Protocol
Tüm hayvan kullandığı Boston Çocuk Hastanesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Numune Hazırlama
- Zamanlı çiftleşme
- Aynı kafeste birlikte C57BL6 vahşi tip erkek ve bir dişi koyun.
- Bir çiftleşme fiş oluşumu sonraki sabah erken olup olmadığını kontrol edin. Çiftleşme fişi (aka vajinal veya çiftleşme fişi) bloke vajina sertleştirilmiş jelatinli birikmesidir.
- embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak fiş tarihini ayarlayın.
- Fare embriyolarının izolasyonu
- CO 2 boğulma hamile kadın öldürülür.
- emici ped sırtüstü fareler koyun ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün.
- Cildi kaldırın ve cerrahi makas kullanarak kaudal karın bölgesinde bir ilk 5 mm kesi yapmak. Kes ve tam iç organları maruz karın cilt kaldırmak
- va yakın Cutgina tüm rahim kaldırmak için.
- uterin horn boyunca implantasyon siteleri arasında kesin. Her segment veya konseptus içinde sadece tek bir embriyo olmalıdır.
- 1x buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde uterus segmentleri tutun.
- embriyo diseksiyonu
- Stereoskop altında buz soğukluğunda PBS ile ayrı bir kapta, her bir konseptus yerleştirin.
- sırayla ince diseksiyon forseps kullanarak rahim dokuları, plasenta ve sonra fetal membranlar çıkarın.
- 1x soğuk PBS büyük transfer pipeti kullanılarak 50 ml'lik bir tüpe parçalara embriyo transferi. doku hasarı en aza indirmek için forseps ile doğrudan embriyo toplayıp kaçının.
- tespit
- fiksatif en az 10 numunelerle fazla 24 saat boyunca 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisinde kesildi embriyolar düzeltildi.
- Tedavi öncesi
- Takas Çözüm hazırlayın: 4M üre, çift damıtılmış su içinde% 10 gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS).
- Takas Çözümü ile fiksatif değiştirin.
- 2 hafta - yavaşça 1 oda sıcaklığında bir rocker örnek döndürün. İkinci ve üçüncü gününde bir kez Takas Çözüm alışverişi. Numune yavaş yavaş açık ve saydam hale gelir.
- % 10 formalin ile Takas değiştirin Çözüm ve 2 gün boyunca bir rocker bırakın.
- kurutma
- Her biri 5 dakika için 1 x 3 defa PBS ile muamele edilmiş numune yıkanır.
- yumuşak bir rocker oda sıcaklığında artan etanol seri örnekleri kurutmak. E15.5 embriyo için,% 50,% 60,% 70,% 80,% 85,% 90,% 95 ve% 100 etanol, 2 saat her bir aşama dahil olmak üzere yükselen etanol serisi kullanır. büyük embriyolar için inkübasyon süresi arttırılması gerekir.
- boyanma
- Eosin Y Disodyum Tuz ve 0.02 0,1375 gram ekleyin: Boyama Çözüm hazırlayınAkridin Portakal Hemi (çinko klorür)% 100 etanol içinde 50 ml tuz 75 gram. 2 saat boyunca karıştırın. Bir filtre kağıdı ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
- 1 saat Boyama Çözüm örnek aktarın.
- Taze Boyama Çözüm ve leke gecede ile değiştirin.
- Süzülme
- Sızma çözeltisi hazırlayın: JB-4 gömme kiti çözeltisi bir 100 ml, C Katalizörünün 1.25 g, Eosin Y disodyum tuzunun 0.275 g ve Akridin Portakal Hemi (çinko klorür) tuzunun 0.055 g 'ını. 2 saat boyunca, bir buz kova içinde (200 rpm) karışımı karıştırılmış ve bundan sonra filtre kağıdı ile süzülür.
- 4 ° C'de Sızma Çözüm saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
- (1: 1) Boyama Çözüm: Çözüm infiltrasyon embriyo transferine ve 4 ° C'de bir rocker en az 3 saat süreyle inkübe.
- Çözüm infiltrasyonuna embriyo transferi ve 3 saat süre ile inkübeSoğuk bir odada bir rocker r.
- bir zamanlar her gün Sızma değiştirin Çözüm ve üç gün daha nazik bir rocker soğuk bir odada bırakın.
2. gömülmesi
- buz üzerinde Çözüm B ve Sızma Çözüm tutun.
- hemen gömmeden önce (Çözüm Yatak ve Sızma Çözüm 1:25) gömülmesi Çözüm olun.
- Bir gömme kalıp Orient örnek, daha sonra yavaşça gömme kalıp içine soğuk katıştırma Çözüm dökün. Yeniden yönlendirmek gerekirse bir iğne ile.
