Protocol
모든 동물의 사용은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.
1. 샘플 준비
- 시간 제한 짝짓기
- 같은 케이지에서 함께 C57BL6 야생 형 남성과 여성을 배치합니다.
- 상대 플러그의 형성 초기에 다음날 아침에 확인합니다. 결합 플러그 (일명, 질 또는 교미 플러그) 차단 질을 강화 된 젤라틴 증착이다.
- 배아 일 0.5 (E0.5)와 같은 플러그 날짜를 설정합니다.
- 마우스 배아의 분리
- CO 2 질식에 의해 임신 한 여성을 안락사.
- 흡수 패드 부정사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이.
- 피부를 들어 올려 수술 가위를 사용하여 꼬리 복부에서 초기 5mm 절개를합니다. 잘라 완전히 내부 장기를 노출 복부 피부를 제거
- 버지니아 근처 잘라GINA는 전체 자궁을 제거합니다.
- 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 잘라. 각 세그먼트 또는 수태 안에 하나의 배아를해야한다.
- 1 배 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)에서 자궁 세그먼트를 유지합니다.
- 배아 해부
- 입체경 아래에 얼음처럼 차가운 PBS와 별도의 접시에 각각의 수태를 놓습니다.
- 순차적으로 미세 해부 집게를 사용하여 자궁 조직, 태반 후 태아의 세포막을 제거합니다.
- 1 배 얼음 차가운 PBS 큰 전송 피펫을 사용하여 함께 50 ML 튜브에 해부 배아를 전송합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해 집게와 직접 배를 따기 마십시오.
- 정착
- 정착액의 10 샘플 볼륨보다 24 시간 동안 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린 용액의 해부 배아를 수정합니다.
- 전처리
- 어음 솔루션을 준비 : 4M 우레아, 증류수 10 % 글리세롤 4 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS).
- 어음 솔루션과 정착액을 교체합니다.
- 이주 - 조심스럽게 1 시간 동안 실온에서 로커에 시료를 회전한다. 두 번째와 세 번째 날에 한 번 클리어 솔루션을 교환한다. 시편 천천히 명확하고 반투명하게된다.
- 10 % 포르말린으로 지우기 솔루션을 교체하고 2 일 동안 로커에 둡니다.
- 탈수
- 5 분마다 1X PBS로 3 회 전처리 샘플을 씻으십시오.
- 부드러운 로커에 실온에서 상승 에탄올 시리즈 샘플 탈수. E15.5 태아를 들어, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 및 100 % 에탄올, 2 시간의 각 단계를 포함하는 상승 에탄올 시리즈를 사용한다. 이전 배아, 배양 시간을 증가시킬 필요가있다.
- 더럽히는 것
- 에오신 Y 품목 소금과 0.02 0.1375 g을 추가 염색 용액을 제조아 크리 딘 오렌지 헤미 (아연 클로라이드) 100 % 에탄올 50ml로 소금 75g. 2 시간 동안 교반한다. 필터 종이 필터. 실온에서 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
- 1 시간 동안 염색 용액에 시료를 전송합니다.
- 신선한 염색 솔루션 및 얼룩 하룻밤로 교체하십시오.
- 침투
- 침투 솔루션을 준비 : JB-4 삽입 키트의 해결 방법 100 ㎖, 촉매 C 1.25 g, 에오신 Y 품목 소금의 0.275 g 및 아 크리 딘 오렌지 헤미 (염화 아연) 염 0.055 g을 결합한다. 2 시간 동안 얼음 버킷 (200 RPM) 혼합 교반 한 후 여과지로 걸러.
- 4 ° C에서 침투 솔루션을 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
- (1 : 1) 염색 솔루션 : 솔루션을 침투하기 위해 배아를 전송, 4 ° C에서 로커에 적어도 3 시간 동안 배양한다.
- 솔루션을 침투하기 위해 배아 전송하고 3 시간 동안 배양추운 방에 로커에 대한 연구.
- 한 번 매일 침투 솔루션을 대체, 3 일 이상 부드러운 로커에 추운 방에 둡니다.
2. 퍼가기
- 얼음에 해결 B 및 침투 솔루션을 유지합니다.
- 바로 삽입하기 전에 (용액 B 및 침투 솔루션 1:25) 임베딩 솔루션을합니다.
- 포함 금형 동양 시편은, 부드럽게 삽입 금형에 차가운 임베딩 솔루션을 붓는다. 다시 방향 필요한 경우 핀.
