Protocol
כל השימושים חיים מאושרים על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.
לדוגמא הכנה 1.
- הזדווגות מתוזמן
- מניחים זכר סוג בר C57BL6 ונקבה יחד באותו כלוב.
- בדוק להיווצרות פקק הזדווגות מוקדם למחרת בבוקר. תוספת ההזדווגות (aka, נרתיק או תקע הזדווגות) היא בתצהיר דביקות מוקשה שחוסם את הנרתיק.
- הגדר את התאריך תקע 0.5 היום העוברי (E0.5).
- בידוד של עוברי עכברים
- להרדים נשים בהריון בחנק CO 2.
- שים עכברים פרקדן על כרית ספיגה ולרסס באזור הבטן עם אתנול 70%.
- הרם את העור ולעשות חתך 5 מ"מ ראשוני באזור בטן הזנב באמצעות מספרי כירורגיות. גזור להסיר עור הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים מלא
- חותכים ליד vaג'ינה להסיר את הרחם כולו.
- חותך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם. מגזר או conceptus כל צריך רק עובר אחד בפנים.
- שמור מגזרי הרחם בופר פוספט קר כקרח 1x (PBS).
- לנתיחה העובר
- מניחים כל conceptus בצלחת נפרדת עם קרים כקרח PBS תחת stereoscope.
- הסר רקמות רחם, שליה ואז ממברנות העובר ברצף באמצעות מלקחיים לנתח בסדר.
- מעביר את העובר גזור לצינור 50 מיליליטר עם קרח 1x PBS הקר בעזרת פיפטה העברה גדולה. הימנע להרים העובר ישירות עם מלקחיים כדי למזער את הנזק לרקמות.
- קיבוע
- תקן את העוברים הגזורים ב 10% פתרון פורמלין שנאגר ניטראלי ב 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -24 שעות עם כרכים מדגמים 10 לפחות של מקבע.
- טיפול מקדים
- הכן את פתרון הסליקה: 4אוריאה M, 10% גליצרול, 4% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) במים מזוקקים פעמיים.
- החלף את מקבע עם פתרון הסליקה.
- בעדינות לסובב את הדגימה על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 1 - 2 שבועות. להחליף את פתרון הסליקה פעם על השני וביום השלישי. הדגימה לאט מתבהרת שקופה.
- החזר את פתרון סליקה עם 10% פורמלין ולהשאיר על כיסא נדנדה עבור 2 ימים.
- התייבשות
- שטפו את דגימות pretreated עם 1x PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- מייבשים דגימות בסדרה אתנול עולה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עדין. עבור עוברי E15.5, השתמש סדרת אתנול עולה כולל 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ו -100% אתנול, 2 שעות כל צעד. עבור עוברים מבוגרים, זמן הדגירה צריך להיות מוגבר.
- הַכתָמָה
- כן הפתרון מכתים: להוסיף 0.1375 גרם Eosin Y Disodium מלח 0.0275 גרם של חמי acridine כתום (כלוריד אבץ) מלח 50 מ"ל של אתנול 100%. מערבבים עבור שעה 2. מסנן עם נייר סינון. אחסן בטמפרטורת החדר ולהימנע האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
- עבר דגימת הפתרון המכתים במשך שעה 1.
- חלף עם פתרון מכתים טרי לילה כתם.
- הִסתַנְנוּת
- הכן פתרון הסתננות: לשלב 100 מ"ל של פתרון א 'ערכת הטבעה JB-4, 1.25 גרם של Catalyst C, 0.275 גרם של מלח Eosin Y Disodium ו 0.055 גרם של חמי acridine כתום מלח (כלוריד אבץ). מערבבים לערבב (200 סל"ד) בתוך דלי קרח במשך 2 שעות, ולאחר מכן לסנן עם נייר סינון.
- אחסן את פתרון ההסתננות ב 4 ° C ולהימנע אור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
- מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון: פתרון מכתים (1: 1), ו דגירה במשך שעה לפחות 3 על כיסא נדנדה ב 4 ° C.
- מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון דגירה במשך 3 שעותr על כיסא נדנדה בחדר קר.
- חלף פתרון הסתננות פעם אחת בכל יום, ולהשאיר בחדר קר על כיסא נדנדה עדינה במשך שלושה ימים נוספים.
Embedding 2.
- שמור פתרון B ו- הסתננות פתרון על הקרח.
- הפוך פתרון והטבעה (01:25 של פתרון B ו- פתרון הסתננות) מיד לפני ההטבעה.
