo celular de las células madre hematopoyéticas. D) Las células del donante están infectados con sobrenadante viral en D (-2) y las células se centrifugan a 400 xg a 30 ° C durante 1,5 horas para el st espinoculación 1. E) En D (-1), un espinoculación 2º se realiza en las células del donante. Además, los ratones son irradiadas para agotar las células en el nicho de la médula ósea de acogida para permitir el injerto de células donantes. F) las células del donante transducidas se trasplantan en ratones receptores singénicos irradiados en D0. G) Si las células donantes no pueden injertarse entonces la muerte se produce por día 12 - 14 después del trasplante de si la irradiación dosis letal se ha utilizado. H) El fenotipo NMP se hace evidente a los 3 meses después del trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: Determinación de la titulación viral por citometría de flujo. células 3T3 son transducidas con diferentes concentraciones de eficiencia virus y la transducción se controla por medio de citometría de flujo. A) Los eventos son recogidos dentro de la puerta de células vivas como se visualiza por el FSC frente a SSC. Las células muertas se excluyen del análisis GFP. B) Los histogramas muestran GFP% por cada volumen de sobrenadante viral probado. El título viral es aceptable cuando al menos 50% de las células 3T3 son GFP + cuando se infectan con la dilución 1:30 de sobrenadante viral. Usando la ecuación de la etapa 2.11.6, el título viral se calculó sobre la base de un recuento celular de 400.000 células. El cálculo para el título viral en una dilución 1:30 sigue: [(400.000 x 0,56) / 1) x 30] = 6,72 x 10 6 PFU / ml. Por paso 3.7, infectando a 4 x 10 6 células con 2 ml de sobrenadante viral se traduciría en cada celda de recepción 3 partículas virales.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evidencia de la célula por donantes injerto y NMP fenotipo. ratones receptores irradiados que sobreviven más allá de 2 semanas después del trasplante indica éxito del injerto de células inyectadas. A) las células del donante trasplantadas pueden ser monitoreados por% GFP en la sangre periférica. B) Además, el recuento de CBC deben tomar medidas para controlar la progresión de la enfermedad. El aumento de las plaquetas son detectados tan pronto como 2 meses del trasplante en CALRdel52 si se compara con CALRwt y control del vector vacío. C) En el momento de la terminación, los ratones CALRdel52 exhiben características clásicas del fenotipo NMP incluyendo esplenomegalia (no se muestra), hipercelularidad médula ósea, la expansión de megakaryocytes en la médula ósea, y la fibrosis de la médula ósea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Error tecnico | causas | Resultado |
| Inyección pobre o trauma | rechazo del trasplante | La falta de Trasplantes |
| Mala calidad de las células del donante | rechazo del trasplante | El fracaso de trasplante o muerte |
| Bajo el título de virus | Pobre Transducción de HSC | La falta de Trasplantes |
| La irradiación de dosis alta | enfermedad inducida por irradiación | Muerte |
| La irradiación de baja DoSE | rechazo del trasplante | La falta de Trasplantes |
| Los ratones donantes de edad (+12 semanas) | Entrada HSC baja | La falta de Trasplantes |
Tabla 1: errores técnicos que pueden resultar en la muerte del ratón o fracaso del injerto. Esta tabla se muestran ejemplos de errores técnicos y sus causas asociadas que podrían ocurrir con el protocolo de trasplante de médula ósea.
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Discussion
Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo llevar a cabo trasplantes de médula ósea en ratones recapitular una enfermedad esencial trombocitemia-como con la progresión de la mielofibrosis con CALRdel52 mutación como el conductor de la enfermedad. el éxito del trasplante de células que expresan los resultados CALRdel52 en un aumento de las plaquetas, la expansión de megacariocitos, y fibrosis de la médula ósea. A medida que el trasplante de médula ósea es un proceso de varios pasos, es importante reconocer los pasos donde error técnico puede evitarse para prevenir la mala injerto de las células que expresan el gen de interés o incluso la muerte del ratón.
Un factor crítico para un modelo de transducción-trasplante con éxito que a menudo se pasa por alto es la calidad de los virus. Virus con altos títulos facilita una buena eficiencia de la transducción y de este modo una base sólida para la enfermedad, mientras que el uso de un virus asociado con títulos bajos se traducirá en un menor número de células que expresan el gen de interés. effici de transducciónrencia se puede mejorar mediante reactivos que aumentar el contacto entre el virus y las células tales como polibreno y retronectina. La transducción de las CMH se sabe que es difícil incluso con altas concentraciones de virus, retrovirus ecotrópicos sólo infecta a las células en división. El propósito de los medios de comunicación "pre-Stim" (que contienen SCF, IL-3 e IL-6) es inducir el ciclismo de CMH de reposo. El sistema lentiviral podría ser utilizado como un enfoque alternativo si es necesario la infección de células que no se dividen.