- 퍼가기 솔루션이 응고되어 있는지 여부를 조사하기 위해 핀을 사용합니다. 시편 블록을 밀어하고, 필요한 경우 트림.
- 교차 방향을 얻기 위하여 별도의 금형을 사용하여 시험편 블록의 방향.
- 매립 금형의 상단에 블록 홀더를 넣습니다. 금형 및 블록 홀더 솔루션을 포함하기로 침수 될 때까지 조심스럽게 금형에 임베딩 솔루션을 붓는다.
- 보조 용기에 시료를 유지하고 맡겨흄 후드에서 4 시간 - 3 얼음.
- 4 °의 C에서 응고 표본을 저장합니다.
- 매입 형을 벗겨. 블록의 시험편의 위치를 검사하도록 경사 조명하여 실체 현미경 블록을 넣는다. 시편 주변 블록의 얼굴에, 마크 그리드 선.
- 참조로 표시된 눈금 선을 이용하여 물질을 매립 접근 양을 제거 할 수있는 블록을 낸다.
3. 이미지 인식
- 마이크로톰에 시편 블록을 고정하고 신선한 잘라 표면을 구하십시오. 설정 섹션 두께 (예를 들어, e9.5-10.5, 1.5 μm의, e11.5-12.5, 2.0 μm의, e13.5-15.5, 2.5 μm의, E16.5-이전, 3 μm의). 마이크로톰의 홈 위치에서 시료 / 블록을 유지합니다.
- 수평 시편의 블록 표면에 직면 스테레오 줌 현미경을 탑재합니다.
- 컴퓨터와 현미경 켜고 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 시각화 및 블록면에 광학 초점이미징 소프트웨어의 '라이브 뷰'모드에서.
- 블록 얼굴이 뷰 파인더의 중심에 있도록 필요한 경우 현미경 마이크로톰을 맞 춥니 다.
- 전체 블록 얼굴이 뷰 파인더 안에 들어 오도록 줌을 조정합니다.
- 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 (여자 470 ± 20 nm의, 다이크로 익 495 nm의, 방출 525 ± 25 nm의)를 선택하고 필요한 경우 집중할.
- 수동 측정하고 노출 시간을 설정 (예를 들면, 80-400 미니 초).
- 각 신선한 잘라 후 블록 얼굴의 이미지를 획득하고 가능하면 자동으로 이미지를 저장합니다.
- 해상도, 단면 두께 및 줌을 포함하여 기록 중요한 매개 변수.
- 전체 표본, 수출을 마무리하고 필요한 경우 JPEG 형식으로 모든 이미지 파일을 변환 한 후.
- 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지를 반전하고, 밝기 및 대비를 조정합니다.
- 별도의 폴더에있는 모든 처리 된 이미지를 저장합니다.
4. 3D심상
- 지침에 따라 3 차원 시각화 소프트웨어에 대한 모든 처리 된 이미지를 업로드합니다.
- 입력 해상도와 부분 두께는 체적 데이터 (즉, 복셀 크기)의 모든 이미지를 변환 및 3D 파일을 저장합니다.
- 자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 맞 춥니 다. 필요한 경우 수동으로 개별 이미지를 조정합니다.
- 새 파일 이름으로 정렬 된 이미지를 저장합니다.
- 3 차원 시각화 소프트웨어를 사용하여 시험편의 형태 학적 특징을 분석한다.
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Representative Results
우리는 E9.5과 E13.5 8 사이의 마우스 배아의 높은 품질의 HREM 이미지를보고했다. 후반 개최 배아의 이미지 품질은, 그러나, 크게 때문에 형광 염료 에오신의 제한된 조직 침투의 손상. 염색 효율을 높이기 위해, 형광 영상 (11)에 호환되는 여러 전처리 방법을 시험 하였다. 특히, E15.5 마우스 배아는 무서 / 전자 A2 (12) 또는 전신 13 CUBIC 중 하나를 처리 하였다. 또한 단순화 화학식 상기 반제 용액 (4 M 우레아, 10 % 글리세롤 및 4 % 도데 실 황산나트륨)을 테스트했다. 모든 전처리 방법은 염색 효율을 증가했다. 배아는 지우기 솔루션 치료 1 주 이후 반투명되었다. 명백한 조직 손상은 치료 후 검출되지 않았다. 예비 처리 된 배아는 embedde되기 전에 탈수, 염색 및 침투를 포함하는 단계를 통해 처리 된플라스틱 매립 매체 (D). (3) (이미지 수집) 상술과 3 차원 시각화 소프트웨어를 사용하여 표시되는 HREM 이미지가 포함 된 시료로부터 획득 하였다. E15.5 배아의 전체 마운트 표면보기의 예는 수염 패드와 개발 모낭 (그림 1)을 포함하여 피부의 상세한 형태 학적 특징을 보여 주었다. 가상 단면 뷰의 해상도는 조직 학적 섹션 (그림 2)와 비교했다.