- Gömme Çözüm katılaşmış olup olmadığını incelemek için bir iğne kullanın. Numune bloğu dışarı itmek, ve gerekirse düzeltin.
- çapraz yönlendirme elde etmek için ayrı kalıp kullanılarak örnek blok yönünü değiştirin.
- gömme kalıp üstünde bir blok tutucu koyun. Kalıp ve blok tutucu Çözüm gömülmesi ile batık kadar yavaşça kalıp içine gömülmesi Çözüm dökün.
- ikincil kapta numune tutun ve bırakınBir çeker ocak içinde 4 saat - 3 boyunca buz üzerinde.
- 4 ° C'de katılaştırıldı örnekleri saklayın.
- gömme kalıp uzak soyun. bloğundaki numunenin konumunu incelemek için eğik aydınlatma ile stereomicroscope altında blok koyun. numune etrafında blok yüzünde işaretleyiniz ızgara çizgileri.
- referans olarak işaretlenmiş kılavuz çizgileri kullanarak gömülü malzemenin erişim miktarını kaldırmak için blok Trim.
3. Görüntü Alma
- mikrotom numune bloğu Kelepçe ve taze kesilmiş bir yüzey elde. Set kesit kalınlığı (örneğin, e9.5-10.5, 1.5 um; e11.5-12.5, 2.0 um; e13.5-15.5, 2.5 mikron; e16.5-yaşlı, 3 um). microtome ev pozisyonunda numune / blok tutun.
- yatay numunenin blok yüzeyine bakan stereo zoom mikroskop monte edin.
- Bilgisayar ve mikroskop açın ve görüntü elde etme yazılımı başlatmak.
- Görselleştirmek ve blok yüze optik odakgörüntüleme yazılımı "canlı görüntü" modunda.
- Blok-yüz vizörün merkezde olacak şekilde gerekirse mikroskop ve mikrotom hizalayın.
- Tüm blok yüz vizör içinde olacak şekilde zoom ayarlayın.
- Yeşil floresan proteini (GFP) filtre (uyarma 470 ± 20 nm, dikroik 495 nm, emisyon 525 ± 25 nm) seçin ve gerekirse tekrar odaklayın.
- Tedbir ve manuel pozlama süresi ayarlayın (örneğin, 80-400 küçük sn).
- Her taze kesilmiş sonra blok-yüz görüntüleri elde etmek ve mümkünse otomatik olarak görüntüleri kaydetmek.
- çözünürlük, kesit kalınlığı ve zoom dahil Tutanak önemli parametreler.
- Tüm örnek, ihracat terbiye ve gerekirse JPEG formatına tüm resim dosyalarını dönüştürdükten sonra.
- Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak tüm orijinal görüntüleri haricindekileri ve parlaklık ve kontrastı ayarlayın.
- Ayrı bir klasördeki tüm işlenmiş görüntüler kaydedin.
4. 3Dgörüntüleme
- talimatları izleyerek bir 3B görselleştirme yazılımı tüm işlenmiş görüntüleri yükleyin.
- Giriş hassasiyeti ve kesit kalınlığı hacimsel veri (yani voksel boyutu) tüm görüntüleri dönüştürmek ve 3B dosyayı kaydedin.
- Otomatik modu kullanarak tüm görüntüleri hizalayın. Gerekirse elle tek tek görüntüleri ayarlayın.
- yeni bir dosya adı hizalanmış görüntü kaydetme.
- 3D görselleştirme yazılımı kullanarak numunenin morfometrik özelliklerini analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz E9.5 ve E13.5 8 arasında fare embriyoları yüksek kaliteli HREM görüntüler bildirdi. Geç sahnelenen embriyoların Görüntü kalitesi, ancak, önemli ölçüde, çünkü floresan boya eozin sınırlı doku penetrasyonu tehlikeye düşer. Boyama verimini artırmak için, biz floresan görüntüleme 11 uyumlu birkaç ön yöntemleri test ettik. Özel olarak, E15.5 fare embriyo Sca / e A2 12 veya tüm vücut 13 KÜP ile tedavi edildi. Ayrıca aşağıdaki basitleştirilmiş formüle Clearing çözeltisi (4 M üre,% 10 gliserol ve% 4 sodyum dodesil sülfat) test edilmiştir. Tüm ön yöntemleri boyama etkinliğini artırdı. Embriyolar Takas Çözümü ile tedavi 1 hafta sonra saydam hale geldi. Hiçbir belirgin doku hasarı tedavi sonrasında tespit edildi. ön işleme tabi embriyolar embedde olmadan önce dehidratasyon, boyama ve infiltrasyon dahil adımlarda işlendiplastik gömme medyada, d. bölüm 3 (Image Acquisition) yukarıda tarif ve bir 3B görselleştirme yazılımı kullanarak görüntülenen HREM görüntüleri gömülü örnekten elde edilmiştir. E15.5 embriyo tüm montaj yüzeyi görüntüsü bir örnek bıyıkları yastıkları ve gelişmekte olan saç köklerinin (Şekil 1) de dahil olmak üzere deri detaylı morfolojik özellikleri gösterdi. Sanal bölüm görünümünün Çözünürlük histolojik bölüm (Şekil 2) karşılaştırılabilir.