- אוריינט הדגימה בתוך תבנית הטבעה, ואז לשפוך פתרון והטבעה קר לתוך תבנית ההטבעה בעדינות. Re-אוריינט בסיכה במידת הצורך.
- בעזרת מערוך כדי לבדוק אם פתרון והטבעה הוא התגבש. לדחוף את גוש הדגימה, וקוצצים אותו במידת הצורך.
- כיוון מחדש של גוש הדגימה באמצעות עובש נפרד להשיג אוריינטציה צלב.
- שים בעל בלוק על גבי עובש הטבעה. בעדינות יוצקי פתרון והטבעה לתוך התבנית עד העובש בעל לחסום שקוע ידי הטמעת פתרון.
- שמור את הדגימה במיכל משני ולהשאיר אותהעל קרח למשך 3 - 4 שעות במנדף.
- אחסן את הדגימות הקרושה בתוך 4 ° C..
- לקלף את עובש הטבעה. מכניס את הגוש תחת סטראו עם תאורה עקיפה לבדוק עמדה של הדגימה בבלוק. על פניו בלוק, קווי רשת סימן סביב הדגימה.
- חתוך את הבלוק כדי להסיר גישת כמות הטבעת חומר באמצעות קווי רשת המסומנים אזכור.
3. Image Acquisition
- הצמד את בלוק דגימת microtome ולקבל משטח טרי. סעיף עובי הגדר (למשל, e9.5-10.5, 1.5 מיקרומטר; e11.5-12.5, 2.0 מיקרומטר; e13.5-15.5, 2.5 מיקרומטר; E16.5-מבוגרים, 3 מיקרומטר). שמור את הדגימה / לחסום במיקום הבית של microtome.
- הר מיקרוסקופ זום סטריאו אופקי מול פני הבלוק של דגימה.
- הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ, ולהתחיל את תוכנת רכישת התמונה.
- דמיינו ולמקד את אופטיקה לבלוק הפניםתחת מצב "תצוגה חיה" של תוכנת הדמיה.
- יישר מיקרוסקופ microtome במידת הצורך כך פנים בלוק הוא במרכז הכוונת.
- התאם זום כך לחסום הפנים כולו בתוך העינית.
- בחר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן (עירור 470 ± 20 ננומטר, dichroic 495 ננומטר, פליטת 525 ± 25 ננומטר) ולמקד במידת הצורך.
- מדוד ולהגדיר את זמן החשיפה באופן ידני (למשל, 80 - 400 מינים שניות).
- לרכוש תמונות של פנים בלוק אחרי כל טריים ולשמור תמונות באופן אוטומטי במידת האפשר.
- שיא פרמטרים חשובים כוללים רזולוציה, עובי הסעיף וזום.
- לאחר שסיים את הדגימה כולה, ייצוא להמיר את כל קבצי תמונה בפורמט JPEG במידת הצורך.
- הפוך את כל התמונות המקוריות באמצעות תוכנת עיבוד הדמיה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות.
- שמור את כל התמונות מעובדות בתיקייה נפרדת.
3D 4.רְאִיָה
- העלה את כל התמונות מעובדות תוכנה להדמית 3D ביצוע ההוראות.
- רזולוציית הקלט ועובי סעיף להמיר את כל התמונות כדי נתוני נפח (כלומר, voxel גודל) ולשמור את הקובץ 3D.
- יישר את כל התמונות באמצעות במצב האוטומטי. התאם תמונות בודדות באופן ידני במידת הצורך.
- שמור את התמונה מיושרת שם קובץ חדש.
- לנתח תכונות morphometric של הדגימה באמצעות תוכנת הדמיית 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיווחנו תמונות HREM באיכות גבוהה של עוברי עכברים בין E9.5 ואת E13.5 8. איכות תמונה של העוברי מאוחר מבוים, לעומת זאת, נפגעת משמעותית בשל החדירה לרקמות המוגבלת של eosin צבע פלואורסצנטי. כדי להגביר את היעילות המכתימה, בדקנו מספר שיטות טיפול מקדימות תואמות הדמית ניאון 11. באופן ספציפי, עוברי עכברים E15.5 טופלו או Sca / e A2 12 או כל הגוף מעוקב 13. גם בדקנו את הנוסחה פשוטה, פתרון סליקה (4 אוריאה M, 10% גליצרול סולפט dodecyl נתרן 4%). כל שיטות טיפול מקדים התייעלות מכתימה. עוברים נעשה שקוף לאחר שבוע 1 של טיפול עם פתרון סליקה. אין נזק לרקמות ברור זוהה לאחר הטיפול. עובר pretreated עובדו באמצעות צעדים כולל התייבשות, מכתים וחדיר בטרם embeddeד בתקשורת הטבעת פלסטיק. תמונות HREM נרכשו מן הדגימה מוטבע כמתואר לעיל בסעיף 3 (הרכישה תמונה) ומוצגים באמצעות תוכנת הדמיית 3D. דוגמא מבט משטח הר השלם של עובר E15.5 הפגינה תכונות מורפולוגיות מפורטות של העור כוללים רפידות שפם וזקיקי שיער מתפתחים (איור 1). ההחלטה של בתצוגת המדורים הווירטואלית הייתה דומה לסעיף היסטולוגית (איור 2).