그림 1 :. E15.5 배아의 3 차원 표면보기는 피부의 상세한 형태 학적 특징을 보여줍니다. 개발 모낭 (작은 흰색 점) 이미지의 고해상도를 보여주는 분명하다. 더 큰이 적이 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rsion.
그림 2 :. E15.5 배아의 중간 선 섹션의 가상 단면 뷰는 심장, 간, 창자와 방광을 포함한 내부 구조는 명확하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서는 급격한 차원 시각화 및 복잡한 구조의 형태 학적 분석을 위해 호환되는 직렬 HREM 화상 취득 루틴 실험실 장비를 사용하여 변형 된 프로토콜을 제시한다. 고해상도 이미지 대신 개별 섹션의 블록 표면에서 직접 수행되기 때문에, 미세한 형태 적 특징은 유지하고 신속 차원 시각화 프로그램에서 디지털로 복원된다.
3D 영상을 시각화하고 복잡한 형태 적 특징을 이해하는데 상당한 장점을 제공한다. 대부분의 3D 영상 기술은 특수 장비 1-4에 따라 달라집니다. 반대로 EFIC 및 HREM 촬상는 디지털 카메라 및 마이크로톰 (14)를 구비 한 입체 현미경을 포함한 표준 실험실 장비를 이용한다. 현미경 마이크로톰 간의 기능적 결합 화상 취득의 자동화 전체 이미지 획득 프로세스의 자동화를 실현 가능하게한다. 그러나, 우리는 것을 보여 주었다기능 커플 링은 8 의무적이 아니다. 그것은 휴식 정지 위치에서 표준 마이크로톰의 블록 얼굴에 직접 향하도록하는 대신에, 우리는 단순히 수평 실체를 탑재합니다. 간단한 셋업의 주요 한계는 HREM 이미지를 수동으로 수행 할 필요가 있다는 것이다. 우리는이 평균적으로 이미지 당 약 5 초 걸리는 것으로 추정하고있다. 또 다른 제한은 개별 이미지를 한 위치에서 다른 위치로 이동할 수 있지만 쉽게 3D 재구성 중에 재편성되어 있기 때문에이 문제가되지 않는 것입니다.
HREM 기술을 사용하여, 우리는 E13.5로 E9.5로부터 마우스 배아 차원 이미지의 시리즈를 분석하고, 단독 배아 배설강 두 개의 별도의 구조로 변환하는 신규 메카니즘 원위 소화 기관과 하부 요로를 밝혀냈다 책자 8. 말의 HREM 이미지의 품질 배아 인해 에오신의 비효율적 인 침투에 제한 개최 (데이터는 도시하지 않음). 조직 penetr을 늘리려면E15.5 및 E18.5 배아 ATION, 우리는 형광 영상 (11)에 호환되는 서로 다른 전처리 방법을 사용하여 새로운 수식 상기 반제 용액 (4 M 우레아, 10 % 글리세롤, 4 % SDS)을 테스트했다. 이들 방법은 모두 조직 침투 에오신 염색의 상당한 개선을 보여준다. 전처리 전후 중요한 고려 시험편 인해 삼투압으로 팽창 또는 수축 피부하는 경향이 있다는 것이다. 삼투압의 급격한 변화를 제한함으로써, 우리는 솔루션의 점진적 교환을 권장, 조직의 변형을 줄일 수 있습니다. 또한, 에탄올을 포함 크게 도움이 (단계 1.5.4)를 발견했다. 침투 및 삽입 단계 동안, 빛으로부터 표본을 유지하고 4 ℃에서하는 것이 중요하다.
총체적으로,이 프로토콜은 고해상도 3D 가시화 및 형태 계측 학적 분석 호환 HREM 이미지를 획득하는 루틴 실험실 장비를 사용한다. 프로토콜 수오쉽게 표준 실험실 환경에서 적용 할 수 신분증.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
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- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
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