Şekil 1:. E15.5 Embriyo 3D Yüzey Görünümü Cildin detaylı morfolojik özelliklerini göstermektedir. Gelişmekte olan saç folikülleri (küçük beyaz noktalar) Görüntünün yüksek çözünürlüklü gösteren belirgindir. Daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rsion.
Şekil 2:. E15.5 Embriyo ve Orta Hat Bölüm Sanal Kesit Görünümü kalp, karaciğer, bağırsak ve mesane gibi iç yapıları, açıkça görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, hızlı 3 boyutlu görselleştirme ve karmaşık yapıların morfometrik analizi için uyumlu seri HREM görüntüleri elde etmek için rutin laboratuvar ekipmanı kullanılarak modifiye edilmiş bir protokol mevcut. yüksek çözünürlüklü görüntüler yerine bireysel bölümlerin blok yüzüne doğrudan alınır, çünkü ince morfolojik özellikleri korunmuş ve hızla bir 3B görselleştirme programında dijital olarak yeniden yapılandırılmaktadır.
3D görüntü görselleştirmek ve karmaşık morfolojik özellikleri anlaşılmasında önemli avantajlar sunmaktadır. Çoğu 3D görüntüleme teknolojileri özel ekipman 1-4 bağlıdır. Buna karşılık, EFIC ve HREM görüntüleme sadece bir dijital kamera ve bir mikrotom 14 ile donatılmış bir stereomikroskop dahil standart laboratuar ekipmanları kullanmaktadır. mikroskop ve mikrotom arasındaki fonksiyonel bağlantı görüntü elde otomasyon tüm görüntü elde etme sürecinin otomasyonunu sağlayan sağlar. Bununla birlikte, göstermiştirfonksiyonel bağlantı 8 zorunlu değildir. bu dinlenme durma konumunda bir standart microtome blok yüzüne direkt olarak karşı karşıya Bunun yerine, biz sadece yatay Stereomikroskopta monte edin. bu basit kurulum önemli bir sınırlama HREM görüntüleri elle alınması gerekir olmasıdır. Biz ortalama görüntü başına yaklaşık 5 saniye sürer tahmin var. Başka bir sınırlama bireysel görüntü başka bir konumdan kayabilir ama onlar kolayca 3D rekonstrüksiyon sırasında realigned çünkü bu bir sorun değildir olmasıdır.
HREM teknolojiyi kullanarak, biz E13.5 için E9.5 fare embriyo 3D görüntüleri bir dizi analiz ve yalnız embriyonik lağım iki ayrı yapılara dönüşür hangi yeni bir mekanizma, uzak sindirim sistemi ve alt üriner sistem ortaya çıkarmıştır yolları 8. geç HREM görüntü kalitesi Embriyolar, eozin verimsiz nüfuz sınırlıdır aşamalı (veriler gösterilmemiştir). Doku PENETR arttırmakE15.5 ve E18.5 embriyoların ation, floresan görüntüleme 11 uyumlu olan iki ön-muamele yöntemleri kullanılabilir ve yeni bir formül Temizleme çözeltisi (4 M üre,% 10 gliserol ve% 4 SDS) test edilmiştir. Tüm bu yöntemler, doku penetrasyonu ve eozin boyama önemli bir iyileşme göstermiştir. ön öncesi ve sonrası önemli bir husus örnek nedeniyle ozmotik basınç şişme veya büzülme cilde eğilimli olmasıdır. ozmotik basıncın ani bir değişiklik sınırlamak için böylece biz çözümün kademeli değişimi tavsiye doku deformasyonu azaltmak. Buna ek olarak, etanolün eklenmesi önemli ölçüde yardımcı olur (adım 1.5.4) Bulunan. infiltrasyonu ve gömme adımları sırasında, ışıktan numune tutmak ve 4 ° C'de önemlidir.
Topluca, bu protokol yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görselleştirme ve morfometrik analizi için uyumlu HREM görüntüleri elde etmek için rutin laboratuar ekipmanları kullanmaktadır. protokol shoukolayca herhangi bir standart laboratuvar ortamında uyarlanabilir ld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
- Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
- Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
- Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
- Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).
