Protocol
Toutes les utilisations des animaux sont approuvés par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels à l'Hôpital pour enfants de Boston.
Préparation 1. Echantillon
- accouplement Timed
- Placez un C57BL6 type sauvage mâle et une femelle dans la même cage.
- Vérifiez la formation d'un bouchon d'accouplement tôt le lendemain matin. La fiche d'accouplement (aka, vaginale ou la prise de copulation) est un dépôt gélatineux durci qui bloque le vagin.
- Réglez la date de prise de jour embryonnaire 0,5 (E0.5).
- L' isolement d'embryons de souris
- Euthanasier femmes enceintes par le CO 2 asphyxie.
- Mettez la souris sur le dos sur un tampon absorbant et pulvériser région abdominale avec 70% d'éthanol.
- Soulevez la peau et faire une incision de 5 mm initiale à la région abdominale caudale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Couper et enlever la peau abdominale pour exposer pleinement les organes internes
- Couper près vagina pour enlever tout l'utérus.
- Couper entre les sites d'implantation le long de la corne utérine. Chaque segment ou conceptus devraient avoir un seul embryon à l'intérieur.
- Gardez les segments de l'utérus en 1x phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS).
- Embryo dissection
- Placez chaque conceptus dans un plat séparé avec PBS glacé sous un stéréoscope.
- Retirer les tissus utérins, le placenta et puis membranes fœtales utilisant séquentiellement fines pinces à dissection.
- Transférer l'embryon disséqué dans un tube de 50 ml avec 1 x PBS glacé en utilisant une grande pipette de transfert. Évitez ramasser embryon directement avec une pince pour minimiser les lésions tissulaires.
- Fixation
- Fixer les embryons disséqués dans 10% neutre solution formaline tamponnée à 4 ° C pendant plus de 24 heures avec au moins 10 volumes de fixateur de l'échantillon.
- Prétraitement
- Préparer la solution de compensation: 4M d'urée, 10% de glycerol, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l'eau bidistillée.
- Remplacer le fixateur avec la solution de compensation.
- Tournez doucement l'échantillon sur une bascule à la température ambiante pendant 1 - 2 semaines. Remplacez la solution de compensation une fois sur le deuxième et le troisième jour. L'échantillon devient lentement clair et translucide.
- Remplacer la solution d'échange avec 10% de formaline et de laisser sur une bascule pendant 2 jours.
- déshydration
- Laver les échantillons prétraités avec 1 x PBS 3 fois pendant 5 min à chaque fois.
- Déshydrater les échantillons dans une série d'éthanol ascendant à la température ambiante sur une bascule douce. Pour les embryons E15.5, utiliser une série ascendante d'éthanol comprenant 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% d'éthanol, 2 h chaque étape. Pour les embryons plus âgés, le temps d'incubation doit être augmentée.
- tachant
- Préparer Coloration Solution: ajoutez 0,1375 grammes de Eosine Y sel disodique et 0,0275 grammes d'acridine orange hémi (chlorure de zinc), le sel de 50 ml d'éthanol à 100%. Agiter pendant 2 heures. Filtrer avec un filtre en papier. Stocker à température ambiante et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
- Transférer l'échantillon de la solution de coloration pendant 1 heure.
- Remplacer avec la solution de coloration fraîche et tache pendant la nuit.
- Infiltration
- Préparer Infiltration Solution: combiner 100 ml de solution A de JB-4 kit d'encastrement, 1,25 g de catalyseur C, 0,275 g de Eosine Y disodique Sel et 0,055 g de Acridine orange hémi (chlorure de zinc) de sel. Bien mélanger (200 rpm) dans un seau à glace pendant 2 heures, puis filtrer avec le papier filtre.
- Conservez la solution de Infiltration à 4 ° C et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
- Transférer les embryons Infiltration Solution: Solution de coloration (1: 1), et incuber pendant au moins 3 heures sur une bascule à 4 ° C.
- Transférer les embryons à l'infiltration Solution et incuber pendant 3 hr sur une bascule dans une chambre froide.
- Remplacez Infiltration Solution une fois par jour, et laisser dans une chambre froide sur une bascule douce pendant trois jours.
2. Embedding
- Gardez Solution B et Infiltration Solution sur la glace.
- Faire Embedding Solution (1:25 de la solution B et Infiltration Solution) immédiatement avant l'intégration.
- Orient l'échantillon dans un moule enrobage, puis verser la solution d'enrobage à froid dans le moule intégration en douceur. Réorienter avec une épingle si nécessaire.
- Utilisez une épingle d'examiner si la solution Embedding est solidifié. Poussez le bloc d'échantillons, et les garnitures si nécessaire.
- Réorienter le bloc d'échantillons à l'aide du moule séparé pour obtenir une orientation transversale.