Otro factor que puede tener un efecto sobre la generación de virus es el tipo de reactivo de transfección utilizada. reactivos de transfección óptimas deben ser determinadas empíricamente como marcadas diferencias en la toxicidad celular se han observado entre grupos de investigación. El reactivo de transfección utilizada aquí se ha traducido en un buen rendimiento viral con la toxicidad celular baja. Otros reactivos de transfección comunes incluyen fosfato de calcio 11 y reactivo de transfección no liposómica tal como Fugene. Este protocolo utiliza como plásmidoel vector de empaquetamiento con trophisms tejidos específicos para el ratón y la rata. Si tener en cuenta otros modelos animales para la transducción-trasplante, otros vectores de empaquetamiento con trophisms generales también se podrían utilizar para generar anfotrófico (amplias trophisms rango) retrovirus pantrophic (ratón, rata, humana) o.
Una ventaja añadida al modelo de transducción-trasplante de médula ósea es la capacidad de investigar la ventaja competitiva de las dos poblaciones de donantes diferentes o para expresar múltiples genes de interés de forma simultánea mediante el uso de marcadores únicos para designar a cada población de interés. Tales trasplantes menudo utilizan ratones congenic C57BL / 6 para realizar un seguimiento de las células del donante más allá del uso de un marcador de GFP integrado. Debido a ratones C57BL / 6 congenic pueden expresar marcadores de leucocitos, ya sea para CD45.1 o CD45.2, las células del donante se pueden obtener de un fondo y se trasplantan en el otro. Por otra parte, una cepa F1 híbrido puede ser generada para producir descendencia que expresan tanto CD45.1 y CD45.2marcadores. Alternativamente, el vector retroviral MSCV está disponible con varias etiquetas diferentes, incluyendo unicistronic (por ejemplo, FLAG HA) o bicistrónico (por ejemplo, GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) constructos. Estas construcciones se pueden utilizar simultáneamente en trasplantes competitivos para permitir la discriminación entre las poblaciones de donantes y pueden ser especialmente útiles en situaciones en las que la diferenciación a través de la expresión CD45.1 / CD45.2 no está disponible, como el / c cepa de ratón BALB.
Otra ventaja de la transducción del trasplante es la capacidad para investigar las contribuciones de los tipos de células específicas a la iniciación de la enfermedad. Si bien este protocolo describe solamente la transducción del trasplante de médula ósea completa, otros diseños experimentales pueden hacer necesario el enriquecimiento o el aislamiento de los diferentes compartimentos de HSC. En estos casos, el número de células del donante variará en función de la población de donantes específico usado. Además, las células de un donante de rescate ingenuos deberíanser utilizado como un suplemento para apoyar el ratón hasta HSC injerto y la expansión puede ocurrir. La Tabla 2 presenta la cantidad recomendada de las células del donante para el trasplante de la médula ósea varios compartimientos 12 - 15.
| Nº de Células / receptor de trasplante | # De células de sostén / receptor de trasplante | |
| Médula Ósea toda | 500,000-2,000,000 | n / A |
| c-Kit + | 1.000-10.000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10.000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Tabla 2. Número de células del donante para trasplante.
Además, el trasplante secundario también se puede realizar para evaluar la capacidad de las células transducidas para trasplantar en serie enfermedad.
Transducción-trasplante es un método muy versátil que es mucho más rápido y significativamente más rentable en comparación con transgénicos, modelos knock-in, o de xenoinjerto. Le permite a uno determinar rápidamente si el gen de interés es suficiente para inducir una malignidad hematológica, y se puede utilizar como un modelo preclínico in vivo para probar fármacos. Otros beneficios de la técnica de transducción-trasplante son que evita la expresión en células no hematopoyéticas y que el sitio de inserción retroviral sirve como un marcador clonal. Las limitaciones de este INCLUYENDO técnicae niveles no fisiológicos de gen transducido y diferencias en el sitio de integración del gen 16,17. Teniendo en cuenta todos los beneficios y las limitaciones mencionadas anteriormente en cuenta, la transducción-trasplante es la elección obvia para el modelado inicial in vivo de los oncogenes hematopoyéticas putativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
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