איור 1:. צפה משטח 3D של עובר E15.5 הוא מציג את תכונות מורפולוגיות המפורטות של העור. זקיקי השיער מתפתחים (הנקודות לבן קטנות) ניכרים, הוכחה ברזולוציה גבוהה של התמונה. אנא לחצו כאן כדי להציג גדול version של נתון זה.
איור 2:. The View הסעיף הווירטואלי של קו אמצע סעיף של עובר E15.5 את המבנים הפנימיים, כולל לב, כבד, המעיים ושלפוחית השתן הם נראים בבירור. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונה באמצעות ציוד מעבדה שיגרתי לרכוש תמונות HREM סדרתי תואמות להדמית 3D מהירה וניתוח morphometric של מבנים מורכבים. מכיוון התמונות ברזולוציה הגבוהה נלקחות ישירות מעל פני הבלוק במקום חלקים בודדים, תכונות מורפולוגיות בסדר נשמרות ושחזרו במהירות דיגיטלית בתכנית הדמיית 3D.
3D הדמיה מציעה יתרונות משמעותיים ביטוי חזותי והבנה תכונות מורפולוגיות מורכבות. רוב טכנולוגיות הדמיה 3D תלויים ציוד מיוחד 1-4. לעומת זאת, EFIC והדמיה HREM רק לנצל ציוד מעבדה סטנדרטי כולל סטראו מצויד במצלמה דיגיטלית וכן 14 microtome. צימוד תפקודי בין מיקרוסקופ microtome מאפשר אוטומציה של רכישת תמונה מאפשרת אוטומציה של תהליך רכישת תמונה כולה. עם זאת, הראינו כיצימוד תפקודי אין חובה 8. במקום זאת, אנו פשוט לעלות על סטראו אופקית כך שהוא פונה ישירות אל מול בלוק של microtome סטנדרטי תנוחת המנוחה להפסיק. המגבלה העיקרית של התקנה פשוטה זו היא שתמונות HREM צריכות להילקח באופן ידני. אנו מעריכים כי זה לוקח בערך 5 שניות לכל תמונה בממוצע. מגבלה נוספת היא כי תמונה בודדת עשויה להשתנות ממקום אחד למשנו אבל זה לא בעיה, כי הם העמידו בקלות במהלך שחזור 3D.
באמצעות טכנולוגית HREM, נתחנו סדרה של תמונות 3D של עוברי עכברים מן E9.5 כדי E13.5, וחשוף מנגנון חדשני שבאמצעותו הביב העוברי הבודד הופך שני מבנים נפרדים, מערכת עיכול דיסטלי ואת השתן התחתון שטחי 8. איכות תמונות HREM של מנוח מבוים עובר מוגבלת בשל חדירה יעילה של eosin (מידע לא מוצג). כדי להגדיל רקמות penetration של עוברים E15.5 ו E18.5, השתמשנו בשתי שיטות טיפול מקדים שונים התואמות הדמיה ניאון 11 ונבדק נוסחה חדשה, פתרון סליקה (4 אוריאה M, 10% גליצרול ו -4% SDS). כל השיטות האלה הראו שיפור משמעותי של חדירה לרקמות והכתים eosin. שיקול חשוב לפני ואחרי המקדים הוא כי הדגימה הוא נוטה עור נפיחות או מתכווץ בשל לחץ האוסמוטי. כדי להגביל את השינוי הפתאומי של לחץ האוסמוטי ובכך להפחית עיוות רקמות, אנו ממליצים חליפין הדרגתיים של הפתרון. בנוסף, מצאנו כי הכללת אתנול עוזרת באופן משמעותי (הצעד 1.5.4). במהלך חדירה וצעדי הטבעה, חשוב לשמור את הדגימה מן האור ב 4 ג.
באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה משתמש בציוד מעבדה שיגרתי לרכוש תמונות HREM, אשר תואמים להדמית 3D ברזולוציה גבוהה וניתוח morphometric. שו הפרוטוקולLD להתאים בקלות בכל סביבת מעבדה סטנדרטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