- Mettre un porte-bloc sur le dessus du moule enrobage. Verser délicatement Embedding Solution dans le moule jusqu'à ce que le moule et le support de bloc sont submergés par incorporation Solution.
- Gardez l'échantillon dans un récipient secondaire et laissersur la glace pendant 3 - 4 heures dans une hotte.
- Conserver les échantillons solidifiés dans un 4 ° C.
- Décollez le moule enrobage. Mettez le bloc sous le stéréomicroscope avec éclairage oblique pour inspecter la position de l'échantillon dans le bloc. Sur la face du bloc, marque quadrillage autour de l'échantillon.
- Coupez le bloc pour retirer le montant de l'accès du matériau d'enrobage en utilisant les lignes de quadrillage marquées comme références.
3. Image Acquisition
- Fixer le bloc de spécimen à l'microtome et obtenir une surface fraîchement coupée. Épaisseur de la section Set (par exemple, e9.5-10.5, 1,5 pm; e11.5-12.5, 2,0 um; e13.5-15.5, 2,5 um; E16,5-âgés, 3 pm). Gardez l'échantillon / bloc à la position de la maison de microtome.
- Monter le microscope zoom stéréo face horizontalement la surface du bloc de l'échantillon.
- Allumez l'ordinateur et d'un microscope, et démarrer le logiciel d'acquisition d'image.
- Visualiser et concentrer l'optique au bloc-facesous le mode "live view" du logiciel d'imagerie.
- Alignez microscope et microtome si nécessaire pour que le bloc-face est au centre du viseur.
- Ajuster le zoom de telle sorte que l'ensemble du bloc-face est dans le viseur.
- Sélectionnez la protéine fluorescente verte (GFP) filtre (excitation 470 ± 20 nm, dichroïque 495 nm, émission 525 ± 25 nm) et de recentrer si nécessaire.
- Mesurer et régler le temps d'exposition manuellement (par exemple, 80-400 mini - sec).
- Acquérir les images du bloc-face après chaque coupe fraîche et enregistrer automatiquement les images si possible.
- Enregistrez des paramètres importants, y compris la résolution, l'épaisseur de coupe et le zoom.
- Après avoir terminé l'échantillon entier, l'exportation et convertir tous les fichiers d'image au format JPEG si nécessaire.
- Inversez toutes les images originales en utilisant un logiciel de traitement d'image, et d'ajuster la luminosité et le contraste.
- Enregistrer toutes les images traitées dans un dossier séparé.
4. 3DVisualisation
- Téléchargez toutes les images traitées à un logiciel de visualisation 3D en suivant les instructions.
- Résolution d'entrée et de l'épaisseur de coupe pour convertir toutes les images à des données volumétriques (taille de voxel) et enregistrez le fichier 3D.
- Aligner toutes les images en utilisant le mode automatique. Régler les images individuelles manuellement si nécessaire.
- Enregistrez l'image aligné à un nouveau nom de fichier.
- Analyser les caractéristiques morphométriques de l'échantillon à l'aide du logiciel de visualisation 3D.
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Representative Results
Nous avons rapporté des images de MEHR de haute qualité d'embryons de souris entre E9.5 et E13.5 8. qualité des embryons en retard par étapes de l'image, cependant, est considérablement compromise en raison de la pénétration tissulaire limitée de l'éosine de colorant fluorescent. Pour augmenter l'efficacité de coloration, nous avons testé plusieurs méthodes de prétraitement qui sont compatibles avec l' imagerie de fluorescence 11. Plus précisément, les embryons de souris E15.5 ont été traités avec soit Sca / e A2 12 ou Whole-Body CUBIC 13. Nous avons également testé la formule simplifiée, la solution d'échange (4 M d'urée, 10% de glycerol et 4% de dodécylsulfate de sodium). Toutes les méthodes de prétraitement ont augmenté l'efficacité de coloration. Embryons est devenu translucide après 1 semaine de traitement avec la solution de compensation. Aucun dommage tissulaire évidente n'a été détectée après le traitement. Les embryons prétraités ont été traitées par étapes, notamment la déshydratation, la coloration et l'infiltration avant d'être embedded dans les médias en plastique d'enrobage. images MEHR ont été acquises à partir du spécimen embarqués comme décrit ci-dessus dans la section 3 (Image Acquisition) et affiché à l'aide d'un logiciel de visualisation 3D. Un exemple de vue l' ensemble de la surface de montage de E15.5 embryon a démontré des caractéristiques morphologiques détaillées de la peau , y compris plaquettes de moustaches et de développement des follicules pileux (figure 1). Résolution de la vue en coupe virtuelle était comparable à coupe histologique (figure 2).
Figure 1:. Surface 3D Vue de la Embryo E15.5 Il présente les caractéristiques morphologiques détaillées de la peau. Les follicules pileux en développement (petits points blancs) sont visibles, ce qui démontre à haute résolution de l'image. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 2:. Le Salon Virtuel Section Vue de la section Midline de l'Embryo E15.5 Les structures internes, y compris le cœur, le foie, les intestins et la vessie sont clairement visibles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous présentons un protocole modifié à l'aide du matériel de laboratoire de routine pour acquérir des images de MEHR série qui sont compatibles pour la visualisation 3D rapide et l'analyse morphométrique de structures complexes. Parce que les images à haute résolution sont prises directement à partir de la face du bloc au lieu des sections individuelles, les caractéristiques morphologiques fines sont préservés et reconstruits rapidement numériquement dans un programme de visualisation 3D.
L'imagerie 3D offre des avantages significatifs dans la visualisation et la compréhension des caractéristiques morphologiques complexes. La plupart des technologies d'imagerie 3D dépendent de l' équipement spécialisé 1-4. En revanche, l' EFIC et l' imagerie HREM utilisent uniquement du matériel de laboratoire standard , y compris un stéréomicroscope équipé d'une caméra numérique et un microtome 14. couplage fonctionnel entre microscope et microtome permet l'automatisation de l'acquisition d'image permet l'automatisation de l'ensemble du processus d'acquisition d'image. Cependant, nous avons montré quecouplage fonctionnel est pas obligatoire 8. Au lieu de cela, on monte simplement le stéréomicroscope horizontalement afin qu'il soit tourné directement à la face du bloc d'un microtome standard à la position d'arrêt au repos. La principale limite de cette configuration simple est que les images de MEHR doivent être prises manuellement. Nous avons estimé qu'il faut environ 5 secondes par image en moyenne. Une autre limitation est que l'image individuelle peut passer d'une position à l'autre, mais ce n'est pas un problème, car ils sont facilement réalignés lors de la reconstruction 3D.
En utilisant la technologie de HREM, nous avons analysé une série d'images 3D d'embryons de souris de E9.5 à E13.5, et découvert un nouveau mécanisme par lequel le cloaque embryonnaire solitaire se transforme en deux structures distinctes, le tube digestif distal et urinaire inférieur tracts 8. Qualité des images MEHR de fin met en scène des embryons est limitée en raison de la pénétration inefficace de l'éosine (données non présentées). Pour augmenter Penetr de tissuation de E15.5 et 'a 18,5 embryons, nous avons utilisé deux méthodes de prétraitement différents qui sont compatibles avec l' imagerie de fluorescence 11 et testé une nouvelle formule, la solution de compensation (4 M d' urée, 10% de glycérol et 4% de SDS). Toutes ces méthodes ont montré une amélioration significative de la pénétration dans les tissus et éosine. Une considération importante avant et après un traitement préalable est que l'échantillon est sujette à gonflement de la peau ou le rétrécissement dû à la pression osmotique. Pour limiter le brusque changement de pression osmotique réduire ainsi la déformation des tissus, nous recommandons l'échange progressif de la solution. En outre, nous avons trouvé que l'inclusion d'éthanol contribue de manière significative (étape 1.5.4). Au cours de l'infiltration et les étapes d'enrobage, il est important de garder l'échantillon de la lumière et à 4 ° C.
Collectivement, ce protocole utilise l'équipement de laboratoire de routine pour acquérir des images de MEHR, ce qui est compatible pour haute résolution visualisation 3D et d'analyse morphométrique. Le shou de protocoleld être facilement adaptée dans tous les milieux de laboratoire standard.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade |
| Formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Clearing Solution |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | Clearing Solution |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Invitrogen | 15525-017 | Clearing Solution |
| Eosin Y Disodium Salt | Fisher scientific | BP241925 | Infiltration Solution |
| Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt | Sigma | A6014 | Infiltration Solution |
| Whatman paper | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Embedding Kit - Solution A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Infiltration Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Solution B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Embedding Solution |
| JB-4 Embedding Kit - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Infiltration Solution |
| Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Molds | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipes | VWR | 414004-014 | |
| Petrl Dish | VWR | 25384-088 | Embryo dissection |
| Forceps Inox Tip | ROBOZ | RS-5015 | Embryo dissection |
| Graefe Tissue Forcep | ROBOZ | RS-5153 | Embryo dissection |
| Delicate Operating Scissor | ROBOZ | RS-6700 | Embryo dissection |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Polypropylene Conical Tubes | Falcon | 352098 | |
| Ice Bucket | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats | VWR | 89106-770 | |
| Sodium Chloride | MP Biomedicals | 102892 | PBS Solution |
| Potassium Chloride | Sigma | P0662 | PBS Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5405 | PBS Solution |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS Solution |
| Digital Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Illuminator | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Light Source | Leica | KL 1500 LCD | |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| Single Edge Dispenser | Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory | ||
| Rocking Platform Shakers | VWR | 40000-304 | |
| Standard Hot Plate Stirrer | VWR | 12365-382 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S |
References
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- Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
- Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
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